Biomedical Chemistry - Research and Methods (E-Journal)
Not a member yet
181 research outputs found
Sort by
Оптимизация технологии получения препарата бактерий человека для биологической коррекции микрофлоры кишечника
Get PDFFecal microbiota transplantation (FMT) is now considered as an effective tool for the treatment of various GI pathologies. Fecal preparations are delivered both through the lower GIT (enema, colonoscopy) and upper (endoscopy, capsules). A common disadvantage of instrumental methods of administration is their high invasiveness associated with the risk of intestinal perforation and the use of anesthesia. Oral capsules are minimally invasive, comfortable and more aesthetic, so this method of drug delivery is gaining popularity. The main issue with the use of frozen feces (including the lyophilisate used in capsules) is its efficiency compared to the original material. During lyophilization, cells are exposed to stress factors such as low temperatures, water crystallization, osmotic stress, changes in pH, and dehydration. To reduce the likelihood of cell damage during lyophilization, protective media (lyo-protectants) are used. In this work sucrose, gelatin, and their combinations have been used as lyoprotectors. To estimate the number of microorganisms, a bacteriological study was carried out. The number of Bifidobacteria, Lactobacilli, and the total number of E.coli and Enterobacteriaceae was estimated. It was found that the lyophilized stool sample containing 10% sucrose as a protective medium had the highest number of viable cells. Also, the physical properties of the lyophilisate (its flowability) are convenient for preparing capsulated form. The molar ratios of short chain fatty acids (SCFAs) in the original fecal samples and lyophilisates were studied by gas chromatography. The molar ratios of major SCFAs (acetate, propionate and butyrate) were identical in the samples studied. The composition of the protective medium in which the lyophilized biomaterial corresponds to the original feces in terms of the number of "live" microorganisms has been proposed. According to its physical characteristics lyophilisate is convenient for capsules preparation.К настоящему моменту эффективность трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ) при лечении различных патологий ЖКТ не вызывает сомнений. Препараты фекалий доставляют как через нижние отделы ЖКТ (клизма, колоноскопия), так и верхние (эндоскопия, капсулы). Общим недостатком инструментальных методов введения является их высокая инвазивность, связанная с риском перфорации кишечника и применением анестезии. Пероральные капсулы минимально инвазивны, удобны и более эстетичны, поэтому этот способ доставки препарата становится все более популярным. Основной вопрос, связанный с использованием замороженного кала (в том числе лиофилизата, используемого в капсулах), заключается в эффективности такого препарата по сравнению с исходным материалом. В процессе лиофилизации клетки подвергаются действию стрессовых факторов, таких как низкие температуры, кристаллизация воды, осмотический стресс, изменения рН растворов, дегидратация. Для снижения риска повреждений клеток при лиофилизации используют защитные среды (лиопротекторы). В качестве лиопротекторов в данной работе использовали сахарозу, желатин и их комбинации. Для оценки количества микроорганизмов проводили бактериологическое исследование. Оценивали количество бактерий рода Bifidobacterium, Lactobacillus, Escherichia, а также семейства Enterobacterales в целом. Установлено, что в лиофилизированном образце кала, содержащем в качестве защитной среды 10 % сахарозу, наблюдается наибольшее количество жизнеспособных клеток, физические свойства лиофилизата (его сыпучесть) удобны для наполнения капсул. Методом газовой хроматографии исследованы молярные соотношения КЖК в исходных образцах кала и лиофилизатах. Молярные соотношения мажорных короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) ацетата, пропионата и бутирата оказались идентичны в исследуемых образцах. Предложен состав защитной среды, в которой лиофилизированный биоматериал максимально соответствует исходному калу по количеству «живых» микроорганизмов. Лиофилизат по своим физическим характеристикам удобен для приготовления капсул
Протеолипосомы как способ иммобилизации мембранных белков для SPR-анализа на примере взаимодействия CYP3A4 и CYB5A человека
Get PDFMicrosomal systems of human cytochrome P450 consist of three components, which are membrane proteins: cytochrome P450 hemoprotein (CYP), NADPH-dependent cytochrome P450 reductase (CPR), and a small regulatory heme-containing protein cytochrome b₅ (CYB5A). In the study of the cytochrome P450 system functioning the study of intermolecular interactions both with partner proteins and with possible drug prototypes is of great importance. Surface plasmon resonance (SPR) is a powerful and reliable tool for studying intermolecular interactions. However, there is a problem of immobilization of membrane proteins on the optical chip of the SPR biosensor. It is important to immobilize such proteins in native conditions with respect to the correct orientation of the protein globule to the surface of sensor. Previously, we have developed and described a method involving direct native immobilization of membrane proteins into a planar bilayer lipid membrane on the surface of a biosensor chip. At the same time, one of the commonly used approaches to working with membrane proteins using various methods is the construction of proteoliposomes containing membrane proteins. In this work, using CYP3A4 and CYB5A as protein partners, we evaluated two approaches to the creation of proteoliposomes: incorporation of a membrane protein into liposomes saturated with detergents and incorporation of a membrane protein into the forming proteoliposomes by the mechanism of micellar coalescence. The interaction of CYP3A4 with proteoliposomes obtained by incorporating CYB5A into detergent-saturated liposomes was shown. On the contrary, interaction between CYP3A4 and proteoliposomes containing CYB5A, obtained by the method of micellar coalescence, was not detected. Thus, it was shown that the incorporation of the membrane protein into liposomes saturated with a detergent was a more preferable method for working with an SPR biosensor as compared to the method of proteoliposomes formation by micellar coalescence. Detailed protocols for the creation of proteoliposomes and SPR-analysis can be useful to a wide range of researchers.Микросомальные системы цитохромов P450 человека состоят из трёх компонентов, являющихся мембранными белками: гемопротеина цитохрома P450 (CYP), NADPH-зависимой цитохром Р450 редуктазы (CPR) и небольшого регуляторного гем-содержащего белка цитохрома b₅ (CYB5A). Важным направлением в изучении системы цитохромов Р450 является исследование межмолекулярных взаимодействий как с белками-партнёрами, так и с возможными прототипами лекарств. Одним из передовых подходов к изучению межмолекулярных взаимодействий является использование метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR). При этом возникает проблема иммобилизации мембранных белков на оптический чип SPR-биосенсора. Для моделирования нативных условий важное значение имеет соблюдение правильной ориентации белковой глобулы в пространстве. Ранее нами был разработан метод, предполагающий прямую иммобилизацию нативных мембранных белков в планарную бислойную липидную мембрану на поверхности чипа биосенсора. Другим широко распространённым подходом для работы с мембранными белками является конструирование протеолипосом, содержащих мембранные белки. В данной работе нами на примере белковых партнёров CYP3A4 и CYB5A было проведено сравнение двух подходов создания протеолипосом для SPR-анализа межмолекулярных взаимодействий мембранных белков: встраивание мембранного белка в липосомы, насыщенные детергентом, и встраивание мембранного белка в формирующиеся протеолипосомы по механизму мицеллярной коалесценции. SPR-анализ показал взаимодействие CYP3A4 с протеолипосомами, полученными методом встраивания CYB5A в липосомы, насыщенные детергентом. Факт взаимодействия между CYP3A4 и полученными методом мицеллярной коалесценции протеолипосомами, содержащими CYB5A, зафиксировать не удалось. Полученные результаты показали, что встраивание мембранного белка в липосомы, насыщенные детергентом, является более предпочтительным методом для работы с SPR-биосенсором по сравнению с методом формирования протеолипосом мицеллярной коалесценцией. Приведенные подробные протоколы создания протеолипосом и SPR-анализа могут быть полезны широкому кругу исследователей
Алгоритм обработки масс-спектрометрических данных для получения диагностической панели молекулярных соединений на примере поиска маркеров метастазирования при раке молочной железы
Get PDFA pathology diagnostic using molecular marker is a perspective direction of clinical medicine. Mass-spectrometry (MS) is a one of methods, which are used for obtaining information about molecular profiles. Selection of species, essential for classification “case/control is an important task for data processing. Pipeline of data processing has been proposed using MS data, obtained during analysis of tumor breast tissue samples and health breast tissue samples, with the aim of metastasis marker selection. As a result, selection of lipid markers that belong to classes, related to metastasis and proliferation processes, makes it possible to create high sensitivity diagnostic model, based on logistic regression. The proposed method is applicable for data processing, obtained by MS analysis of other “omics”: metabolome, proteome, glycome.Диагностика патологии по молекулярным маркерам является перспективным направлением клинической медицины, в котором масс-спектрометрия (МС) яслужит одним из методов, используемых для получения информации о молекулярных профилях. В контексте извлечения соединений, играющих ключевую роль для классификации патология/болезнь, важное значение имеет обработка полученных данных, часто включающих несколько сотен детектированных соединений. В данной работе предложен алгоритм обработки данных на примере данных МС, полученных при анализе опухолевой ткани и здоровой молочной железы, с целью выделения липидных маркеров метастазирования. В результате его реализации получен набор соединений, относящихся к классам липидов, связанных с процессами метастазирования и пролиферации, и позволяющих построить высокочувствительную диагностическую модель на основе логистической регрессии. Предложенный метод потенциально пригоден для обработки данных МС, полученных при анализе молекулярного профиля биоматериала другого базиса (метаболом, протеом, гликом)
Способы подготовки проб сыворотки крови при оценке фармакокинетики препаратов белковой природы на примере вискумина
Get PDFA comparative evaluation of methods for preparing blood serum samples for determination of the lectin content of the mistletoe Viscum Album, viscumin, by high-performance liquid chromatography in combination with high-resolution mass-spectrometry detection has been carried out. Based on the results of the analysis of the lectin hydrolyzate, a specific peptide fragment with m/z 791.388 suitable for subsequent quantitative determination was selected. Isolation of viscumin from serum components was carried out without the use of specific antibodies. The study used methods employing various spin columns and the method of protein precipitation with 1% TCA (trichloroacetic acid) in IPA (isopropyl alcohol). Testing the methods of depletion of blood serum proteins was based on the determination of the degree of extraction of lectin from model serum samples. As a result of our research, we have developed a technique for the quantitative analysis of viscumin in blood serum by the most efficient method of sample preparation using the ProteoMiner spin columns. The technique allows to determine the protein concentration up to 5·10-4 mg/ml with the extraction degree (2.7 ± 0.6) %.Представлены результаты сравнительного изучения способов подготовки проб сыворотки крови для оценки содержания лектина омелы Viscum Album – вискумина - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием высокого разрешения. По результатам анализа гидролизата лектина выбран специфичный пептидный фрагмент с m/z 791.388, пригодный для последующего количественного определения. Выделение вискумина от сопутствующих компонентов сыворотки проведено без использования специфических антител. В исследовании были использованы способы с применением различных спин-колонок и метод осаждения белков раствором 1% ТХУК (трихлоруксусной кислоты) в ИПС (изопропиловом спирте). Проверка способов удаления белков сыворотки крови основывалась на установлении степени извлечения лектина из модельных проб сыворотки. В результате исследований разработана методика количественного анализа вискумина в сыворотке крови с применением наиболее эффективного способа подготовки проб с применением спин-колонок ProteoMiner («Boi-Rad», США). Методика позволяет определить белок концентрацией до 5х10-4 мг/мл со степенью извлечения 2.7 ± 0.6%
Микробиом кишечника и метаболизм лекарственных соединений
Get PDFThe human physiology textbooks traditionally consider the intestine as a metabolically active organ, with its activity primarily associated with the production of numerous digestive enzymes. The development of molecular analysis technologies has significantly detailized this picture, primarily by decoding the metabolic potential of the intestinal microbiota. Data from numerous metagenomic studies indicate that the number of eukaryotic and bacterial cells in the human body is comparable - about 3.0×1013, while the number of genes in the intestinal metagenome is one hundred times greater than in the human genome. Obviously, the gut microbiota exhibits both direct and indirect effects on the metabolism of drugs and xenobiotics, that can affect their effectiveness and toxicity. Orally administrated xenobiotics have been found to be metabolized by intestinal microbial enzymes before being absorbed from the gastrointestinal tract into the blood flow. The metabolic reactions performed by the gut microbiota greatly differ from the metabolic reactions of the liver, providing modification of drugs by acetylation, deacetylation, decarboxylation, dehydroxylation, demethylation, dehalogenation, etc. Despite the metabolism of xenobiotics by microbial enzymes of the intestine is rather known, information about the specific microflora mediating each metabolic reaction is still limited, mainly by the lack of an adequate model of the intestinal microbial community to allow the accumulation of experimental data for the creation of computational models. Currently, studies of drug metabolism use microfluidic chips, reproducing functions of various organs and tissues, such as the liver, kidney, lungs and intestine, as in vitro models in the form of 2D and 3D cell cultures. Supplementation of such systems with the microbial community will allow to get as close as possible to in vitro modeling of complicated biological processes in the interests of pharmacological research and the accumulation of data for constructing computational models.В курсе физиологии человека кишечник традиционно рассматривают как метаболически активный орган, деятельность которого связывают в первую очередь с продукцией многочисленных пищеварительных ферментов. Развитие технологий молекулярного анализа позволило существенно детализировать эту картину, в первую очередь за счет расшифровки метаболического потенциала кишечной микробиоты. Данные многочисленных метагеномных исследований свидетельствуют, что количество эукариотических и бактериальных клеток в организме человека сопоставимо – около 3.0х1013, при этом количество генов в метагеноме кишечника в сто раз больше, чем в геноме человека. Очевидно, что микробиота кишечника оказывает как прямое, так и опосредованное влияние на метаболизм лекарственных препаратов и ксенобиотиков, что может сказаться на их эффективности и токсичности. Обнаружено, что ксенобиотики, вводимые перорально, могут метаболизироваться кишечными микробными ферментами еще до всасывания из желудочно-кишечного тракта в кровь. Метаболические реакции, выполняемые микробиотой кишечника, значительно отличаются от метаболических реакций печени, обеспечивая модификацию лекарственных препаратов путем ацетилирования, деацетилирования, декарбоксилирования, дегидроксилирования, деметилирования, дегалогенирования и др. Несмотря на то, что метаболизм ксенобиотиков микробными ферментами кишечника до некоторой степени известен, информация о конкретной микрофлоре, опосредующей каждую метаболическую реакцию, всё ещё ограничена, в первую очередь, отсутствием адекватной модели микробного сообщества кишечника, позволяющей накапливать экспериментальные данные для построения вычислительных моделей. Сегодня в исследовании метаболизма лекарственных средств применяют микрофлюидные чипы, на которых функции различных органов и тканей, таких как печень, почки, легкие и кишечник, воспроизводятся в виде in vitro моделей в форме 2D и 3D клеточных культур. Дополнение таких систем микробным сообществом позволит максимально приблизиться к моделированию in vitro сложных биологических процессов в интересах фармакологических исследований и накопления данных для построения вычислительных моделей
Влияние связывания гелданамицина с HSP90 на сайт фосфорилирования THR90
No full textProstate cancer is hormone-dependent and the androgen receptor (AR) is involved in its development. AR is a transcription factor that is activated by ligand binding, result in its translocation into the nucleus, where it initiates gene transcription. In an inactive state in cytoplasm AR exists as a complex with heat shock protein 90 (HSP90) and some other proteins. When the agonist binds, a conformational change in AR occurs, resulting in HSP90 and other chaperones dissociating. Recently it has been shown that for the dissociation of the HSP90-AR complex and the translocation of the latter into the nucleus, phosphorylation of the Thr-90 residue of the N-terminal domain of HSP90 is necessary. In this work, the effect of the HSP90 inhibitor, geldanamycin, interacting with the ATP-binding site, on the Thr90 phosphorylation site was investigated by molecular modeling methods. It has been shown that inhibitor binding slightly affects the size and mobility of cavity around Thr90. It is suggested that inhibitor binding to HSP90 does not result in changing the protein structure and does not influence on protein phosphorylation, and partially explains low effectiveness of such type of drugs in the therapy of prostate cancer.Рак предстательной железы (РПЖ) является гормон-зависимым, в его развитии активно участвует андрогеновый рецептор (AR), выполняющий роль фактора транскрипции. В неактивном состоянии в цитозоле AR находится в комплексе с белком теплового шока HSP90 и рядом других белков. Взаимодействие с агонистом приводит к конформационным изменениям в AR, в результате чего комплекс AR с шаперонами распадается и AR транспортируется в ядро. Недавно было обнаружено, что для диссоциации комплекса шаперона HSP90 и AR необходимо фосфорилирование остатка Thr-90 N-концевого домена HSP90. В данной работе методами молекулярного моделирования исследовано влияние ингибитора HSP90 гелданамицина, взаимодействующего с АТР-связывающим сайтом, на сайт фосфорилирования Thr90. Было показано, что связывание ингибитора не сильно влияет на размер и подвижность аминокислотных остатков полости около Thr90. Предполагается, что связывание ингибитора с HSP90 не приводит к изменению структуры белка и не может влиять на его фосфорилирование, что отчасти может объяснить невысокую эффективность такого типа препаратов в химиотерапии РПЖ
Особенности экспрессии и выделения укороченной рекомбинантной реналазы в прокариотических клетках
Get PDFRenalase (RNLS) is a flavoproteinin which its N-terminal peptide (residues 1-17) has several important functions. In cells, it participates in the formation of the so-called Rossmanfold (residues 2-35), needed for «accommodation» of the FAD cofactor and for performing the catalytic functions of RNLS as a FAD-dependent oxidoreductase (EC 1.6.3.5). RNLS secretion into the extracellular space is accompanied by cleavage of this peptide. The resultant truncated extracellular RNLS cannot bind FAD and therefore performs various noncatalytic functions. In this work, we have performed expression the genetic construct encoding RNLS lacking its N-terminal signal peptide (tRNLS) in E. coli Rosetta (DE3) cells. The recombinant protein was accumulated in inclusion bodies in an insoluble form, which could be solubilized in the presence of a high concentration of urea or guanidine chloride. In contrast to full-length RNLS, which was effectively solubilized in the presence of 8 M urea, tRNLS was preferentially solubilized in the presence of 6 M guanidine chloride.Реналаза (RNLS) – флавопротеин, N-концевой пептид которого (1-17 аминокислотных остатка (а.о.)) выполняет несколько важных функций. В клетках он участвует в формировании так газываемой укладки Россмана (2-35 а.о.), необходимой для «размещения» кофактора FAD и выполнения каталитических функций RNLS в качестве FAD-зависимой оксидоредуктазы (КФ 1.6.3.5). При секреции RNLS во внеклеточное пространство этот пептид отщепляется, а образующаяся укороченная внеклеточная RNLS не может связывать FAD и поэтому выполняет различные некаталитические функции. В данной работе мы осуществили экспрессию генетической конструкции, кодирующей лишенную N-концевого сигнального пептида RNLS (tRNLS), в клетках E. coli Rosetta (DE3). Как и в случае полноразмерной RNLS, рекомбинантная tRNLS накапливается в тельцах включения в нерастворимой форме, которая может быть переведена в растворимую форму в присутствии высокой концентрации мочевины или гуанидинхлорида. При этом, в отличие от полноразмерной RNLS, которая солюбилизировалась в присутствии 8 М мочевины, более эффективная солюбилизация tRNLS была достигнута в присутствии 6 М гуанидинхлорида
Измерение эстрогенов в тканях молочной железы методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии
Get PDFAlthough estrogen contribution estrogen to breast cancer development is not fully understood, an effective method of their measurement, in the mammary gland might provide additional insight. In this study, we have developed a LC-MS/MS method of simultaneous quantification of estrone and estradiol in breast tissue samples. Analytes were extracted with methyl tert-butyl ether by sonication and derivatized with dansyl chloride. Estrogens were analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with an electrospray ionization source. Accuracy and precision were better than 20% for most concentrations. Although estrone and estradiol levels in normal and malignant breast tissue samples analyzed using our method insignificantly differed. The method developed may be used in further studies aimed at evaluating a role estrogens in breast cancer risk.Воздействие эстрогенов считается одним из основных факторов риска развития рака молочной железы, однако механизмы действия этого фактора до конца не изучены. В связи с этим актуальным является создание методов оценки содержания эстрогенов в тканях молочной железы. В данной работе представлены результаты разработки метода количественного определения эстрона и эстрадиола в образцах ткани молочной железы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией. Аналиты экстрагировали метил-трет-бутиловым эфиром в ультразвуковой бане и дериватизировали дансилхлоридом. Были рассмотрены варианты нормировки количественных данных на исходную массу ткани и на массу экстрагированных липидов. Точность и прецизионность конечного метода были выше 20% для большинства концентраций. С помощью метода были проанализированы уровни эстрона и эстрадиола в образцах нормальной и злокачественной ткани молочной железы. Разработанный метод может быть использован в дальнейших исследованиях влияния эстрогена на риск развития рака молочной железы
Разработка метода экстракции тотального протеома спор Bacillus anthracis
Get PDFWe have developed a method for obtaining the total proteome of Bacillus anthracis spores, which combines efficient protein extraction with reliable disinfection of samples. We used 7 strains of B. anthracis: 4 plasmid-free, 3 diplasmid, one of which with an atypical type of capsule formation in air. The schemes for isolating the total spore proteome were tested using various lysis solutions in the presence of bacterial protease inhibitors, with the inclusion of the stages of treatment of spores with trichloroacetic acid and mechanical disintegration and with their exclusion. The quality and completeness of the extraction of the total proteome of the spores of the samples was assessed in one-dimensional (1D) and twodimensional (2D) electrophoresis. Treatment of spores with trichloroacetic acid increased the reliability of material disinfection and reduces the loss of the final product. Mechanical disintegration after treatment of spores with lysing solutions increases the completeness of extraction of spore proteins in a wide range of molecular weights and facilitated the process of sterilizing filtration. Final filtration of the lysate through a PVDF filter with a pore size of 0.22 μm provided additional decontamination of samples without reducing their quality. Thus, the use of the proposed sample preparation scheme makes it possible to obtain complete protein extracts of spores of B. anthracis strains, suitable for comparative analysis of the proteome and search for a possible correlation with the features phenotypic properties and mechanisms that ensure the preservation of the pathogen anthrax in environmental objects, including soilРазработан метод получения тотального протеома спор Bacillus anthracis, сочетающий эффективную экстракцию белков с надежным обеззараживанием образцов. В работе использовали 7 штаммов B. anthracis: 4 бесплазмидных, 3 диплазмидных, один из которых сс атипичным капсулообразованием в атмосфере воздуха. Апробированы схемы выделения тотального протеома спор с применением различных лизирующих растворов в присутствии ингибиторов бактериальных протеаз с включением этапов обработки спор трихлоруксусной кислотой и механической дезинтеграции и при их исключении. Оценку качества и полноты экстракции тотального протеома образцов спор оценивали методом одномерного и 2D-электрофореза. Обработка спор трихлоруксусной кислотой повышает надежность обеззараживания материала и уменьшает потери конечного продукта. Механическая дезинтеграция после обработки спор лизирующими растворами увеличивает полноту экстракции белков спор в широком диапазоне молекулярных масс и облегчает процесс стерилизующей фильтрации. Заключительная фильтрация лизата через PVDF-фильтр с размером пор 0.22 мкм обеспечивает дополнительное обеззараживание проб без снижения их качества. Таким образом, использование предложенной схемы пробоподготовки позволяет получать полноценные белковые экстракты спор штаммов B. anthracis, пригодные для сравнительного анализа протеома и поиска возможной взаимосвязи с особенностями фенотипических свойств, а также механизмов, обеспечивающих сохранение возбудителясибирской язвы в объектах окружающей среды, включая почву
Восстановление сперматогенеза у мужчин мезенхимальными стволовыми клетками жировой ткани (литературный обзор)
No full textStem cells are considered as new much promising therapeutic agents in treatment of male infertility due to their high differentiation potential and unlimited supply. In this review we summarized current views on application of mesenchymal stem cells in reproductive medicine.Стволовые клетки рассматриваются как новые многообещающие терапевтические агенты при лечении мужского бесплодия из-за их высокого потенциала дифференцировки и неограниченного предложения. В этом обзоре мы обобщили современные взгляды на применение мезенхимальных стволовых клеток в репродуктивной медицине