Biomedical Chemistry - Research and Methods (E-Journal)
Not a member yet
181 research outputs found
Sort by
Получение C-концевых последовательностей реналазы-1 и реналазы-2 человека, кодируемых альтернативными экзонами
Get PDFA method for generation of C-terminal amino acid sequences fused to dihydrofolate reductase (DHFR) and specific for RNLS1 and RNLS2 isoforms of renalase is described. It includes synthesis of nucleotide sequences of alternative exons of RNLS1-9ex and RNLS2-10ex, determining the differences in the primary structure of these proteins, their fusion with the coding sequence of DHFR and expression of these genetic constructs in cells of the E. coli Rosetta cells. Chromatographic purification on a column containing Ni Sepharose resulted in highly purified preparations of reombinant ReI-9ex and ReII-10ex proteins with an electrophoretic purity of about 95%.Описан метод получения С-концевых аминокислотных последовательностей, слитых с дигидрофолатредуктазой (DHFR) и специфичных для изоформ реналазы RNLS1 и RNLS2. Он включает синтез нуклеотидных последовательностей альтернативных экзонов RNLS1-9ex и RNLS2-10ex, определяющих различия первичной структуры этих белков, их слияние (т.н. фьюжн) с кодирующей последовательностью DHFR и экспрессию данных генетических конструкций в клетках штамма-продуцента E. Coli Rosetta. В результате хроматографической очистки на колонке, содержащей Ni-сефарозу, были получены высокоочищенные препараты реомбинантных белков ReI-9ex и ReII-10ex с электрофоретической чистотой около 95%
Высокопроизводительный скрининг с помощью оптического SPR-биосенсора низкомолекулярных соединений на взаимодействие с CYP51 Candida krusei
Get PDFThe opportunistic fungus Candida krusei is the causative agent of nosocomial infections characterized by high mortality and development of resistance to drugs of the azole class. Therefore, develjoment of non-azole antifungal agents against resistant fungal strains is extremly important. Lanosterol 14-alpha demethylase (CYP51) is a well-known antifungal target. The optical SPR biosensor is a universal tool for screening studies in search of new drug prototypes. This paper presents the methodological aspects of high-hroughput SPR based screening of a library of low molecular weight compounds of natural origin for their interaction with C. krusei CYP51. It has been shown that when performing high-throughput screening, a researcher should pay special attention to the degree of a sensorgram curvature in the association phase. The described approaches to the analysis of high throughput screening data can be useful for researchers working with SPR biosensors from various manufacturers.Условно-патогенный гриб Candida krusei (C. krusei) является возбудителем нозокомиальных инфекций, характеризующихся высокой летальностью. В последнее время наблюдается тенденция к увеличению доли штаммов дрожжевых грибов, резистентных к препаратам класса азолов. Поэтому поиск потенциальных противогрибковых соединений неазольной природы является актуальным направлением исследований при разработке новых эффективных терапевтических средств в отношении резистентных штаммов грибов. Ланостерол 14-альфа деметилаза (CYP51) является широко известной мишенью для противогрибковых средств. Оптические SPR-биосенсоры представляют собой универсальный инструмент для скрининговых исследований, целью которых является поиск прототипов новых лекарственных соединений. В данной работе представлены методические аспекты высокопроизводительного скрининга библиотеки низкомолекулярных соединений природного происхождения, направленного на установление их взаимодействия с CYP51 C. krusei с использованием SPR-биосенсора. Как показывают результаты, при проведении высокопроизводительного скрининга особое внимание следует обращать на степень выраженности наклона сенсограммы взаимодействия в фазе ассоциации. Описанные подходы к анализу данных высокопроизводительного скрининга могут быть полезны исследователям, работающим с SPR-биосенсорами различных моделей
Способ поиска лигандов для новых сайтов связывания
No full textAnalysis of protein structures shows that most of them have potential binding sites that may be considered as applicable for new ligand design. The lack of known ligands interacting with such binding sites seriously complicated potential ligands selection. We have developed an approach that can increase the effectiveness of virtual screening for such ligands. It integrates methods of de novo ligand design, pharmacophore modeling, molecular docking, molecular dynamics, calculation of binding energies by MM-GBSA. This approach starts by the de novo design of virtual library of potential compounds followed by selection of favourable substructures and their correct positioning in a new ligand binding site. This generated library has been used for a development of pharmacophore models that have been used for a virtual screening of molecular databases. The selected compounds were docked to the putative binding site to check their ability to accommodate into it and their ability to locate the identified favorable fragments in the same region of the binding site as de novo generated molecules. The further evaluation of the selected ligands can be carried out by standard CADD methods.Анализ белковых структур показывает, что большинство из них имеют потенциальные сайты связывания, которые можно рассматривать как перспективные для поиска новых лигандов. Однако, отсутствие данных о известных лигандах, взаимодействующих с такими сайтами связывания, сильно ограничивают поиску и отбору новых соединений. В данной работе представлен подход для повышения эффективности виртуального скрининга. Данный подход объединяет методы дизайна лигандов de novo, построения моделей фармакофоров, молекулярный докинг, молекулярную динамику, расчет энергий связывания с помощью MM-GBSA. При использовании данного подхода на первом этапе создается виртуальная библиотека потенциальных соединений методом конструирования de novo, с последующим отбором эффективных субструктур и их расположения в сайте связывания. На основе которых разрабатываются модели фармакофоров, которые используются для виртуального скрининга молекулярных баз данных. Отобранные соединения докируются в сайт связывания для проверки их способности размещаться в нем и для оценки совпадения идентифицированных благоприятных фрагментов в том же районе сайта связывания, предсказанном при генерации молекул de novo. Дальнейшую оценку выбранных лигандов можно проводить стандартными методами компьютерного конструирования лекарств. Предлагаемый подход может способствовать эффективному поиску лигандов для новых сайтов связывания
Генерация супероксида никотинамидными коферментами
Get PDFNicotinamide coenzymes can generate superoxide radicalsin alkaline environment. Their formation was registered by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) present in the buffer with formation of diformasan. Inhibition of diformazan formation occurs when superoxide dimutase (SOD) is added to the system, thus confirming generation of O₂─●. The highest superoxide generating activity was observed with NADPH. In the case of NADPH and NADH, the rate of superoxide generation was significantly lower (by approximately 50%). No O₂─● was detected when NAD was used under the same conditions and in the same time; however, 4 h later, diformasan was detected in the same sample. The superoxide generating activity decreased in the following order: NADPH > NADH ≥ NADP > NAD. Other compounds tested (adenosine, ADP and ATP) did not generate superoxide radicals even after prolonged incubation. In a cell, where a local changes in the pH of the environment are possible, nicotinamide coenzymes can be potential sources of O₂─● and thus participate in cell signaling. A change in pH can initiate this process.Никотинамидные коферменты в щелочной среде генерируют супероксидные радикалы (О₂─●), которые обнаруживаются присутствующим в буфере нитросиним тетразолием (НСТ) по регистрации продукта восстановления НСТ диформазана. Ингибирование образования диформазана происходит при добавлении в систему супероксиддимутазы (СОД), что подтверждает возникновение О₂─●. Наиболее активная генерация происходит при использовании NADPH. При использовании NADP и NADH скорость генерации значительно снижена (приблизительно на 50%). При использовании NAD при тех же условиях и за то же время образование О₂─● обнаружено не было, однако через 4 ч в этой же пробе был выявлен диформазан. Ряд активности, выстроенный по скорости генерации супероксида, имеет вид: NADPH > NADH ≥ NADP > NAD. Другие исследованные вещества (аденозин, ADP и ATP) не обладали способностью генерировать супероксид даже на протяжении длительного времени. В клетке, где возможно локальное изменение рН среды, никотинамидные коферменты могут быть потенциальными источниками О₂─● и, таким образом, участвовать в клеточной сигнализации. Изменение рН может инициировать этот процесс
Идентификация протеоформ в результатах 2D электрофореза по предсказанным значениям величины изоэлектрической точки
Get PDFThe possibility of identifying specific protein proteoforms with post-translational modifications (PTM) by analyzing two-dimensional (2D) gel electrophoresis maps and using the prediction of the isoelectric point of proteins (pI) has been investigated. The pI values were predicted using the pIPredict 3 program, supporting a wide range of chemical and post-translational modifications. Eleven 11 proteins (albumin, alpha-1-microglobulin, annexin A2, apolipoprotein E, gastric triacylglycerol lipase, mitochondrial isocitrate dehydrogenase, clusterin, plasmin, prothrombin, endoplasmic reticulum chaperone, S-adenosylmethionine synthase type 1) identified on six 2D electrophoresis maps were used as examples. Various options for selecting hypotheses are considered. These take into consideration the following available information about a particular protein: possible modification sites, processing features, variability of the amino acid composition. The obtained results indicate that the use of predicting the pI value for proteins with hypothetical PTMs can form a set of hypotheses about specific proteoform occurrence on 2D electrophoresis maps.В работе рассмотрена возможность идентификации конкретных протеоформ белка с посттрансляционными модификациями (ПТМ) по данным анализа карт двумерного (2D) гель-электрофореза с использованием предсказания величины изоэлектрической точки белков (pI). Для предсказания значений pI использовали программу pIPredict 3, которая поддерживает широкий спектр химических и посттрансляционных модификаций. В качестве конкретных примеров рассмотрены 11 белков (альбумин, альфа-1-микроглобулин, аннексин А2, аполипопротеин Е, желудочная триацилглицероллипаза, митохондриальная изоцитратдегидрогеназа, кластерин, плазмин, протромбин, шаперон эндоплазматического ретикулума, S-аденозилметионинсинтаза 1-го типа), идентифицированных на шести картах 2D электрофореза. Рассмотрены различные варианты подбора гипотез с учётом доступной информации о конкретном белке: возможных сайтов модификации, особенностей процессинга, вариабельности аминокислотного состава. Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование предсказания величины pI для белков с гипотетическими ПТМ может сформировать набор гипотез о том, какие конкретно протеоформы наблюдаются на картах 2D электрофореза
Сравнительный анализ протеомного профиля кератиноцитов HaCaT с использованием 1DE-гель концентрирования
Get PDFUsing tandem mass spectrometry with electrospray ionization, a comparative analysis of HaCaT keratinocyte proteins was carried out before and after exposure of cells to sodium dodecyl sulfate (25 mg/ml) for 48 hours; proteins encoded by human chromosome 18 genes were chosen as the comparison proteins. A total of 2418 proteins were detected in the HaCaT immortalized human keratinocytes, 70% of these proteins were identified by two or more unique peptides. Panoramic mass spectrometry analysis identified 38 proteins encoded by chromosome 18 genes, 27 proteins were common to control HaCaT cells and HaCaT cells exposed to SDS. Using the Metascape database (https://metascape.org), an enrichment analysis of GO terms of the Biological Process category of chromosome 18 gene encoded proteins of HaCaT keratinocytes was performed before and after the SDS exposure. The SDS exposure resulted in a slight enrichment of the GO term "response to stimulus" (GO:0050896) and the related GO term "negative regulation of biological process" (GO:0048519). We found decreased expression levels of membrane proteins encoded by chromosome 18 genes related to cell-cell adhesion (GO:0098609), such as DSC1, DSC3, and DSG1. A decrease in the expression level of desmosomal cadherins is characteristic of malignant neoplasms developing from epithelial tissue cells of various internal organs, mucous membranes, and skin. The method of preparation of HaCaT keratinocyte samples used in this work increased the sensitivity of proteomic analysis of cell culture and made it possible to identify twice as many proteins in one gel strip as compared to the number of proteins (1284) in HaCaT samples subjected to osmotic shock and cleavage by trypsin in solution.Проведена оценка протокола пробоподготовки образцов клеточной культуры кератиноцитов, основанного на солюбилизации белков в присутствии 0.2% додецилсульфата натрия (SDS), процедуре 1DE-гель концентрирования (SDS-PAGE без фракционирования в разделяющем геле) и расщеплении трипсином в геле для углубленного протеомного анализа кератиноцитов НаСаТ в одной полосе белка. С помощью тандемной масс-спектрометрии с электроспрейной ионизацией (LC-MS/MS) проведен сравнительный анализ белков кератиноцитов НаСаТ до и после воздействия SDS в субтоксической дозе (25 мг/мл) в течение 48 ч. В качестве белков сравнения выбраны белки, кодируемые генами хромосомы 18 человека. Всего в иммортализованных кератиноцитах человека линии НаСаТ обнаружено 2418 белков, из них около 70% идентифицировано по двум и более уникальным пептидам. По результатам панорамного масс-спектрометрического анализа удалось идентифицировать 38 белков, кодируемых генами хромосомы 18; из них 27 белков были общими для контрольных клеток и клеток НаСаТ, подвергнутых воздействию SDS. С использованием базы данных Metascape был проведен анализ обогащения терминами онтологии генов (GO) категории биологические процессы (biological process) белков хромосомы 18 кератиноцитов НаСаТ до и после воздействия SDS. Обработка клеточной культуры SDS приводила к незначительному обогащению GO термина “ответ на стимул” (GO:0050896 - response to stimulus) и связанного с ним GO термина “негативная регуляция биологических процессов” (GO:0048519 - negative regulation of biological process). Было обнаружено снижение уровня экспрессии мембранных белков, кодируемых генами хромосомы 18, относящихся к межклеточной адгезии (GO:0098609 - cell-cell adhesion), таких как DSC1, DSC3 и DSG1. Снижение уровня экспрессии десмосомальных кадгеринов характерно для злокачественных новообразований, развивающихся из клеток эпителиальной ткани различных внутренних органов, слизистых оболочек, кожи. Примененный в работе способ подготовки образцов кератиноцитов НаСаТ позволил идентифицировать в одной полосе геля в два раза больше белков по сравнению с образцами НаСаТ, подвергнутыми осмотическому шоку и расщеплению трипсином в растворе
Прямая детекция микроРНК mir-34a, -145 и -218 с помощью CRISPR/Cas13a-нуклеазы
No full textUsing CRISPR/Cas13a-nuclease we have demonstrated a feasibility of direct detection of three miRNAs, miR-34a, -145, and -218 (their molecular signature is suggested as a diagnostic and prognostic biomarker in cervical cancer),. The detection is based on registration of a cleavage of molecular reporters bearing a fluorophore and a quencher by the complex of CRISPR/Cas13a-nuclease and guide RNA (gRNA) with a spacer of 21-23 nucleotides long. The detection sensitivity varied among miRNAs tested by 10-fold, presumably due to the unwanted intramolecular partial base paring of gRNA. The miRNA detection with Cas13a nuclease strongly depended on the presence of background RNA thus potentially compromising its direct application to complex media in a general case. Further optimization of measurement conditions including probably an additional amplification of the signal generated by collateral activity of Cas13a nuclease is necessary to directly detect miR-34a, -145, and -218 in biological samples.Показана возможность прямой детекции трех микроРНК, miR-34a, -145 и -218 (чья молекулярная сигнатура предлагается как диагностический и прогностический биомаркер при раке шейки матки), с помощью CRISPR/Cas13a-нуклеазы. Детекция основано на регистрации расщепления молекулярных «репортеров» – коротких РНК-олигонуклеотидов, несущих флуорофор и гаситель – комплексом CRISPR/Cas13a-нуклеазы и направляющей РНК (нРНК) со спейсером длиной 21-23 нуклеотида. Чувствительность обнаружения варьировала 10-кратно среди тестированных микроРНК, предположительно из-за нежелательного внутримолекулярного частичного спаривания оснований нРНК. Обнаружено, что детекция микроРНК с помощью нуклеазы Cas13a сильно зависит от присутствия фоновой РНК, что в общем случае может затруднить такую детекцию в сложном матриксе. Дальнейшая оптимизация условий измерения, включая, вероятно, дополнительное усиление сигнала, генерируемого коллатеральной активностью нуклеазы Cas13a, необходима для прямой детекции miR-34a, -145 и -218 в биологических образцах
β1-адренорецептор, солюбилизированный в форме нанодисков: скрининг различных амфипатических полимеров
Get PDFThe development of a reliable and easily used diagnostic test for measuring autoantibodies to β1-adrenergic receptor (β1ADR Ab) in patient blood is an unmet clinical need. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is considered as the most appropriate method for this task. In ELISA, the use of peptides corresponding to various fragments of amino acid sequence of β1ADR as antigens leads to inadequate results as β1ADR Ab appear to recognize conformationally dependent epitopes that are generated during the formation of unique tertiary structure of the receptor. Isolation of β1ADR preserving the native conformation and functional characteristics is a quite challenging task. A promising approach to address this task is the use of amphipatic polymers capable of forming nanodiscs, it permits to successfully solubilize membrane proteins. In order to obtain the preparations of solubilized β1ADR that can be used as antigens in ELISA we have tested 17 various amphipatic polymers. The best relative solubilization values (RSV) were obtained using UltrasoluteTM Amphipol 17 (87%) and 18 (62%), as well as by AASTY 11-45 (76%), 11-50 (77%) and 6-50 (78.5%).Создание надежного и удобного в использовании диагностического теста для определения в крови пациентов аутоантител к β1‑адренорецептору (АДРБ1 АТ) является насущной потребностью клинической практики. Формат иммуноферментного анализа (ИФА) представляется наиболее подходящим для решения этой задачи. Использование в ИФА в качестве антигена пептидов, воспроизводящих отдельные фрагменты аминокислотной последовательности АДРБ1, приводит к неадекватным результатам, поскольку, по-видимому, АДРБ1 АТ узнают конформационно-зависимые эпитопы, образующиеся при формировании уникальной третичной структуры рецептора. Выделение АДРБ1, сохраняющего нативную конформацию и функциональные свойства, является весьма сложной задачей. Перспективным способом ее решения является использование амфипатических полимеров, формирующих нанодиски, что позволяет успешно солюбилизировать мембранные белки. В настоящей работе описаны результаты тестирования 17 различных амфипатических полимеров с целью получения препаратов солюбилизированных АДРБ1, пригодных для использования в ИФА в качестве антигена. Наилучшие условные показатели солюбилизации (УПС) продемонстрировали UltrasoluteTM Amphipol 17 (87%) и 18 (62%), AASTY 11-45 (76%), 11-50 (77%), 6-50 (78.5%)
Программа предсказания времени удержания пептидов с учётом посттрансляционных модификаций
Get PDFThis paper describes the Retention Time Predictor (RTP) program and web service for predicting the retention time of peptides on a chromatographic column in mass spectrometry experiments. Taking into account post-translational modifications of peptides the program represents a modification of the well-known SSRCalc version 3 (Krokhin, Anal. Chem. 2006, 78(22), 7785-7795). The values of retention coefficients for modified amino acid residues and the algorithm for calculating the isoelectric point value were from the pIPredict program (Skvortsov et al., Biomed. Chem. Res. Meth. 2021, 4(4), e00161). Modifications described in the program include (i) Tandem Mass Tag (TMT) and Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification (iTRAQ) labels; (ii) acetylation, formylation, and methylation of the N-terminal residue and/or lysine side chain; (iii) carbamidomethylation of cysteine, asparagine, and glutamic acid residues; (iv) oxidation and double oxidation of methionine and proline residues; (v) phosphorylation of serine, threonine, and tyrosine residues; (vi) C-terminal amidation of lysine and arginine residues; (vii) formation of propionamide with a cysteine residue. Retention coefficient estimation was based on data from 25 mass spectrometry experiments for which identification was performed from the raw data deposited in the ProteomeXchange database. The RTP program and web service are freely available at http://lpcit.ibmc.msk.ru/RTP.В работе представлена программа и web-сервис Retention Time Predictor (RTP), предназначенные для предсказания времени удержания пептидов на хроматографической колонке в экспериментах по масс-спектрометрии и учитывающая посттрансляционные модификации аминокислотных остатков (а.о.). Программа представляет собой модификацию известной программы SSRCalc версии 3 (Krokhin, Anal. Chem., 2006, 78(22), 7785–7795). В нее добавлены значения коэффициентов удержания для модифицированных а.о. и алгоритм расчёта величины изоэлектрической точки из программы pIPredict (Skvortsov et al., Biomed. Chem. Res. Meth., 2021, 4(4), e00161). Модификации, описанные в программе, включают: (i) Tandem Mass Tag (TMT) и Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification (iTRAQ) метки; (ii) ацетилирование, формилирование и метилирование N-концевого остатка и/или бокового радикала лизина; (iii) карбамидометилирование остатков цистеина, аспарагиновой и глутаминовой кислот; (iv) окисление и двойное окисление остатков метионина и пролина; (v) фосфорилирование остатков серина, треонина и тирозина; (vi) С-концевое амидирование остатков лизина и аргинина; (vii) образование пропионамида с остатком цистеина. Подбор коэффициентов удержания проведён с использованием данных 25 масс-спектрометрических экспериментов, для которых идентификация была выполнена заново по исходным (RAW) данным, депонированным в БД ProteomeXchange. Программа RTP и web-сервис свободно доступны по адресу http://lpcit.ibmc.msk.ru/RTP
Исследование коллагена I типа методом иммуноблоттинга в образцах костнопластических биоматериалов
Get PDFThe type I collagen was studied in samples of two types of osteoplastic materials produced in the Biotech Research Institute of the Samara State Medical University using immunoblotting. The demineralized samples used in the work were compact bone powder and crushed material of human cancellous bone tissue. Collagen and its polypeptides were separated in a 5% polyacrylamide gel with 3.6 M urea according to the method of Hayashi and Nagai (1979). The advantage of the method is the separation under these conditions of type I and III collagen, as well as the α1(I) and α2(I) chains of type I collagen. Immunoblotting was carried out by diffusion method according to the method of Towbin et al. (1979) using nitrocellulose membranes (Santa Cruz, USA). Primary goat polyclonal antibodies to denatured collagen, 1:500 dilution (Millipore) were used. Peroxidase-conjugated secondary antibodies (mouse vs. goat), 1:80000 dilution (Sigma) were used also. It has been established that the bulk of the compact bone protein is localized between the α1- and α2-fractions of collagen. In samples of cancellous bone tissue, a molecular reduction of the protein is noted. Protein macromolecules with a gradually decreasing molecular weight and low molecular weight polypeptides migrating in the gel with a wide front up to the indicator line are detected. Due to the low specificity of osteoblast integrins in regenerating bone tissue, collagen polypeptides, as well as protein molecules retained in implants, can act as inducers of synthetic processes occurring in osteoblast nuclei. Protein fragmentation products in the implant can act as signaling molecules that trigger cascades of enzymatic reactions and intracellular signaling pathways.С помощью иммуноблоттинга исследовали коллаген I типа в образцах двух видов костнопластических материалов, производимых в Научно-исследовательском институте биотехнологий Самарского государственного медицинского университета. В работе использовали деминерализованные образцы: порошок компактной кости и измельченный материал губчатой костной ткани человека. Коллаген и его полипептиды разделяли в 5 полиакриламидном геле с 3.6 М мочевиной по методу Hayashi, Nagai (1979). Преимуществом метода является разделение в этих условиях коллагена I и III типа, а также цепочек α1(I) и α2(I) коллагена I типа. Иммуноблоттинг осуществляли диффузионным способом по методу Towbin и соавт. (1979) с использованием нитроцеллюлозных мембран. Установлено, что основная масса белка компактной кости локализована между α1- и α2- фракциями коллагена. В образцах губчатой костной ткани отмечена молекулярная редукция белка. Выявлены макромолекулы белка с постепенно уменьшающейся молекулярной массой и низкомолекулярные полипептиды, мигрирующие в геле широким фронтом вплоть до линии индикатора. В силу низкой специфичности интегринов остеобластов регенерирующей костной ткани полипептиды коллагена, а также сохраняющиеся в имплантатах молекулы белка, могут проявлять себя в качестве индукторов синтетических процессов, протекающих в ядрах остеобластов. В таком случае полипептиды коллагена можно рассматривать как сигнальные молекулы, запускающие каскады ферментативных реакций и внутриклеточные сигнальные пути