Biomedical Chemistry - Research and Methods (E-Journal)
Not a member yet
181 research outputs found
Sort by
Использование праймеров с высокой степенью мечения в полимеразной цепной реакции
No full textThe fluorescently-labeled DNA is widely used in various bioanalytical applications. For a number of applications, a high level of labeling could be beneficial. One of the ways to produce DNA fragments bearing multiple fluorescent tags is to use polymerase chain reaction (PCR) with primers heavily labeled with fluorophores. Here we tested how primers with multiple fluorescein tags perform in PCR. It has been found that the positioning of fluorescein tags at or near the 3′-end upon primer multiple labeling can inhibit DNA amplification (up to a complete stop when tags are placed at the 3′- or adjacent nucleotide). The mechanism, by which the presence of fluorescein tags at or near the primer 3′-end affects the PCR performance, is rather ambiguous and can involve both a steric hindrance for polymerase binding from the fluorescein moiety, as well as destabilization of a primer-template duplex. Nonetheless, if multiple fluorescein tags are attached so that at least three nucleotides from the primer 3′-end are unmodified, the production of DNA fragments bearing multiple fluorescein molecules is possible even if both primers are heavily labeled, though on the expense of amplicon yield.Флуоресцентно-меченую ДНК широко используют в различных биоаналитических приложениях. В ряде случаев высокий уровень меченья ДНК является преимуществом. Одним из способов получения фрагментов ДНК, несущих множественные флуоресцентные метки, является использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами с высокой степенью мечения. В данной работе мы исследовали, как присутствие многочисленных молекул флуоресцеина, прикреплённых к праймеру, влияет на результат ПЦР. Было обнаружено, что расположение флуоресцеиновой метки на 3′-конце праймера или вблизи него может ингибировать амплификацию (вплоть до полной остановки, когда метка находится непосредственно на 3′-концевом или соседнем с ним нуклеотиде). Механизм, посредством которого присутствие флуоресцеиновых меток на 3’-конце праймера или вблизи него влияет на эффективность ПЦР, довольно неоднозначен и может включать как стерическое препятствование связыванию полимеразы прикреплённой молекулой флуоресцеина, так и дестабилизацию дуплекса праймер-матрица. Тем не менее, если множественные флуоресцеиновые метки прикреплены к нуклеотидам праймера таким образом, что по меньшей мере три нуклеотида с его 3′-конца остаются немодифицированными, то получение фрагментов ДНК с высоким уровнем мечения возможно с помощью ПЦР, хотя и с заметно меньшим выходом, чем при использовании немодифицированных праймеров
Усовершенствование экзонового метода для ускоренного получения кДНК гена реналазы крысы
Get PDFWe have improved our previously developed method of exon cloning of cDNA of eukaryotic genes to obtain the rat renalase gene cDNA. In contrast to the previously used step-by-step pairwise assembly of exons, in this work the procedure of full-length cDNA preparation was shortened due to simultaneous assembly of four neighboring exons at once (exons 1-4 and exons 6-9 of the rat renalase gene). The two obtained sequences (exons 1-4 and 6-9) were combined into a full-length cDNA of the rat renalase gene. The cDNA synthesized in this way was cloned into the prokaryotic vector pET-28a(+), which was then expressed in E. coli cells. The correctness of this approach was confirmed by sequencing resultant cDNA sequencing, which showed full (100%) identity with the nucleotide sequence available in the GenBank database (accession code: GenBankNM_001014167).Усовершенствован ранее разработанный нами метод экзонового клонирования кДНК эукариотических генов для получения кДНК гена реналазы крысы. В отличие от ранее использованного постадийного парного объединения экзонов, в данной работе процедура получения полноразмерной кДНК была сокращена за счет того, что мы использовали объединение сразу четырех соседних экзонов (1-4 и 6-9 гена крысы). Две полученные последовательности (экзонов 1-4 и 6-9) объединяли в полноразмерную кДНК гена реналазы крысы. Синтезированную таким образом кДНК клонировали в прокариотический вектор pET-28a(+) с последующей экспрессией в клетках E. coli. Корректность такого подхода подтверждена путем секвенирования полученной кДНК, которая показала полное (100%) совпадение с нуклеотидной последовательностью базы данных (код доступа GenBankNM_001014167)
Влияние присоединения сRGD пептида к фосфолипидным наночастицам с включенным доксорубицином на апоптоз в клетках глиобластомы in vitro
Get PDFOne of the methods of treating glioblastoma after surgery is chemotherapy; the drugs used in this case, due to their nonspecific distribution, lead to a number of complications. One way to overcome this drawback is to supply drugs with delivery systems with targeted molecules. This approach allows increasing the accumulation of therapeutic agents directly at the lesion site, minimizing side effects. This work is a continuation of the study of the mechanism of action of the previously obtained phospholipid composition of doxorubicin with a targeted cRGD peptide (NPh-Dox-cRGD). This peptide is capable of selectively interacting with integrin αvβ3, a receptor expressed on the surface of a number of tumor cells, including glioblastoma. The work assessed the cytotoxic effect of the NPh-Dox-cRGD composition in comparison with the free substance (Dox) and embedded in phospholipid nanoparticles without a targeted ligand (NPh-Dox). It was shown that after 24 h of incubation of U-87 MG cells with substances at the maximum concentration of Dox (30 μg/ml), the percentage of viability cells was 6% for Dox, 21% for NPh-Dox-cRGD, and 21% for NPh-Dox – 17%, i.e. When Dox was incorporated into phospholipid NPs, its cytotoxic effect was observed to a lesser extent. No statistically significant differences were noted in the control line HeLa. Assessment of tumor cell death using flow cytometry indicated that most of the cells died via apoptosis. When incubated with a composition containing a targeting peptide, NPh-Dox-cRGD, at a concentration (Dox) of 0.5 μg/ml, the percentage of cells susceptible to late apoptosis was 29.7%, for the free form – 24.4%. An assessment of cells susceptible to early apoptosis (Dox concentration 0.5 μg/ml) showed that the percentage of these cells for the sample with the peptide was higher and amounted to 11.4%.Одним из методов лечения глиобластомы после хирургического вмешательства является химиотерапия. Используемые при этом препараты ввиду их неспецифического распределения приводят к ряду осложнений. Одним из способов преодоления данного недостатка является снабжение лекарств системами доставки с адресными молекулами. Это способствует накоплению терапевтических агентов непосредственно в очаге поражения и минимизирует побочные проявления. В данной работе исследовали влияние фосфолипидной композиции доксорубицина с адресным сRGD пептидом (NPh-Dox-cRGD), который селективно взаимодействует с интегрином αvβ3 на поверхности ряда опухолевых клеток, включая клетки глиобластомы. Сравнительная оценка цитотоксического действия свободной субстанции (Dox), композиции NPh-Dox-cRGD и Dox, встроенной в фосфолипидные наночастицы без адресного лиганда (NPh-Dox), показала, что при встраивании в фосфолипидные наночастицы Dox проявляет цитотоксическое действие в меньшей степени. Через 24 ч инкубации клеток U-87 MG с веществами в максимальной концентрации по Dox (30 мкг/мл) процент живых клеток составлял для Dox – 6%, для NPh-Dox-cRGD – 21% и для NPh-Dox – 17%. На контрольной клеточной линии HeLa статистически значимых различий отмечено не было. Оценка гибели опухолевых клеток с помощью метода проточной цитометрии указывала на то, что большая часть клеток погибала по пути апоптоза. При инкубации с композицией, содержащей адресный пептид, NPh-Dox-cRGD, в концентрации (по Dox) 0.5 мкг/мл процент клеток, подверженных позднему апоптозу, составлял 29.7%, для свободной формы – 24.4%. Оценка клеток, подверженных раннему апоптозу (концентрация по Dox 0.5 мкг/мл) показала, что процент данных клеток для образца с пептидом был выше и составлял 11.4%
Идентификация рибосомных футпринтов на электрофоретическом геле при профилировании транслатома: использование ДНК-маркёров
No full textThe commercial DNA ladder was tested as a substitute for RNA size standards to identify ribosomal footprints (RNA fragments of about 30 nucleotides long) on an electrophoretic polyacrylamide gel for the purposes of translatome profiling. It has been found that 25 and 35 nucleotides long synthetic RNA oligonucleotides do migrate slower than the synthetic DNA oligonucleotides of the matching length and sequences and their positions on the gel coincide with those of 30 and 40 nucleotides long DNA oligonucleotides, correspondingly, of the commercial IDT 20/100 DNA oligo length standards. By using this DNA ladder and RNA isolated from the preparation enriched in ribosomes (obtained by fractionating on MicroSpin S-400 columns the HepG2 cell lysate treated with RNase I), the position of a band of putative ribosomal footprints can be identified on a gel that has been verified by measuring in an RNA-seq experiment the length of RNA fragments extracted from the band.Коммерческие ДНК-маркёры тестировали как замену РНК-стандартов длины молекулы для идентификации рибосомных футпринтов (фрагментов РНК длиной около 30 нуклеотидов) на электрофоретическом полиакриламидном геле при профилировании транслатома. Было обнаружено, что синтетические РНК-олигонуклеотиды длиной 25 и 35 нуклеотидов мигрируют медленнее, чем синтетические ДНК-олигонуклеотиды соответствующей длины и последовательностей, и их положение на геле совпадает с положением ДНК- олигонуклеотидов длиной 30 и 40 нуклеотидов соответственно из коммерческого набора стандартов длин ДНК-олигонуклеотидов «IDT 20/100 DNA oligo length standards». Используя данный набор и РНК, выделенную из препарата, обогащенного рибосомами (полученного фракционированием на колонках MicroSpin S-400 клеточного лизата HepG2, обработанного РНКазой I), можно идентифицировать положение полосы предполагаемых рибосомных футпринтов на геле, что было подтверждено измерением длины фрагментов РНК, выделенных из полосы, при проведении их секвенирования методом RNA-seq
Конструирование и экспрессия химерного гена реналазы человека, кодирующего N-концевую сигнальную последовательность секреторного белка пролактина
Get PDFRenalase (RNLS) is a protein that performs various protective functions both inside and outside cells. Intracellular RNLS is a FAD-dependent oxidoreductase (EC 1.6.3.5). Extracellular RNLS lacking an N-terminal peptide does not interact with FAD and exhibits various protective effects on the cell through interaction with receptor proteins. The mechanisms and factors responsible for RNLS transport out of the cell are not fully understood. It is well known that the signal sequence plays a key role in the classical mechanism of protein transport outside cells. One of the approaches to study the secretion of RNLS from the cell can be the creation of chimeric forms of the protein with a modified N-terminal amino acid signal sequence. Bioinformatics analysis showed that the signal sequence of the prolactin gene (PRL), connected to the template sequence of the RNLS gene, gave the classic signal characteristic of secretory proteins. On this basis, this paper describes: (i) a method for constructing the human RNLS gene in which the N-terminal sequence encoded by the RNLS gene was replaced by the N-terminal sequence encoded by the PRL gene; (ii) expression of this chimeric genetic construct.Реналаза (RNLS) - белок, который выполняет различные защитные функции как внутри, так и снаружи клеток. Внутриклеточная RNLS проявляет свойства FAD-зависимой оксидоредуктазы (КФ 1.6.3.5). Внеклеточная RNLS, лишенная N-концевого пептида, не взаимодействует с FAD, проявляет различные защитные эффекты на клетку посредством взаимодействия на рецепторные белки. Механизмы и факторы, ответственные за транспорт RNLS из клетки, до конца не изучены. Хорошо известно, что сигнальная последовательность играет ключевую роль в классическом механизме транспорта внутриклеточных белков. Одним из подходов для изучения секреции RNLS из клетки может быть создание химерных форм белка с модифицированной N-концевой сигнальной аминокислотной последовательности. Биоинформатический анализ показал, что сигнальная последовательность гена пролактина (PRL), соединенная с матричной последовательностью гена RNLS, давала классический сигнал, свойственный секреторным белкам. Исходя из этого, в данной работе: (i) описан метод конструирования гена RNLS человека, в котором N-концевая последовательность, кодируемая геном RNLS, была заменена на N-концевую последовательность, кодируемую геном PRL; (ii) проведена экспрессия этой химерной генетической конструкции
Стандартизация препаратов рекомбинантной CRISPR/Cas13a-нуклеазы с использованием РНКазы А с известной активностью
No full textThe approach to characterize preparations of recombinant Cas13a-nuclease in terms of specific collateral activity has been proposed for standardization of enzyme preparations. The standardization of Cas13a preparations by the specific activity may benefit both the development of assays employing Cas13a collateral ribonuclease activity and the optimization of ribonuclease expression, purification, and storage. The approach is based on measurement of the initial rate of a cleavage of specially designed commercially available RNA molecules (“reporters” labelled with a fluorophore and a quencher) by a preparation of recombinant Cas13a-nuclease and commercial RNase A of known activity. This requires the optimization of a molar ratio for the formation of Cas13a complexes with guide RNA as well as the optimization of amount of the RNA target. The use of a synthetic RNA target appears preferable compared with total RNA preparations.Предложен подход к характеризации препаратов рекомбинантной Cas13a-нуклеазы в терминах удельной коллатеральной активности для их стандартизации. Стандартизация препаратов Cas13a-нуклеазы по удельной активности будет полезна как при разработке тестов, использующих коллатеральную рибонуклеазную активность Cas13a, так и для оптимизации процедур экспрессии, очистки и хранения рибонуклеазы. Подход основан на измерении начальной скорости расщепления специально созданных и коммерчески доступных образцов молекул РНК (FQ-репортеров, меченных флуорофором и химическим соединением – гасителем флуоресценции) препаратом рекомбинантной Cas13a-нуклеазы и коммерческой РНКазой А с известной активностью. В качестве предварительного условия необходимо найти оптимальное молярное соотношение для образования комплексов Cas13a с направляющей РНК (нРНК), а также оптимальное количество РНК-мишени. Использование синтетической РНК-мишени представляется предпочтительным по сравнению с препаратами суммарной РНК
Оценка коллатеральной активности CRISPR/Cas13a-рибонуклеазы на биоанализаторе Agilent 2100
Get PDFThe paper describes an original technique for detecting the collateral activity of CRISPR/Cas 13a ribonuclease based on the assessment of ribosomal RNA degradation. The Agilent 2100 bioanalyzer is used as an analyzing device. This approach is an alternative to existing detection methods and has a number of advantages over them in the case when a quantitative assessment of activity is not required. On the example of the test sample, the optimal concentrations and ratios of the components of the reaction mixture, which are necessary to obtain the most indicative result, were determined. The proposed technique can be used for qualitative assessment of the activity of recombinant ribonuclease Cas13a preparations obtained under different conditions of heterologous protein expression and purification, as well as for testing guide RNAs.В работе описывается оригинальная методика детекции коллатеральной активности CRISPR/Cas13a-рибонуклеазы, основанная на оценке деградации рибосомальной РНК. В качестве анализирующего прибора используется биоанализатор Agilent 2100. Данный подход является альтернативой существующим методам детекции и имеет ряд преимуществ по сравнению с ними в том случае, когда не требуется количественная оценка активности. На примере тестового образца определены оптимальные концентрации и соотношения компонентов реакционной смеси, необходимые для получения наиболее показательного результата. Предлагаемая методика может быть использована для качественной оценки активности препаратов рекомбинантной рибонуклеазы Cas13а, полученных при разных условиях гетерологической экспрессии белка и его очистки, а также для тестирования направляющих РНК
Конъюгаты пирофеофорбида а с 17-замещенными стероидными андрогенами. Синтез, молекулярное моделирование, взаимодействие с некоторыми линиями раковых клеток
No full textFive new bifunctional conjugates of pyropheophorbide a with 17-substituted testosterone, dihydrotestosterone and epitestosterone differing in the length of linker (1 – 5) and two new complex conjugates 6 and 7 (containing three functional units: pyropheophorbide a, 17α-substituted testosterone, and lipophylic hexadecyl chain, connected with L-lysine joining block) were synthesized. Mutual influence of steroidal and macrocyclic fragments in conjugates (1 – 7) was established by analysis of 1H NMR spectra and molecular models of conjugates. Studies of interaction of conjugates 1 – 5 with prostate carcinoma cells revealed that their uptake and internalization were dependent on the structure of conjugates, particularly on the stereochemical configuration of 17-hydroxyl group in steroidal moiety, and the length of linker connecting pyropheophorbide a with steroid fragments. Conjugates 1 – 5 significantly decreased the growth and proliferation of LNCaP and PC-3 cells. The highest anti-proliferative activity demonstrated by epitestosterone derivative 3, comprising short linker. Irradiation of labeled cells with light (λ = 660 nm) was significantly increased cytotoxicity. Trifunctional conjugates 6 and 7 easily formed mixed micells with phosphatidyl choline and pluronic F68; these mixed micelles efficiently internalized by human hepatocarcinoma Hep G2 cells. The binding of conjugates 6 and 7 in the form of mixed micelles to Hep G2 cells depended on the conjugate structure, rather than on the method of solubilization.Были синтезированы пять новых бифункциональных конъюгатов пирофеофорбида а с 17-замещенными тестостероном, дигидротестостероном и эпитестостероном, различающихся длиной линкера (1–5), и два новых комплексных конъюгата 6 и 7 (содержащие три функциональные группы: пирофеофорбид а, 17α-замещенный тестостерон и липофильная гексадецильная цепь, связанные между собой L-лизиновым блоком). Анализом спектров 1H ЯМР и молекулярных моделей конъюгатов 1–7 установлено взаимное влияние стероидного и макроциклического фрагментов. Исследование взаимодействия конъюгатов 1–5 с культурами клеток карциномы предстательной железы показало, что их поглощение и интернализация зависят от структуры конъюгата, в частности, от стереохимической конфигурации 17-гидроксильной группы в стероидной части и длины линкера, соединяющего пирофеофорбид а со стероидным фрагментом. Конъюгаты 1–5 значительно снижали рост и пролиферацию клеток LNCaP и PC-3 при 96-часовой инкубации; наиболее высокой антипролиферативной активностью обладало производное эпитестостерона с коротким линкером 3. Облучение обработанных конъюгатами клеток светом (λ = 660 нм) значительно повышало цитотоксичность. Трифункциональные конъюгаты 6 и 7 легко образовывали смешанные мицеллы с фосфатидилхолином и плюроником F68; данные смешанные мицеллы эффективно интернализовались клетками гепатокарциномы человека Hep G2. Связывание конъюгатов 6 и 7 в виде смешанных мицелл с клетками Hep G2 зависело от структуры конъюгата и не зависело от способа его солюбилизации
Выбор наиболее эффективного протокола выделения иммуноглобулинов Y из желтка куриного яйца
Get PDFFour protocols of immunoglobulin Y extraction and purification from hen egg yolk were compared and the optimal one was chosen from the viewpoint of the purity and yield of the final protein preparation. The following protocols were tested: 1) three-step treatment of the yolk substance with caprylic acid; 2) delipidation with dextran-sulfate followed by sodium sulfate fractionation; 3) removal of lipids via diluting by acidified water followed by sodium sulfate fractionation and 4) purification of immunoglobulins with the use of egg yolk freezing-thawing. Protein yields were assessed as amounts of the total protein in the final immunoglobulin preparations; purity was assessed via polyacrylamide gel electrophoresis in denaturing (reducing and non-reducing) conditions. The protocol of the immunoglobulin Y extraction with the removal of lipids via diluting by acidified water followed by sodium sulfate fractionation was considered as the optimal one, with regard to the ratio between the protein yield and immunoglobulin preparation purity. This protocol can be employed both for the preparation of immunoglobulin Y samples for further affinity purifications of specific antibodies for research purposes and for the production of immunoglobulins Y as pharmaceutics.Проведена сравнительная характеристика четырёх протоколов выделения и очистки иммуноглобулинов Y из желтка куриного яйца и выбран оптимальный из них, с точки зрения чистоты и выхода конечного препарата белка. Были апробированы следующие протоколы: 1) трехступенчатая обработка субстанции яичного желтка каприловой кислотой, 2) делипидизация декстрансульфатом с последующим высаливанием иммуноглобулинов Y сульфатом натрия, 3) удаление липидов при разбавлении подкисленной водой с последующим высаливанием иммуноглобулинов сульфатом натрия и 4) очистка антител с применением замораживания-оттаивания яичного желтка. Выходы по белку оценивали по количеству общего белка в конечных препаратах иммуноглобулинов, а чистоту – методом электрофореза в денатурирующих (восстанавливающих и невосстанавливающих) условиях. По соотношению выхода белка и чистоты препарата иммуноглобулинов оптимальным был признан протокол выделения с удалением липидов при разбавлении подкисленной водой с последующим высаливанием иммуноглобулинов Y сульфатом натрия. Данный протокол может быть использован как для подготовки препарата иммуноглобулинов Y для последующей аффинной очистки специфичных антител, так и для получения препаратов иммуноглобулинов Y в качестве фармацевтических препаратов
Исследование чувствительности к протеолизу полноразмерной и укороченной форм рекомбинантной реналазы человека, экспрессированных в прокариотической системе
Get PDFRenalase (RNLS) is a flavoprotein; its N-terminal peptide (amino acid residues 1-17) performs various important functions. Inside cells, it is involved in the Rossmann fold formation (residues 2-35), which is necessary for the binding of the FAD cofactor and the manifestation of the enzymatic activity of RNLS as a FAD-dependent oxidoreductase (EC 1.6.3.5). When RNLS is secreted into the extracellular space, this peptide is cleaved off, and the resulting truncated extracellular RNLS can no longer bind FAD and, therefore, numerous effects described in the literature are carried out by non-catalytic mechanisms. In this work, we have investigated the sensitivity to trypsinolysis of two recombinant forms of human RNLS expressed in prokaryotic cells: (a) full-length RNLS containing the FAD cofactor; (b) a truncated RNLS lacking the 1-17 N-terminal peptide (truncatedRNLS, tRNLS) unable to bind the FAD cofactor. Trypsin (1 unit/20 μL of medium) effectively cleaved both forms of renalase (RNLS and tRNLS). When exposed to a lower concentration of trypsin (0.1 U/20 μL of medium), full length RNLS was more trypsin resistant than tRNLS. We suggest that the different sensitivity of RNLS and tRNLS is apparently determined by the presence of the FAD cofactor in the full-length recombinant protein, which contributes to the formation of a spatial structure that is more resistant to the action of certain proteases.Реналаза (RNLS) – флавопротеин, N-концевой пептид которого (аминокислотные остатки (а.о.) 1-17) выполняет ряд важных функций. В клетках он участвует в формировании укладки Россмана (2-35 а.о.), необходимой для связывания кофактора FAD и проявления ферментативной активности RNLS в качестве FAD-зависимой оксидоредуктазы (КФ 1.6.3.5). При секреции RNLS во внеклеточное пространство этот пептид отщепляется, а образующаяся укороченная внеклеточная RNLS уже не может связывать FAD, и поэтому многочисленные эффекты, описанные в литературе, осуществляются некаталитическими механизмами. В данной работе мы исследовали чувствительность к трипсинолизу двух рекомбинантных форм RNLS человека, экспрессированных в прокариотических клетках: (а) полноразмерной RNLS, содержащей кофактор FAD; (б) укороченной RNLS, лишенной N-концевого пептида 1-17 (truncated RNLS, tRNLS), неспособной связывать кофактор FAD. Трипсин (1 ед./20 мкл среды) эффективно расщеплял обе формы реналазы (RNLS и tRNLS). При воздействии более низкой концентрации трипсина (0.01 ед./20 мкл среды) полноразмерная RNLS была более устойчива к трипсину, чем tRNLS. Мы предполагаем, что различная чувствительность RNLS и tRNLS, по-видимому, определяется присутствием кофактора FAD в полноразмерном рекомбинантном белке, который способствует формированию пространственной структуры, более устойчивой к действию некоторых протеаз