University of Beira Interior
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Desenvolvimento Experimental de um Dispositivo para Aproveitamento de Energia das Ondas no Arquipélago dos Açores
No full textEste trabalho trata do desenvolvimento de um sistema de recuperação de energia
das ondas que seja capaz de fornecer electricidade a pequenas comunidades insulares, como
as do arquipélago dos Açores. O tema do trabalho enquadra-se dentro das metas definidas
pelas directivas estabelecidas pela União Europeia, complementadas com as directivas
Nacionais para o sector energético. Numa primeira fase é analisado o potencial energético
das ondas, dedicando especial atenção ao grupo Ocidental do arquipélago. Após uma
revisão das principais tecnologias de recuperação de energia das ondas actualmente
existentes, o dispositivo atenuador de tubo distensível faz objecto do nosso estudo. Baseado
no conceito Anaconda, o atenuador de tubo distensível é constituído por um tubo de
borracha flutuante cheio de água, cuja proa é fechada por um nariz alinhado segundo a
direcção das ondas incidentes. A parte traseira do tubo está acoplada a uma chaminé
vertical, de secção circular, através de um cotovelo de 90°. A interacção das ondas com o
tubo pressurizado dá origem a pulsos de pressão no seu interior que se deslocam em
direcção à chaminé vertical, fazendo oscilar uma coluna de água (OWC) dentro desta. As
oscilações são convertidas em energia de pressão numa câmara pneumática, em cujo topo
pode ser instalada uma turbina de ar que acciona um gerador eléctrico. A investigação
realizada é essencialmente experimental, com base no ensaio em tanque de ondas de dois
modelos do dispositivo às escalas 1:50 e 1:20. As condições geradas no tanque de ondas
reproduzem aproximadamente o clima de ondas na Ilha do Corvo, Açores. O desempenho
deste dispositivo é analisado nestas condições e validado com resultados padrão para outros
dispositivos, disponíveis na literatura. O desempenho do sistema com e sem o tubo
instalado é também comparado, por forma a avaliar as vantagens introduzidas pelo tubo
distensível. Os efeitos não-lineares e de escala são posteriormente discutidos. Dando
seguimento às estratégias para melhorar o desempenho do sistema, que vêm sendo
introduzidas desde 2014, foram ainda modeladas três situações reais: um sistema deste tipo
fixo a uma estrutura em treliças assente no fundo do mar, o mesmo sistema equipado com
uma parede reflectora junto à boca da OWC ou equipado com um canal de focagem de fundo
inclinado. O estudo realizado permite demonstrar que o tubo distensível acoplado a um
sistema OWC é viável e apresenta vantagens substanciais relativamente a muitos dos
sistemas que se encontram actualmente numa fase de desenvolvimento pré-comercial.This work deals with the development of a wave energy device that is capable of
supplying electricity to small island communities like the ones of the Azores archipelago.
This subject is in line with the goals defined by the European Union’s directives,
complemented by the National directives for the energy sector. Firstly the energetic
potential of ocean waves is analysed, with special interest in the Occidental group of the
Azorean archipelago. A review of the main wave energy technologies is then accomplished,
and the distensible tube wave attenuator device becomes the focus of our study. Based on
the Anaconda concept, this device makes use of a long rubber tube, filled with water, whose
nose is closed and aligned head to the incident waves. Its stern is coupled to a vertical
circular shaft by means of a 90° elbow. The interaction of the waves with the tube induces
pressure bulges inside it that travel along its length towards the vertical shaft, giving rise to
oscillations of a water column (OWC) in the shaft. These oscillations are converted into
pressure variations in a pneumatic chamber, on top of which an air turbine driving an
electric generator can be installed. Given the robustness of the rubber tube and the
development stage of the energy conversion technologies used, this system has the potential
to reduce the investment and operational costs of wave energy utilization. The present
investigation is mainly experimental and is based on the testing of a model of this device in
wave-tank, at 1:50 and 1:20 model scales. The wave conditions generated in the tank
approximately reproduce the wave climate at Corvo island, which is part of the Occidental
group of the Azores. The device performance is analysed under these conditions and later
validated against benchmark results that are available in the literature, obtained with other
devices. To assess the advantages of using a distensible tube, a comparison between the
performance of the device with and without the tube in place is also accomplished. Nonlinear
and scale effects are then discussed. In addition, following the performance
enhancement strategies that have been studied since 2014, three real situations where
considered: the system fixed to a bottom-standing jacket structure, the same system
equipped with a reflecting wall at the OWC mouth, or equipped with a focusing channel of
slopped bottom profile. This study demonstrates that the distensible tube system coupled
with an OWC is viable and presents significant advantages relative to several systems that
have currently achieved a pre-commercial stage of development
In situ formation of alginic acid‐gold nanohybrids for application in cancer photothermal therapy
No full textGold-based nanoparticles present excellent optical properties that propelled their widespread application in biomedicine, from bioimaging to photothermal applications. Nevertheless, commonly employed manufacturing methods for gold-based nanoparticles require long periods and laborious protocols that reduce cost-effectiveness and scalability. Herein, a novel methodology was used for producing gold-alginic acid nanohybrids (Au-Alg-NH) with photothermal capabilities. This was accomplished by promoting the in situ reduction and nucleation of gold ions throughout a matrix of alginic acid by using ascorbic acid. The results obtained reveal that the Au-Alg-NHs present a uniform size distribution and a spike-like shape. Moreover, the nanomaterials were capable to mediate a temperature increase of ≈11°C in response to the irradiation with a near-infrared region (NIR) laser (808 nm, 1.7 W cm−2). The in vitro assays showed that Au-Alg-NHs were able to perform a NIR light-triggered ablation of cancer cells (MCF-7), being observed a reduction in the cell viability to ≈27%. Therefore, the results demonstrate that this novel methodology holds the potential for producing Au-Alg-NH with photothermal capacity and higher translatability to the clinical practice, namely for cancer therapy.Foundation for Science and Technology, Grant/Award Numbers: SFRH/BD/144680/2019,2022.14608.BD,UIDB/00709/2020;EuropeanRegionalDevelopmentFund,Grant/AwardNumbers:CENTRO-01-0145-FEDER-028989,POCI-01-0145-FEDER-031462info:eu-repo/semantics/publishedVersio
Real-time optimization of wing drag and lift performance using a movable leading edge
No full textA real-time optimization strategy can provide any system with a considerable boost in performance on the fly, which in real-world applications can be translated to lower energy consumption or higher efficiency. This study investigates the particular case of using real-time optimization to improve wing aerodynamic performance with a dynamically activated deflectable leading edge. Its activation aims to minimize drag and maximize lift and is governed by real-time and gradient-based optimization. An extension to a classic method is suggested to enhance gradient estimation accuracy. Experimental data are obtained at a Reynolds number of
with the wing fixed at five positions. For each of these positions, optimal leading-edge deflections are found. The results indicate that deflecting the leading edge has a negligible impact on drag and lift before the stall onset. However, the reduction in the pitching moment cannot be ignored. When the wing is experiencing a proper stall, the movable leading edge yields remarkable enhancements, with the lift being approximately raised by 45% together with a substantial increase in the critical angle of attack. The findings highlight the potential of real-time optimization in experimental aerodynamic studies, reinvigorating its application in improving aircraft performance.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) e Brazilian National Council for Scientific and Technological Development (CNPq Grant Nos. 306824/2019-1 and #303884/2021-5).info:eu-repo/semantics/publishedVersio
Inflammatory agent lipopolysaccharide actions in human prostate cells: A role as a procarcinogen factor?
No full textLipopolysaccharide (LPS) is a well-known inflammatory agent capable of influencing
several hallmarks of cancer, such as cell proliferation, migration and metabolism. Also,
it has been established that LPS deregulates cell proliferation, migration and invasion in
prostate cancer (PCa) cells. However, its effect in the metabolic reprogramming of PCa
cells remains largely unknown. The present dissertation aims to investigate the effect of
LPS in the metabolic reprogramming of PCa cells and the interplay of this effect with
other hallmarks of cancer. Androgen-responsive (22Rv1) and castration-resistant PCa
(CRPC) cells (DU145) were treated with a concentration range of LPS (0 – 1000 ug/ mL)
for 6 and 24 h. PCa cells viability and proliferation were assessed by MTT assay and Ki67 fluorescent immunocytochemistry, respectively. Caspase-3–like activity was used to
evaluate apoptosis. Furthermore, the wound healing assay was used to evaluate
migration. Glucose and fatty acid (FA) consumption, lactate production and nitrite
content were analysed spectrophotometrically. The Oil Red O assay was performed to
evaluate the amount of neutral lipid droplets. The obtained results show that LPS
increased cell viability and proliferation in both PCa cell lines and displayed a timedependent effect on nitrite content and caspase-3-like activity. Additionally, LPS
exposure augmented the migration of androgen-sensitive and CRPC cell lines.
Concerning the glycolytic metabolism, LPS increased lactate production in the androgenresponsive PCa cells, though no alterations were observed in glucose consumption. In
CRPC cells, the treatment with LPS increased glucose consumption and altered lactate
production in a time-dependent manner. Moreover, LPS treatment enhanced the
consumption of FA by DU145 whilst, no alterations were observed in the lipid content in
both PCa cell lines. Altogether, the present findings demonstrate that LPS alters the
behaviour and metabolism of PCa cells, favouring the progression and aggressiveness of
the disease. Therefore, the obtained findings highly support the pro-carcinogenic role of
LPS, advocating the relationship of bacteriome as oncogenic drivers in the tumour
microenvironment and opening new doors to future research regarding the involvement
of LPS in prostate carcinogenesis.Os lipopolissacarídeos (LPS) são agentes inflamatórios reconhecidos, capazes de
influenciar diversos marcos do cancro, como a proliferação celular, migração e
metabolismo. Em células de cancro da próstata (PCa), foi demonstrado que o LPS pode
desregular a sua proliferação, migração e invasão. No entanto, não se sabe qual o efeito
do LPS na reprogramação metabólica deste cancro. A presente dissertação tem como
objetivo investigar o efeito do LPS na reprogramação metabólica das células de PCa e a
importância deste efeito na desregulação de outros marcos do cancro. Linhas celulares
de PCa responsivas a androgénios (22Rv1) e resistentes à castração (DU145; CRPC)
foram tratadas com diferentes concentrações de LPS (0 – 1000 ug/mL) durante 6 e 24
h. A viabilidade e a proliferação celular foram avaliadas pelo ensaio de MTT e
imunocitoquímica fluorescente Ki-67, respetivamente. O ensaio de atividade da caspase3 foi utilizado para avaliar a apoptose. Para além disso, avaliou-se a migração celular
através do ensaio de wound healing. O consumo de glucose, produção de lactato e teor
de nitritos foram avaliados espectrofotometricamente. O ensaio Oil Red O foi realizado
para avaliar a quantidade de gotículas lipídicas neutras. Os resultados obtidos
demonstram que o LPS aumenta a viabilidade e proliferação das células de PCa, e que
altera o teor de nitritos e a atividade da caspase-3 de uma maneira dependente do tempo.
Também se verificou que a exposição ao LPS aumenta a migração da linha celular
responsiva aos androgénios e da linha celular CRPC. Em relação ao metabolismo
glicolítico, o LPS aumentou a produção de lactato das células de PCa responsivas a
androgénios, embora não tenham sido observadas alterações no consumo de glucose.
Nas células de CRPC, o tratamento com LPS aumentou o consumo de glucose e alterou
a produção de lactato de uma forma dependente do tempo. O tratamento com LPS
aumentou o consumo dos ácidos gordos na linha celular DU145, no entanto, não foram
observadas alterações no conteúdo lipídico em ambas as linhas celulares em estudo.
Globalmente, os resultados obtidos demonstram que o LPS altera o comportamento e o
metabolismo das células PCa, favorecendo a progressão e agressividade da doença. Para
além disso, os resultados obtidos apoiam fortemente a hipótese de que o LPS pode atuar
como um agente pró-carcinogénico no PCa, defendendo uma ação oncogénica para o
bacterioma presente no microambiente tumoral e abrindo assim novas portas para
investigações futuras sobre a sua importância na carcinogénese prostática
Development and characterization of PLGA- Gold nanocapsules for combinatorial therapy of cancer
No full textCancer constitutes a major public health issue and is the second cause of death
worldwide. Currently, conventional treatments like radiation and chemotherapy
encounter serious drawbacks and cannot, often, provide satisfactory outcomes, mainly
due to the limited therapeutic efficacy and considerable side effects. Given these
limitations, the development of new and more effective cancer treatments, such as
immunotherapy, gene therapy, and hyperthermia, has attracted much attention from the
scientific and medical communities. Hyperthermia is a promising approach to improve
cancer treatment, and its combination with nanotechnology has been explored to create
more specific and effective therapeutic modalities, such as photothermal therapy (PTT).
The PTT mediated by nanoparticles leverages the capacity of certain nanomaterials to
convert light into heat, creating a localized temperature increase. This event can then be
harnessed for therapeutic purposes by inducing the death of cancer cells or increasing
their sensitivity to other therapeutic agents.
Gold nanoparticles are one of many types of nanomaterials that can be explored to
mediate a photothermal effect. Moreover, the gold nanoparticles can also be tailored for
drug delivery and act as contrast agents in the conventionally used imaging techniques.
Nevertheless, the innate therapeutic potential of gold nanoparticles is hindered by their
high reactivity towards thiol groups and photodegradation events.
The work plan of my Master’s dissertation aimed to develop and optimize the synthesis
of PLGA/Gold nanocapsules with the capacity to act as photothermal agents and drug
carriers in cancer therapy. The PLGA poly(lactic-co-glycolic acid) was selected due to its
versatility and well-known biological compatibility, which have led to the approval of
several PLGA-based drug delivery systems and medical devices for clinical application
by the regulatory authorities. The production of the PLGA/Gold nanocapsules was
achieved via a double emulsion methodology (water-in-oil-in-water (W/O/W)
emulsion), where gold nanospheres with 19 nm were added to the first water phase.
During this work, three different formulations were tested, formulation A (following a
normal methodology for producing PLGA nanocapsules), formulation B (higher volume
of the first water phase, i.e., higher amount of gold nanospheres), and formulation C
(higher volume of the oil phase). All formulations presented a size of ˜350 nm and a
negative surface charge (i.e., -24.9, -19.9, and –11.7 mV for formulations A, B, and C,
respectively). Moreover, upon NIR laser irradiation, the PLGA/Gold nanocapsules mediated an increase in the temperature of 11.7ºC (Formulation A), 9.3ºC (Formulation
B), and 10.2ºC (Formulation C). This photothermal capacity was further confirmed by
Scanning Electron Microscopy (SEM) microscopy with the destruction of the polymeric
nanocapsules. Additionally, the preliminary results for the Encapsulation Efficiency
(E.E.) show that only ˜50% AO is encapsulated in the PLGA/Gold nanocapsules,
demonstrating the capacity to act as a drug carrier. In turn, preliminary cell studies
showed that all the formulations are biocompatible both with healthy (fibroblasts) and
carcinogenic (cervical cancer) cells, even at concentrations of 400 µg/mL. Furthermore,
assays performed in the HeLa cells showed that the combination of the photothermal
effect and AO delivery results in an antitumoral effect, reducing the viability of HeLa cells
to less than 60%.
In summary, the present findings confirm the potential of these PLGA/Gold
nanocapsules for being applied in cancer therapy. Nevertheless, in the future, the
therapeutic potential of PLGA/Gold nanocapsules will also be evaluated in more complex
in vitro models, namely on tumor spheroids, characterizing both the uptake and the
cytotoxic capacity. Moreover, according to the data obtained from these assays, the reengineering of the PLGA/Gold nanocapsules can also be considered namely the
optimization of the photothermal effect and drug encapsulation efficiency.O cancro é um dos principais problemas de saúde pública e é a segunda causa de morte
a nível mundial. Atualmente, os tratamentos convencionais, como a radioterapia e a
quimioterapia, apresentam várias desvantagens e na maior parte dos casos não
proporcionam resultados satisfatórios, principalmente devido à sua baixa eficácia
terapêutica e aos efeitos secundários severos que têm associados. Tendo em conta estas
limitações, o desenvolvimento de novos tratamentos mais eficazes, como a
imunoterapia, a terapia genética e a hipertermia, tem atraído a atenção das comunidades
científica e médica.
A hipertermia é uma abordagem promissora para melhorar o tratamento do cancro, e a
sua combinação com a nanotecnologia tem sido explorada para criar modalidades
terapêuticas mais específicas e eficazes, como a terapia fototérmica (PTT). A PTT
mediada por nanopartículas aproveita a capacidade de certos nanomateriais para
converter a luz em calor, produzindo um aumento de temperatura localizado. Este evento
pode então ser aproveitado para fins terapêuticos, induzindo a morte de células
cancerígenas ou aumentando a sua sensibilidade a outros agentes terapêuticos.
As nanopartículas de ouro são um dos muitos tipos de nanomateriais que têm sido
explorados para mediar um efeito fototérmico. Além disso, as nanopartículas de ouro
podem também ser adaptadas para a administração de medicamentos e atuar como
agentes de contraste nas técnicas de imagiologia convencionalmente utilizadas. No
entanto, o potencial terapêutico inato das nanopartículas de ouro é dificultado pela sua
elevada reatividade com grupos tiol e à sua fotodegradação.
Esta dissertação teve como objetivo desenvolver e otimizar a síntese de nanocápsulas de
PLGA/ouro com a capacidade de atuar como agentes fototérmicos e transportadores de
fármacos para aplicação na terapia do cancro. O poli(ácido lático-co-ácido glicólico)
(PLGA) foi selecionado devido à sua versatilidade e conhecida compatibilidade biológica,
que levou à aprovação de vários sistemas de libertação de fármacos e dispositivos
médicos baseados em PLGA para aplicação clínica, pelas autoridades reguladoras. A
produção das nanocápsulas de PLGA/ouro foi conseguida através de uma metodologia
de emulsão dupla (emulsão água-em-óleo-em-água (W/O/W)), onde nanoesferas de
ouro com 19 nm foram adicionadas à primeira fase aquosa. Durante este trabalho, foram
testadas três formulações diferentes, a formulação A (seguindo uma metodologia normal
para a produção de nanocápsulas de PLGA), a formulação B (maior volume da primeira
fase aquosa, ou seja, maior quantidade de nanoesferas de ouro) e a formulação C (maior
volume da fase oleosa). Todas as formulações apresentaram um tamanho de ˜350 nm e uma carga superficial negativa (-24,9, -19,9 e -11,7 mV para a formulação A, B e C,
respetivamente). Além disso, após a irradiação com laser NIR, as nanocápsulas de
PLGA/ouro provocaram um aumento da temperatura de 11,7ºC (Formulação A), 9,3ºC
(Formulação B) e 10,2ºC (Formulação C). Esta capacidade fototérmica foi ainda
confirmada por microscopia eletrónica de varrimento, observando-se a destruição das
nanocápsulas poliméricas. Além disso, os resultados preliminares para a Eficiência de
Encapsulação (E.E.) mostram que apenas ˜50% da Acridine Orange (AO) é encapsulado
nas nanocápsulas de PLGA/ouro, demonstrando a capacidade de atuar como um
transportador de fármacos. Por sua vez, estudos celulares preliminares mostraram que
todas as formulações são biocompatíveis tanto para células saudáveis (fibroblastos)
como para células cancerígenas (cancro do colo do útero), mesmo quando concentrações
de 400 µg/mL são usadas. Além disso, os ensaios efectuados nas células HeLa
mostraram que a combinação do efeito fototérmico e da administração de laranja de
acridina resulta num efeito antitumoral, reduzindo a viabilidade das células HeLa para
menos de 60%.
Em resumo, os resultados obtidos confirmam o potencial das nanocápsulas de
PLGA/ouro para serem aplicadas na terapia do cancro. No entanto, no futuro, o potencial
terapêutico das nanocápsulas de PLGA/ouro será também avaliado em modelos in vitro
mais complexos, nomeadamente em esferóides tumorais, caracterizando tanto a
internalização como a sua capacidade citotóxica. Além disso, de acordo com os dados
obtidos nestes ensaios, a alteração das nanocápsulas de PLGA/Ouro pode também ser
considerada, nomeadamente a otimização do efeito fototérmico e da eficiência de
encapsulamento do fármaco
Selective targeting of B-MYB G-quadruplex using fluorescent probes
No full textProto-oncogenes are essential genes in cells that, when altered, become oncogenes and
can contribute to cancer development. An example is B-MYB, which regulates cell growth
and survival and is often abnormal in cancers like lung cancer. Studying B-MYB is
challenging because it has proven difficult to target with drugs.
These proto-oncogenes contain DNA sequences with therapeutic potential called Gquadruplexes (G4s). These structures play roles in genetic regulation and can be targets
for cancer treatment.
Commonly, G4 visualization involves the use of specific antibodies or small fluorescent
molecules like acridine derivatives as probes. However, these methods have limitations
as they impact all G4s, making it challenging to grasp the distinct functions of each one.
In this study, a specific G4 within the B-MYB gene was investigated. To do this, a probe
was designed to identify it, combining an acridine derivative ligand with a DNA segment
complementary to the target sequence, capable of hybridizing with the sequence adjacent
to the G4 under study. This probe allowed us to study this G4 formed in the promoter
region of the B-MYB oncogene.
The results provided by biophysical studies showed that the ligands effectively stabilized
the target G4 structure, have a moderate affinity towards it, induced a change in its
topology, and have increased fluorescence in its presence. Biophysical studies of the full
target (G4+ oligonucleotide tail) were also performed, and the presence of the
oligonucleotide did not hinder G4 formation. The probe synthesis was successfully
achieved as well as its quantification. Cellular studies demonstrated strong colocalization between the target sequence and the developed probe.Proto-oncogenes são genes essenciais às células que, quando alterados se tornam
oncogenes que podem contribuir para o desenvolvimento do cancro. Um exemplo é o BMYB, que regula o crescimento e sobrevivência das cancerígenas do pulmão. Estudar o
B-MYB é desafiante, pois tem-se revelado difícil de ser alvo de fármacos.
Os proto-oncogenes contêm sequências de DNA com potencial terapêutico chamadas Gquadruplexes (G4s). Estas estruturas desempenham papéis na regulação genética e
podem ser alvos para tratar o cancro.
Para estudar os G4s, normalmente são usados anticorpos ou ligandos fluorescentes,
como os derivados da acridina, que têm propriedades úteis à sua deteção. No entanto,
estes métodos têm limitações, pois afetam todos os G4s, tornando difícil compreender as
funções específicas de cada um.
Neste estudo, foi estudado um G4 específico no gene B-MYB. Para isso, sintetizou-se uma
sonda para identificá-lo, associando um ligando derivado de laranja de acridina com um
segmento de DNA complementar à sequência alvo capaz de hibridizar com a sequência
adjacente à estrutura do G4 em estudo. Esta sonda permitiu-nos estudar este G4 formado
na região promotora do oncogene B-MYB num ambiente fisiológico com precisão.
Os resultados obtidos pelos estudos biofísicos mostraram que os ligandos efetivamente
estabilizaram a estrutura G4 alvo, demonstrando uma afinidade moderada, induziram
uma alteração na sua topologia e há um aumento da sua fluorescência. Foram também
realizados estudos biofísicos do alvo completo (G4 + cauda de oligonucleotido), e a
presença do oligonucleotido não impediu a formação da G4. A síntese da sonda foi bemsucedida, assim como a sua quantificação. Estudos celulares demonstraram colocalização entre a sequência alvo e a sonda desenvolvida
G-quadruplex aptamer-functionalized liposomes for lung cancer therapy
No full textLung cancer (LC) has the greatest impact on mortality rates worldwide, particularly nonsmall cell lung cancer (NSCLC). The treatment of NSCLC depends on the stage of the
disease and may involve a combination of surgery, chemotherapy, radiotherapy or
immunotherapy. However, these therapies have some limitations, since that most
patients develop resistance to treatments and also have side effects. In this sense, the
aptamers have emerged as a promising strategy in delivery systems for NSCLC therapies.
Aptamers are known as chemical antibodies since they can bind to proteins with high
specificity. In addition, they have several advantages over antibodies, such as great
stability and lower immunogenicity. AT11-L2 is a derivative of the AS1411 aptamer that
contain a guanine-rich sequence capable of adopting a G-quadruplex (G4) structure and
therefore targets nucleolin (NCL), a protein overexpressed in the cell membrane of
NSCLC cells. Thus, the aim of this study was to develop two liposomal systems containing
encapsulated doxorubicin and BRACO-19 and AT11-L2 on the surface to target NCL. To
this end, the structure of AT11-L2 was first characterized by biophysical studies, and then
the interaction of the aptamer with the ligands was studied through molecular dynamics
simulations. In addition, the potential of the ligands to stabilize AT11-L2 was also
assessed by biophysical studies. Liposomes were then synthesized and characterized.
Finally, the selectivity and cellular uptake of the functionalized liposomes containing the
compounds were tested on human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells (A549)
and human fetal lung fibroblast cells (MRC-5). The results showed that AT11-L2 adopts
a G4 structure in the presence of K+ and when associated with PhenDC3 through p-p
stacking interactions, increases its stability. In addition, the AT11-L2/NCL complex was
shown to have a high affinity with a KD in the nanomolar range. In vitro studies showed
that functionalized liposomes containing BRACO-19 and doxorubicin were selectively
internalized by cancer cells, with greater selectivity being recorded for liposomes with
doxorubicin. These results show the therapeutic potential of liposomes functionalized
with AT11-L2 against NSCLC.O cancro do pulmão (CP) é uma das doenças oncológicas com maior impacto na taxa de
mortalidade em todo o mundo, particularmente o cancro do pulmão de não pequenas
células (CPNPC). O tratamento do CPNPC depende do estadio da doença e pode envolver
uma combinação de terapias, tais como cirurgia, quimioterapia, radioterapia ou
imunoterapia. No entanto, algumas abordagens apresentam limitações, uma vez que a
maioria dos doentes desenvolvem resistência aos tratamentos e também apresentam
efeitos secundários. Neste sentido, os aptameros surgiram como uma ferramenta
promissora em sistemas de entrega de fármacos para terapias direcionadas ao CPNPC.
Os aptameros são conhecidos como anticorpos químicos, uma vez que se podem ligar a
proteínas com elevada especificidade. Além disso, têm várias vantagens sobre os
anticorpos apresentando maior estabilidade e menor imunogenicidade. O AT11-L2 é um
derivado do aptamero AS1411, formado por uma sequência rica em guaninas capaz de
adotar uma estrutura G-quadruplex (G4) e tem como alvo a nucleolina (NCL), uma
proteína sobre expressa na membrana celular das células cancerigenas nomeadamente
em CPNPC. Assim, o objetivo deste estudo foi desenvolver dois sistemas lipídicos
contendo doxorrubicina e BRACO-19 encapsulados e AT11-L2 na superfície. A estrutura
do AT11-L2 foi primeiramente caracterizada por estudos biofísicos, e seguidamente a
interação do aptamero com os ligandos foi estudada através de simulações de dinâmica
molecular. O potencial dos ligandos para estabilizar o AT11-L2 foi também avaliado por
diferentes estudos biofísicos. Seguidamente, os lipossomas foram sintetizados e
caracterizados. Finalmente, a seletividade e a absorção celular dos lipossomas
funcionalizados contendo os compostos em estudo foram determinadas em células de
adenocarcinoma epitelial basal alveolar humano (A549) e em células de fibroblastos
pulmonares fetais humanos (MRC-5). Os resultados mostraram que o AT11-L2 adopta
uma estrutura G4 na presença de K+ e a sua estabilidade aumenta na presença do ligando
de G4, PhenDC3, que interage com a estrutura de G4 do aptamero através de interacções
de empilhamento p-p. Além disso, o complexo AT11-L2/NCL demonstrou ter uma
elevada afinidade com um valor de KD da ordem do nanomolar. Os estudos in vitro
mostraram que os lipossomas funcionalizados contendo BRACO-19 e doxorrubicina são
seletivos e capazes de internalizar em células cancerígenas, tendo sido observada uma
maior seletividade para os lipossomas com doxorrubicina. Estes resultados mostram o
potencial terapêutico dos lipossomas funcionalizados com AT11-L2
O efeito da exposição de ftalatos na endometriose
No full textIntrodução: A endometriose é uma doença ginecológica crónica que afeta cerca de 10%
das mulheres em idade reprodutiva e está relacionada principalmente com a dor pélvica e a
infertilidade. Sua origem é complexa e envolve fatores imunológicos, hormonais, genéticos
e ambientais. O estrogénio tem um papel central na endometriose, e há evidências
crescentes de que os disruptores endócrinos (EDC), como os ftalatos, possam contribuir
para seu desenvolvimento. Os ftalatos são EDCs amplamente utilizados em produtos de
consumo e industriais e têm potencial para contaminar o ambiente. Eles podem entrar no
corpo por ingestão, absorção cutânea e inalação, onde são metabolizados e excretados na
urina. Devido às suas propriedades estrogénicas, os ftalatos podem alterar os níveis
hormonais e afetar tecidos dependentes de estrogénio, como na endometriose.
Objetivos: Esta revisão bibliográfica visa determinar se há uma relação causal entre a
exposição a ftalatos e o desenvolvimento da endometriose, bem como seus possíveis efeitos
na fertilidade, analisando dados epidemiológicos em humanos.
Métodos: Para a realização desta dissertação, procedeu-se a uma pesquisa bibliográfica
em diferentes bases de dados PubMed, Elsevier, Web of Science, com a seguinte combinação
de termos phthalic acid OR phthalate OR phthalates OR phthalate metabolites AND
endometriosis OR endometrioses OR endometrioma.
Conclusão: A exposição a disruptores endócrinos, como os ftalatos, pode afetar
significativamente a saúde reprodutiva feminina e está associada a um custo anual
significativo para a União Europeia. Embora existam limitações nos estudos atuais, existe
claramente uma associação entre a exposição a ftalatos e a endometriose. Os mecanismos
potenciais para este efeito incluem a interferência dos ftalatos em processos celulares, como
o estresse oxidativo, enzimas inflamatórias e recetores hormonais. Investigações futuras são
importante para travar a progressão e desenvolvimento desta patologia, assim os estudos
futuros devem focar na melhoria das metodologias, no aumento dos tamanhos de amostra
e na investigação dos mecanismos subjacentes. In suma, estratégias de prevenção,
diagnóstico e tratamento da endometriose são prioritárias. Neste sentido, políticas públicas
e recomendações para reduzir a exposição a ftalatos e outros disruptores endócrinos devem
ser implementada o mais cedo possível.Introduction: Endometriosis is a chronic gynecological disease that affects approximately
10% of women of reproductive age and is primarily associated with pelvic pain and
infertility. Its origin is complex and involves immunological, hormonal, genetic, and
environmental factors. Estrogen plays a central role in endometriosis, and there is growing
evidence that endocrine disruptors (EDCs), such as phthalates, may contribute to its
development. Phthalates are EDCs widely used in consumer and industrial products and
have the potential to contaminate the environment. They can enter the body through
ingestion, skin absorption, and inhalation, where they are metabolized and excreted in the
urine. Due to their estrogenic properties, phthalates can alter hormonal levels and affect
estrogen-dependent tissues, such as in endometriosis.
Objectives: This literature review aims to determine whether there is a causal relationship
between phthalate exposure and the development of endometriosis, as well as their possible
effects on fertility, by analyzing epidemiological data in humans.
Methods: To conduct this review, a literature search was carried out in different databases,
such as PubMed, Elsevier, Web of Science, using the following combination of terms:
phthalic acid OR phthalate OR phthalates OR phthalate metabolites AND endometriosis
OR endometrioses OR endometrioma.
Conclusion: Exposure to endocrine disruptors, such as phthalates, can significantly affect
women's reproductive health and is associated with a significant annual cost to the
European Union. Although there are limitations in current studies, there is clearly an
association between phthalate exposure and endometriosis. Potential mechanisms for this
effect include the interference of phthalates in cellular processes, such as oxidative stress,
inflammatory enzymes, and hormonal receptors. Future research is important to curb the
progression and development of this pathology, so future studies should focus on improving
methodologies, increasing sample sizes, and investigating the underlying mechanisms. In
summary, prevention, diagnosis, and treatment strategies for endometriosis are a priority.
In this regard, public policies and recommendations to reduce exposure to phthalates and
other endocrine disruptors should be implemented as soon as possible
Comparative Analysis of the Presence and Decision-Making in Romantic Visual Novels: Influence of Personalization and Sense of Presence
No full textVideogames have historically exerted profound influence on human kind, and with
advancements in technology, the study of their characteristics has become increasingly
intricate. With the rise of virtual reality, personalization and the feeling of presence
have gained unprecedented attention. However, less interactive virtual environments,
such as Visual Novels, are often overlooked, with the role of personalization and the
sense of presence in this medium being even more unknown. By integrating moral
elements to decision-making and creating both personalized and non-personalized
narrative environments, this study identifies mild connections between players’ choice
type that can go hand in hand with increased feeling of presence and personalization. A
study was conducted in which two groups of participants played a decision-making
game, one group in which personal information was collected and integrated into the
narrative (personalization), and another group with no information collected and with
a predefined narrative. Results have shown that participants subject to a personalized
environment may be more prone to conservative choices, however, it is unknown
whether this inclination is a result of an increased feeling of presence. Additionally, age,
genre familiarity, and character attraction are other factors that potentially influence
decision-making.Os videojogos têm exercido historicamente uma influência profunda na humanidade e,
com os avanços tecnológicos, o estudo das suas características tem se tornado cada vez
mais complexo. Com o crescimento da realidade virtual, a personalização e a sensação
de presença têm recebido uma atenção sem precedentes. Contudo, ambientes virtuais
menos interativos, como é o caso das Visual Novels, são frequentemente
negligenciados, sendo ainda mais desconhecido o papel da personalização e da
sensação de presença neste meio. Ao integrar elementos morais nas tomadas de decisão
e criar ambientes narrativos personalizados e não personalizados, este estudo identifica
conexões subtis entre o tipo de escolha dos jogadores que podem estar associadas a um
aumento na sensação de presença e personalização. Foi feito um estudo em que dois
grupos de participantes jogaram um jogo com tomadas de decisão, um grupo no qual
foi recolhida informação pessoal e inserida na narrativa (personalização) e outro grupo
sem recolha de qualquer informação e com uma narrativa pré-definida. Os resultados
mostraram que os participantes sujeitos a um ambiente personalizado poderão ser mais
propensos a escolhas conservadoras, no entanto, é desconhecido se essa inclinação é
resultado de um aumento do sentimento de presença. Além disso, idade, familiaridade
com o género e atração pelas personagens são outros fatores que potencialmente
influenciam a tomada de decisão
Non-canonical DNA secondary structures as a therapeutic strategy for lung cancer
No full textNucleic acids store and control genetic information and, beyond the canonical B-form DNA double helix, can adopt a variety of non-canonical architectures, including G-quadruplex (G4s), i-motifs (iMs), triplexes, R-loops, and Z-DNA/Z-RNA. These structures are widespread across genomes and transcriptomes and play important biological roles (transcription, replication, translation, and genome stability). They are recognized as regulatory hotspots enriched at promoters, enhancers, telomeres, untranslated regions, and viral genomes and their involvement in cancer, viral infection, neurodegeneration, and inflammatory disorders. Their in vivo functions have also opened therapeutic avenues both as drug targets and therapeutic tools. As drug targets, these non-canonical structures can be modulated to alter cellular behavior, while as therapeutic agents, nucleic acids can be engineered to adopt non-canonical folds that bind key cellular partners and exert biological effects. This dual role is unusual for other approaches and positions non-canonical structures at the forefront of modern drug discovery.
These structures are emerging as important tools in oncological research and therapeutic development. Proto-oncogenes encode proteins essential to normal physiology; however, when mutated or amplified become oncogenes, they drive unchecked growth and survival. The transcription factors (TFs) are a particularly important class of proto-oncogenes that bind to DNA and recruit co-regulators, orchestrating broad gene-expression programs. Their sweeping control of transcription makes them powerful cancer drivers but also challenging drug targets. Unlike enzymes with well-defined catalytic pockets, TFs often rely on flexible, intrinsically disordered regions for interactions, contributing to their reputation as “undruggable.” Numerous TFs have been reported as dysregulated in cancer and are frequently correlated with poor prognosis and resistance to chemotherapy. Other TF are gaining relevance, such as B-MYB (MYBL2), a transcription factor from the MYB family required for normal cell-cycle progression, which acts as an oncogene when overexpressed or deregulated.
Functionally, the B-MYB protein serves as a master cell-cycle regulator by integrating into multiprotein assemblies, most notably the DREAM and MMB complexes, that coordinate cell-cycle gene expression. Beyond these physiological functions, B-MYB is upregulated in multiple cancers, such as breast and lung, and its overexpression is correlated with aggressive disease, treatment resistance, and unfavorable prognosis. The molecular mechanisms linking B-MYB to tumorigenesis include gene amplification, cell cycle deregulation, genomic instability, apoptosis suppression, post-transcriptional and post-translational modifications, or can contribute to epithelial-to-mesenchymal transition. Thus, B-MYB TF can be seen as a relevant clinical biomarker and one of the main orchestrators of carcinogenesis; however, until now, no pharmacological therapy against B-MYB has been developed, also related to its “undruggable” profile.
Also, it’s known, by bioinformatic analysis of the human genome, that oncogene promoter regions are G/C rich around transcription start sites (TSS), which allows the formation of structures called G4 or iM. The G4s are formed by the self-association of four guanine bases in a quasi-planar arrangement via Hoogsteen bonds and are described as having a gene regulatory function, namely at the transcriptional level, while the iM is formed by Hoogsteen bonds between protonated and deprotonated cytosines. Motivated by these observations, the central objective of this thesis was to explore alternative routes to target the B-MYB oncogene using non-canonical nucleic-acid structures: first as drug targets and later as therapeutics.
The thesis started by the identification of G-rich sequences at the B-MYB promoter capable of forming G4 structures. The identification of G-rich sequences was performed using the G4Hunter algorithm, and their conservation across mammalian species was also verified. The experimental validation of their formation was performed by combining 10 biophysical and biochemical methods. Later, the in-cell relevance of G4 structures was evaluated employing the G4access method, which reveals that from the predicted sequences, only the most stable one (B-MYB 43R) was shown to be significantly formed in cells, evidencing a potential impact on the transcription of this gene to its location closest to the TSS.
Next, the ability of C-rich sequences to form iM structure was evaluated. Again, the iM-forming sequences were predicted using the G4Hunter algorithm and the experimental validation started by circular dichroism (CD) and nuclear magnetic resonance (NMR) to determine if the sequences fold into an iM structure. Then, stability parameters such as pHT (pH transitional midpoint) were determined by acquiring spectra at different pH values (between pH=5 and pH=8; 0.25-unit increments). The thermal stability and thermodynamic parameters were also calculated using the denaturation and renaturation melting curves. Then, the in-cell formation was assessed using iM-CUT&Tag experiments in HEK293T, which revealed the formation of the iB-MYB 43 that was characterized to have the highest Tm and the highest pHT among the studied sequences. After this characterization, the interaction of small molecules with iB-MYB structures was assessed. As a general tendency, the ligands did not affect the CD spectral shape; however, some of them evidenced changes in secondary structure or thermal destabilization. After evaluating the capacity to form G4 or iM, we continued to validate the G4 formation within a cellular environment using a G4-triggered fluorogenic hybridization probe. This strategy circumvents the limitations of the antibodies and small-molecule probes, which show a lack of structural selectivity labeling diverse DNA and RNA G4s indiscriminately, and cannot specifically target the desired G4. The molecular probe was composed of G4-recognizing light-up ligand (acridine derivative) with an antisense oligonucleotide that hybridizes adjacent region of B-MYB G4. Before probe synthesis using a click chemistry approach, the ligands were photophysically characterized, biophysically evaluated against G4, and further validated spectroscopically and in cells. Cellular studies confirmed the co-localization between the molecular probe and B-MYB G4 in-cell, offering promise for future applications in cancer research in terms of targeted therapies and monitoring of G4.
Although G4s are highly dynamic and topologically diverse, promoter G4s are commonly parallel, whereas antiparallel forms are underreported and less characterized. In earlier work, we identified a B-MYB promoter sequence (B-MYB 26RA), that forms an antiparallel G4. Thus, a biophysical pipeline, starting in solution NMR spectroscopy alongside in-cell NMR studies, was made to predict a three-dimensional model (antiparallel quadruplex-duplex junction) and to assess the formation in a live complex environment of B-MYB 26RA. Interestingly, B-MYB 26RA evidenced an ionic sensitivity to K+ and Na+, increasing their topological dynamics, and demonstrated that, when associated with PhenDC3 ligand, a conformational shift from hybrid to antiparallel topology happens.
Then, we moved to B-MYB 43R G4 to discuss the therapeutic relevance and the capacity to be targeted by small molecules. Thus, using spectroscopic methods, the G4 formation and its interaction with a panel of G4-stabilizing ligands were confirmed. From the tested ligands, PhenDC3 and TMPyP4 demonstrated the highest binding affinity and stabilization and revealed that both ligands inhibited proliferation and migration in two lung cancer cell lines (A549 and H1299), with PhenDC3 showing potent cytotoxic and cytostatic effects. Furthermore, PhenDC3 upregulated B-MYB expression despite its strong phenotypic effects, highlighting the complexity of G4-targeting mechanisms and supporting the growing evidence that ligands do not always downregulate their target genes.
Finally, we explored the use of Polypurine Reverse-Hoogsteen (PPRH) hairpins as an alternative therapeutic approach to target the B-MYB promoter. PPRH are DNA oligonucleotides that fold into intramolecular hairpins and bind complementary polypyrimidine, forming stable DNA triplexes, impeding transcription, and displacing the G-rich strand, inducing G4 formation, enabling dual-level regulation of oncogene expression. Thus, using a bioinformatic tool (TFO Searching Tool), a PPRH was designed against the G4-forming region at the B-MYB promoter (B-MYB 43R), and then experimentally assessed the triplex formation using biophysical methods. The biological effects of designed PPRH, evaluated in lung cellular models (A549, H1299 and MRC-5), demonstrated a low cell viability and clonogenic capacity accompanied by mRNA expression reduction and proteomic profile alterations. Thus, the combination of triplex-based approaches with G4 biology could be a future venue for therapy.
Overall, this thesis establishes non-canonical nucleic-acid structures as both actionable targets and therapeutic agents. As a target, the formation of G4 and iM structures at the promoter region of the B-MYB oncogene; was provided new insights about structure and topological dynamics according to the surrounding environment; was validated their formation in-cell, as well as explored the interaction with small molecules. On the other side, the therapeutic potential was explored using PPRH, which revealed a selective and powerful tool to target B-MYB.
Together, these findings provide fundamental insights and open new avenues for translational research on the B-MYB oncogene.Os ácidos nucleicos armazenam e controlam a informação genética e, para além da dupla hélice de ADN na forma B, podem adotar uma variedade de estruturas não canónicas, incluindo G-quadruplex (G4), i-motifs (iM), triplexes, R-loops e Z-ADN/Z-ARN. Estas estruturas estão disseminadas por genomas e transcriptomas e desempenham papéis biológicos importantes (transcrição, replicação, tradução e estabilidade do genoma). São reconhecidas como “hotspots” regulatórios, enriquecidos em promotores, “enhancers”, telómeros e genomas virais, e o seu envolvimento no cancro, na neurodegeneração e na infeção viral intensificou o interesse pelos seus mecanismos. As suas funções in vivo abriram igualmente novas vias terapêuticas, tanto como alvos farmacológicos como ferramentas terapêuticas. Enquanto alvos, estas estruturas não canónicas podem ser moduladas para alterar o comportamento celular enquanto, como agentes terapêuticos, podem ser concebidos para se ligarem a alvos celulares exercendo efeitos biológicos. Este duplo papel é invulgar noutras abordagens e coloca as estruturas não canónicas na vanguarda da descoberta moderna de fármacos.
Estas estruturas têm vindo a ganhar destaque em várias áreas, sendo a oncologia uma das mais promissoras. Os proto-oncogenes codificam proteínas essenciais para a fisiologia celular normal; no entanto, quando sofrem mutações ou amplificações, transformam-se em oncogenes, promovendo o crescimento e a sobrevivência celulares descontrolados. Os fatores de transcrição (FT) constituem uma classe particularmente importante de proto-oncogenes que se ligam ao ADN e recrutam co-reguladores, orquestrando amplos programas de expressão génica. O seu vasto controlo da transcrição torna-os poderosos motores do cancro, mas também alvos farmacológicos desafiantes. Ao contrário das enzimas com centros ativos bem definidos, os FT dependem frequentemente de regiões flexíveis e intrinsecamente desordenadas para as suas interações, contribuindo para a sua reputação de “undruggable” (de difícil abordagem farmacológica). Muitos FT têm sido descritos como desregulados no cancro e estão frequentemente associados a mau prognóstico e resistência à quimioterapia. Recentemente outro FT tem ganho relevância, como o B-MYB (MYBL2), um fator de transcrição da família MYB necessário para a progressão normal do ciclo celular, que atua como oncogene quando sobre-expresso ou desregulado. Funcionalmente, a proteína B-MYB atua como reguladora-mestre do ciclo celular ao integrar-se em complexos multiproteicos, nomeadamente os complexos DREAM e MMB, que coordenam a expressão génica do ciclo celular. Para além destas funções fisiológicas, o B-MYB encontra-se sobre-expresso em múltiplos cancros, como os da mama e do pulmão, e a sua sobre-expressão está correlacionada com doença agressiva, resistência ao tratamento e prognóstico desfavorável. Os mecanismos moleculares que ligam o B-MYB à tumorgénese incluem amplificação génica, desregulação do ciclo celular, instabilidade genómica, supressão da apoptose e modificações pós-transcricionais e pós-translacionais, podendo ainda contribuir para a transição epitélio-mesênquima. Assim, o FT B-MYB pode ser considerado um biomarcador clínico relevante e um dos principais orquestradores da carcinogénese, no entanto, até ao momento, não foi desenvolvida qualquer terapêutica farmacológica dirigida ao B-MYB, também devido ao seu perfil “undruggable”. Além disso, sabe-se, por análise bioinformática do genoma humano, que as regiões promotoras de oncogenes são ricas em G/C em torno dos locais de início de transcrição (TSS), o que permite a formação de estruturas denominadas G4 ou iM. Os G4 formam-se pela associação de quatro guaninas numa disposição quasi-planar através de ligações de Hoogsteen e têm sido descritos como desempenhando funções reguladoras dos genes, nomeadamente ao nível transcricional, enquanto os iM se formam por ligações de Hoogsteen entre citosinas protonadas e desprotonadas. Assim, o objetivo central desta tese foi explorar vias alternativas para alvejar o oncogene B-MYB utilizando estruturas não canónicas de ácidos nucleicos: primeiro como alvos terapêuticos e, posteriormente, como agentes terapêuticos.
A tese começou por se focar na identificação de sequências ricas em guaninas no promotor de B-MYB, capazes de formar estruturas G4. A identificação destas sequências ricas em guaninas foi realizada com recurso ao algoritmo G4Hunter, tendo sido igualmente verificada a sua conservação em espécies de mamíferos. A validação experimental da sua formação foi efetuada combinando 10 métodos biofísicos e bioquímicos. Posteriormente, a relevância celular das estruturas G4 foi avaliada utilizando o método G4access, que revelou que, das sequências previstas, apenas a mais estável (B-MYB 43R) se mostrou significativamente formada em células, evidenciando um potencial impacto na transcrição deste gene devido à sua localização mais próxima do TSS.
De seguida, avaliou-se a capacidade de sequências ricas em citosinas formarem estruturas iM. Mais uma vez, as sequências formadoras de iM foram previstas usando o algoritmo G4Hunter e a validação experimental iniciou-se por espectroscopias de dicroísmo circular (CD) e ressonância magnética nuclear (RMN) para determinar se as sequências formavam estruturas iM. Depois, parâmetros de estabilidade como o pHT (ponto médio de transição de pH) foram determinados adquirindo espetros a diferentes valores de pH (entre pH=5 e 8, incrementos de 0,25 unidades). A estabilidade térmica e os parâmetros termodinâmicos foram também calculados a partir das curvas de fusão de desnaturação e renaturação. De seguida, a formação destas estruturas em ambiente celular foi avaliada por experiências iM-CUT&Tag em HEK293T, que revelaram a formação de iB-MYB 43, caracterizado por apresentar o Tm mais elevado e o pHT mais alto entre as sequências estudadas. Após esta caracterização, avaliou-se a interação de moléculas de baixo peso molecular com as estruturas iB-MYB. Como tendência geral, as moléculas de baixo peso molecular não afetaram a forma do espetro de CD; no entanto, alguns evidenciaram alterações na estrutura secundária ou desestabilização térmica.
Depois de avaliar a capacidade de formar G4 ou iM, iniciou-se a validação da formação de G4 num ambiente celular utilizando uma sonda de hibridação fluorescente. Esta estratégia contorna as limitações de anticorpos e de sondas fluorescentes, que apresentam falta de seletividade estrutural, reconhecendo indiscriminadamente ADN e ARN G4, e não conseguem direcionar especificamente o G4 pretendido. A sonda molecular desenvolvida era composta por um ligando fluorescente reconhecedor de G4 (derivado de acridina) conjugado com um oligonucleótido complementar que hibridiza com a região adjacente ao G4 de B-MYB. Antes da síntese da sonda usou-se a abordagem de “click chemistry”, as moléculas de baixo peso molecular foram caracterizadas fotofisicamente, avaliados biofisicamente contra G4 e, posteriormente, validados espectroscopicamente e em células. Estudos celulares confirmaram a co-localização entre a sonda molecular e o G4 de B-MYB em células, oferecendo perspetivas promissoras para futuras aplicações na investigação do cancro em terapias dirigidas e na monitorização de G4.
Embora os G4 sejam altamente dinâmicos e topologicamente diversos, os G4 localizados nos promotores são geralmente paralelos, enquanto as formas antiparalelas são pouco relatadas e menos caracterizadas. Nesta tese identificámos uma sequência do promotor de B-MYB (B-MYB 26RA) que forma um G4 antiparalelo. Assim, foi estabelecida uma abordagem biofísica, iniciando na RMN em solução até estudos de in-cell RMN, para prever um modelo da estrutura tridimensional (quadruplex-duplex) e avaliar a formação de B-MYB 26RA num ambiente celular complexo. Curiosamente, o B-MYB 26RA evidenciou sensibilidade iónica ao K+ e Na+, aumentando a sua dinâmica topológica, e demonstrou que, quando associado ao ligando PhenDC3, ocorre uma mudança conformacional de topologia híbrida para antiparalela.
De seguida, avançámos para o G4 B-MYB 43R para avaliar a sua relevância terapêutica e a capacidade de ser alvo de moléculas de baixo peso molecular. Assim, com recurso a técnicas espectroscópicas, confirmou-se a formação do G4 e a sua interação com um conjunto de moléculas de baixo peso molecular estabilizadoras de G4. Das moléculas de baixo peso molecular testadas, o PhenDC3 e o TMPyP4 demonstraram as mais altas afinidades de ligação e maior estabilização e revelou-se que ambos inibiram a proliferação e a migração em duas linhas celulares de cancro do pulmão (A549 e H1299), com o PhenDC3 a apresentar efeitos citotóxicos e citostáticos potentes. Além disso, o PhenDC3 aumentou a expressão de B-MYB apesar dos seus efeitos fenotípicos, evidenciando a complexidade dos mecanismos de direcionamento de G4 e apoiando as evidências crescentes de que as moléculas de baixo peso molecular nem sempre regulam negativamente os seus genes-alvo.
Por fim, explorámos o uso de “Polypurine Reverse-Hoogsteen (PPRH) hairpins” como abordagem terapêutica alternativa direcionada o promotor do B-MYB. As PPRH são oligonucleótidos de ADN que se dobram em “hairpins” intramoleculares e se ligam a cadeias de polipirimidinas complementares, formando triplexes de ADN estáveis, impedindo a transcrição e deslocando a cadeia rica em G, induzindo a formação de G4, e assim permitindo uma regulação da expressão do oncogene a dois níveis. Desta forma foi desenhada um PPRH contra a região formadora de G4 no promotor de B-MYB (B-MYB 43R), recorrendo a uma ferramenta bioinformática (TFO Searching Tool), tendo a formação do triplex sido depois validada experimentalmente por técnicas biofísicas. Os efeitos biológicos do PPRH desenhado, avaliados em modelos celulares de cancro do pulmão (A549, H1299) e fibroblastos humanos provenientes de tecido pulmonar (MRC-5), demonstraram baixa viabilidade e baixa capacidade clonogénica, associadas a uma redução na expressão de mRNA e a alterações do perfil proteómico. Assim, a integração de abordagens focadas na formação de triplex e G4 pode representar uma estratégia promissora para o desenvolvimento de terapias mais eficientes.
Em suma, esta tese estabelece as estruturas não canónicas de ácidos nucleicos como alvos farmacológicos promissores e agentes terapêuticos. Como alvos, foram identificadas estruturas G4 e iM na região promotora do oncogene B-MYB, permitindo avanços na elucidação estrutural e na caracterização da sua dinâmica topológica em função de condições distintas de sais/iões metálicos e moléculas de baixo peso molecular; validou-se a sua formação em meio celular e explorou-se a interação com moléculas de baixo peso molecular ( 500 Da). Por outro lado, o potencial terapêutico foi avaliado usando PPRH, revelando-se uma estratégia eficaz e seletiva para alvejar o B-MYB. Em conjunto, estes resultados permitiram identificar novas direções para a investigação translacional do oncogene B-MYB.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT); European Biophysics Societies Association (EBSA), à International Union for Pure and Applied Biophysics (IUPAB), à agência ERASMUS+ e à Fundação Luso-Americana para o Desenvolvimento (FLAD)