1,721,100 research outputs found
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Mechanistic and quantitative understanding of antibiotic resistance and adaptation of Escherichia coli under levofloxacin exposure
Full text linkSuccessful treatment of infectious diseases is increasingly challenging, as emergence and spread of bacterial adaptation and resistance mechanisms threaten the availability of efficacious treatment options. A prerequisite for bacterial eradication and prevention of adaptation and resistance is sufficient antibiotic exposure at target site, which can be obtained by dosing optimisation. For that purpose, a comprehensive understanding of the relationship between pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD), i.e., between antibiotic exposure and effect, is crucial. Currently applied PK/PD parameters and target values are mainly based on the minimal inhibitory concentration (MIC). The informative value of this endpoint measurement is limited, but appropriate alternatives are currently lacking. A comprehensive understanding of exposure-effect relationships requires knowledge about relevant antibiotic resistance and bacterial adaptation mechanisms, which has substantially increased in the last years. However, a link between PK/PD relationships and the underlying mechanisms has not been established yet.
Hence, the present thesis aimed to characterise, quantify, and mechanistically explain bacterial growth-kill behaviour over time. The model compound levofloxacin (LEV) and the bacterial species Escherichia coli (E. coli) were chosen for the case study, as life-threatening infections with fluoroquinolone resistant E. coli strains are of clinically relevant concern.
To characterise growth, kill and regrowth behaviour of three LEV resistant clinical E. coli isolates under LEV exposure, time-kill curve investigations in static and dynamic in vitro infection models (IVIM) were performed. Mimicking clinically relevant LEV concentration-time (C(t)) profiles, resulting from a 750 mg, 90 min LEV i.v. infusion in plasma, demonstrated the inefficacy of this approved dosing regimen against resistant strains. Bacterial regrowth was observed within 24 h for all strains, but the extent of initial reduction of bacterial concentrations and regrowth differed, even for two strains sharing the same MIC value (8 mg/L).
To understand the genomic background of the observed growth-kill behaviour, a PCR and electrophoresis method was established and mutations in fluoroquinolone resistance determining regions of the isolates were identified by Sanger sequencing. Additionally, whole genome sequencing was performed by collaboration partners, and the sequence types (ST) were determined (ST58, ST88 and ST167). Widespread mutations in gyrA and parC were identified for all strains. Furthermore, ST88 harboured qnr plasmids. The higher LEV susceptibility of ST88 (MIC: 2 mg/L) compared to ST167 (MIC: 8 mg/L) was partly explained by genomic resistance mechanisms, but the reduced susceptibility of ST58 (MIC: 8 mg/L) was not solely explained by the single gyrA mutation of the isolate.
To elucidate the contribution of persister formation as a phenotypic adaptation mechanism to the observed growth, kill and regrowth behaviour, an electronic cell counting assay was developed and successfully applied. Filamentation, measured as increased bacterial cell size, was used as surrogate for persister formation. Assessment of the dynamic changes in bacterial size distributions under static LEV exposure over time implied extensive persister formation of ST88 and ST167, and a comparably small extent of persister formation of ST58.
To quantitatively describe the exposure-effect relationship of LEV against E. coli in static and dynamic IVIM experiments, novel PK/PD metrics were introduced, considering the full LEV C(t) profile and bacterial time-kill trajectory: (i) LEV exposure was determined as cumulative area under the LEV C(t) curve, and (ii) the antibiotic effect over time was quantified as cumulative area between the bacterial growth control curve and the time-kill curve, normalised to the area under the growth control curve. Applying these metrics, the exposure-effect relationship was described by a sigmoidal maximum effect (Emax) model, combined with an inhibition term. Based on this novel approach, precise parameter estimates for the derived PK/PD parameters, the cumulative area under the LEV C(t) profile causing 50% of the maximum effect (cumAUC50) and the cumulative area under the LEV C(t) profile causing regrowth (cumAUCreg), were obtained, discriminating the exposure-effect relationship of the strains under static and dynamic LEV exposure.
Finally, gained knowledge about the strain-specific growth-kill behaviour and the underlying adaptation and resistance mechanisms was amalgamated in a three-bacterial-state PK/PD model. Leveraging two bacterial quantification methods, i.e. plate counting and electronic cell counting, allowed discrimination of three bacterial subpopulations: viable, dead and persister cells. Two manifestations of the LEV effect were identified: (i) a LEV concentration-dependent killing effect, decreasing bacterial numbers of viable cells via a sigmoidal Emax model, and (ii) an additive increase of the first-order persister formation rate constant, increasing transformation of viable cells into persister cells in presence of LEV. Different LEV potencies of the strains were quantified as strain-specific EC50 values, being 5.5-fold higher for ST58 compared to ST88, and 2-fold higher compared to ST167. The largest extent of persister formation for ST88 was confirmed by the highest increase in the persister formation rate constant under LEV exposure for the isolate.
In future, application of electronic cell counting in dynamic IVIM experiments will support refinement of the PK/PD model, as the newly established method was solely applied in static IVIM experiments so far. Further, assessment of PK resistance mechanisms, such as increased expression of efflux pumps or alterations of the outer membrane, decreasing intra-bacterial LEV concentrations, might elucidate the reduced LEV susceptibility of ST58.
Overall, the present thesis highlighted the limitations of the MIC value to guide antibiotic therapy and suggested novel PK/PD parameters. Bacterial adaptation and resistance were quantitatively and mechanistically characterised. The developed PK/PD model elucidated the interplay between different processes determining bacterial growth, kill and regrowth behaviour and facilitates in silico simulation of further scenarios, such as alternative LEV dosing regimens, to ultimately support rational antibiotic dosing and prevent emergence of bacterial adaptation and resistance.Die erfolgreiche Therapie von Infektionserkrankungen stellt eine zunehmende Herausforderung dar, da die Entstehung und Verbreitung von Antibiotikaresistenz die Verfügbarkeit wirksamer Therapiemöglichkeiten bedroht. Eine Voraussetzung, um Bakterien vollständig abzutöten sowie ihre Anpassung und die Entstehung von Resistenzen zu verhindern, ist eine ausreichende Antibiotikaexposition am Wirkort, die durch optimierte Dosierung erreicht werden kann. Hierzu ist ein umfassendes Verständnis der Beziehung zwischen Pharmakokinetik (PK) und Pharmakodynamik (PD) unerlässlich, also zwischen Antibiotikaexposition und antibiotischem Effekt. Die zurzeit eingesetzten PK/PD-Parameter und ihre Zielwerte basieren überwiegend auf der minimalen Hemmkonzentration (MHK). Die MHK ist als Endpunkt-Messgröße von begrenzter Aussagekraft, jedoch fehlen derzeit angemessene Alternativen. Um Expositions-Effekt-Beziehungen von Antibiotika umfassend zu verstehen, ist die Kenntnis der relevanten Resistenz- und Anpassungsmechanismen der Bakterien essenziell. Obwohl diese in den letzten Jahren bedeutend zugenommen hat, ist der Zusammenhang zwischen PK/PD-Beziehungen und ihren mechanistischen Ursachen bisher wenig erforscht.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, das zeitabhängige bakterielle Wachtsums- und Absterbeverhalten zu charakterisieren, zu quantifizieren und mechanistisch zu erklären. Das Antibiotikum Levofloxacin (LEV) und die bakterielle Spezies Escherichia coli (E. coli) wurden beispielhaft für diese Fallstudie ausgewählt, da lebensbedrohliche Infektionen mit E. coli-Stämmen mit Fluorchinolon-Resistenz von klinisch relevantem Interesse sind.
Um das bakterielle Wachstum, Absterben und Wiederanwachsen drei LEV-resistenter klinischer E. coli-Isolate unter LEV-Exposition zu charakterisieren, wurden Untersuchungen in statischen und dynamischen In-vitro-Infektionsmodellen (IVIM) durchgeführt. Die Nachahmung klinisch relevanter Konzentrations-Zeitprofile (C(t)-Profile), die nach der Gabe einer 750 mg, 90 min LEV-Infusion im Plasma bestimmt werden, zeigte die Unwirksamkeit dieses zugelassenen Dosierungsschemas bei Infektionen mit resistenten Stämmen. Ein erneutes Anwachsen der Bakterienpopulationen wurde innerhalb von 24 h bei allen Stämmen beobachtet, jedoch mit einem unterschiedlichen Ausmaß des anfänglichen Absterbens und des späteren Wiederanwachsens, selbst für zwei Stämme mit derselben MHK (8 mg/L).
Um die genomischen Ursachen des beobachteten Absterbeverhaltens zu verstehen, wurde eine PCR- und Gelelektrophoresemethode etabliert und wurden Mutationen der Fluorchinolon-Resistenz bestimmenden Regionen der untersuchten Isolate mittels Sequenzierung nach Sanger identifiziert. Zusätzlich wurde das Gesamtgenom der Isolate durch Kooperationspartner sequenziert, und die Sequenztypen (ST) wurden bestimmt (ST58, ST88 und ST167). In allen Isolaten ließen sich weit verbreitete Mutationen der Gene gyrA und parC festellen. In einem Isolat (ST88) wurden zusätzlich qnr-Plasmide identifiziert. Die höhere LEV-Empfindlichkeit von ST88 (MHK: 2 mg/L) im Vergleich zu ST167 (MHK: 8 mg/L) war teilweise durch genomische Resistenzmechanismen erklärbar, aber die verminderte Empfindlichkeit von ST58 (MHK: 8 mg/L) konnte nicht ausschließlich durch die einzelne gyrA-Mutation des Isolates erklärt werden.
Um den Beitrag der Persisterbildung als phänotypischem Adaptationsmechanismus zum beobachteten Wachstums- und Absterbeverhalten aufzuklären, wurde ein Verfahren zur elektronischen Zellzählung entwickelt und erfolgreich eingesetzt. Filamentierung wurde durch Messung der Zellgrößen unter Exposition statischer LEV-Konzentrationen bestimmt und als Surrogat für die Persisterbildung genutzt. Die Untersuchung der dynamischen Änderung der Zellgrößenverteilung von Bakterien, die statischen LEV-Konzentrationen exponiert waren, in Abhängigkeit von der Zeit, deutete auf ausgeprägte Persisterbildung von ST88 und ST167 hin, während ST58 vergleichsweise weniger Persister bildete.
Um die Expositions-Effekt-Beziehung von E. coli-Bakterien, die im IVIM statischen und dynamischen LEV-Konzentrationen exponiert waren, quantitativ zu beschreiben, wurden neuartige PK/PD-Messgrößen eingeführt, die das das gesamte LEV C(t)-Profil sowie die gesamte bakterielle Abtötungskurve berücksichtigten: (i) Die LEV-Exposition wurde als kumulierte Fläche unter der LEV C(t)-Kurve berechnet, und (ii) der antibiotische Effekt in Abhängigkeit von der Zeit wurde als kumulierte Fläche zwischen der bakteriellen Wachstumskurve und der Abtötungskurve berechnet und auf die kumulierte Fläche unter der Wachstumskurve normalisiert. Durch die Anwendung dieser Messgrößen konnte die Expositions-Effekt-Beziehung als sigmoidales Emax-Modell beschrieben werden, das mit einem Inhibitionsterm kombiniert wurde. Dieser neuartige Ansatz erlaubte die präzise Schätzung der abgeleiteten PK/PD-Parameter, der kumulierten Fläche unter der LEV C(t)-Kurve, die 50% des maximalen Effektes veruracht (cumAUC50), und und der kumulierten Fläche unter der LEV C(t)-Kurve, bei der ein Wiederanwachsen der Bakterienpopulation zu beobachten ist (cumAUCreg), mit denen die Expositions-Effekt-Beziehung der Stämme unter statischer und dynamischer LEV-Exposition unterschieden werden konnte.
Schließlich ermöglichten die gewonnenen Erkenntnisse über das spezifische Wachstums- und Absterbeverhalten der Stämme und der zu Grunde liegenden Adaptations- und Resistenzmechanismen die Entwicklung eines das bakterielle Wachstums- und Absterbeverhalten charakterisierenden PK/PD-Modells. Durch die zwei eingesetzten Methoden zur Bakterienquantifizierung, zum einen Lebendkeimzahlbestimmung und zum anderen elektronische Zellzählung, konnten drei bakterielle Subpopulationen identifiziert werden: teilungsfähige Zellen, tote Zellen und Persister. Zwei Ausprägungen des LEV-Effektes waren unterscheidbar: (i) ein LEV- konzentrationsabhängiger Abtötungseffekt, der die Anzahl teilungsfähiger Bakterien im Sinne eines sigmoidalen Emax-Modells reduzierte, und eine additive Erhöhung der Persisterbildungs-Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung unter LEV-Exposition, die die Transformation teilungsfähiger Zellen in Persisterzellen unter LEV-Einfluss förderte. Unterschiedliche LEV-Wirkstärken wurden durch spezifische EC50-Werte der drei Isolate quantifiziert. Dieser Wert war für ST58 5.5-fach höher als für ST88 und 2-fach höher als für ST167. Das größte Ausmaß der Persisterbildung durch ST88 wurde durch den größten Anstieg der Persisterbildungs-Geschwindigkeitskonstante unter LEV-Einfluss für das Isolat bestätigt.
In Zukunft wird die Anwendung des elektronischen Zellzählungsverfahrens auch in dynamischen IVIM-Experimenten eine Weiterentwicklung des PK/PD-Modelles unterstützen, da die neu entwickelte Methode bisher nur in statischen Experimenten eingesetzt wurde. Weiterhin kann die Untersuchung pharmakokinetischer Resistenzmechanismen wie der gesteigerten Exprimierung von Effluxpumpen und Veränderungen der äußeren Membran, die zu verminderten intrazellulären Antibiotikakonzentrationen führen, zum Verständnis der reduzierten LEV-Empfindlichkeit von ST58 beitragen.
Insgesamt hat die vorliegende Arbeit die Grenzen der MHK als Richtschnur bei der Antibiotikatherapie verdeutlicht und neue PK/PD-Parameter vorgeschlagen. Bakterielle Resistenz- und Anpassungsmechanismen wurden quantitativ und mechanistisch charakterisiert. Das entwickelte PK/PD-Modell klärte das komplexe Zusammenspiel verschiedener Prozesse auf, die das bakterielle Wachstums-, Absterbe- und Wiederanwachsverhalten bestimmten. Es ermöglicht die in silico Simulation weiterer Szenarien, wie zum Beispiel alternativer LEV-Dosierungsschemata, um letztendlich die rationale Antibiotikadosierung zu unterstützen und somit zur Verhinderung des Auftretens bakterieller Anpassungs- und Resistenzmechanismen beizutragen
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Towards the elucidation of voriconazole pharmacokinetics: quantitative insights into distribution and metabolism processes in humans
Full text linkInvasive fungal infections are an increasing threat to the global public health causing approximately 1.5 million deaths worldwide every year. As the emergence and spread of resistance to antimycotics is expanding and the development of new antifungal agents is lagging behind this epidemiological burden, one important aspect is the rational use of existing drugs, such as voriconazole (VRC). Despite its long-term and frequent application in humans, VRC pharmacokinetics (PK) are still not fully understood revealing large intra- and interindividual variability as well as therapy failures and adverse events. The main source of variability is assumed to derive from the extensive metabolism of VRC involving the cytochrome P450 (CYP) isoenzymes 2C19, 2C9 and 3A4. Furthermore, the target site of VRC, i.e. the interstitial space fluid (ISF), is more relevant for PK investigations in contrast to the usually determined plasma concentrations. A powerful tool for ISF investigations is the minimally-invasive sampling technique microdialysis, which allows the continuous sampling of protein-unbound drug over time.
Therefore, the present thesis aimed at contributing to the elucidation of VRC PK by generating mechanistic and quantitative insights into its distribution and metabolism processes in humans to ultimately support the optimisation of VRC dosing strategies. To achieve this objective, research in three main areas was performed. First, a versatile bioanalytical liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) assay was developed and validated for the quantification of VRC and its metabolites in various biological matrices. Second, in vitro metabolism investigations were performed for a comprehensive characterisation of VRC and its metabolites as substrates and inhibitors of CYP2C19, CYP2C9 and CYP3A4. Third, in vitro and in vivo microdialysis investigations were performed evaluating the application of simultaneous microdialysis of VRC and its potentially toxic metabolite, voriconazole N-oxide (NO), in humans.
The developed bioanalytical LC-MS/MS assay enabled the simultaneous quantification of VRC, NO and hydroxyvoriconazole (OH-VRC) in human plasma, ultrafiltrate and microdialysate as well as in the in vitro matrices of human liver/intestine microsomes (HLM/HIM) and recombinant human CYP (rhCYP) isoenzymes. In a first step, the assay was fully validated according to the European Medicines Agency guideline on bioanalytical method validation for the quantification of VRC and NO in plasma and microdialysate. Overall, the quantification was rapid, simple and feasible for clinically relevant concentrations of VRC and NO from 5 to 5000 ng/mL in plasma and ultrafiltrate as well as from 4 to 4000 ng/mL in microdialysate. Due to the high sensitivity of the assay, only 20 µL of plasma or ultrafiltrate and 5 µL of microdialysate were required. For VRC and NO in plasma and microdialysate, between-run accuracy was high with a maximum mean deviation of 7.0% from the nominal concentration and between-run precision was demonstrated by ≤11.8% coefficient of variation. Stability under various conditions was demonstrated for both compounds. In a second step, the assay was successfully adapted for PK analyses in in vitro experiments covering a concentration range of 0.1 to 500 ng/mL for NO and of 1.0 to 500 ng/mL for OH-VRC at a sample volume of 20 µL. Overall, by reducing the required sample volume, the bioanalytical method allowed for an increased number of plasma samples in vulnerable populations and enabled the generation of concentration-time profiles with a higher temporal resolution in microdialysis studies.
In vitro metabolism investigations revealed NO formation to follow Michaelis-Menten kinetics and was mediated by the CYP isoenzymes 2C19, 2C9 and 3A4 as determined by incubation of VRC with HLM, HIM and rhCYP. The kinetic parameters of the reaction, i.e. Michaelis-Menten constant (KM), maximum reaction velocity (Vmax) and intrinsic clearance (CLint), were derived and an in vitro in vivo extrapolation using the well-stirred liver model demonstrated their validity by comparison to in vivo data. In contrast, no OH-VRC formation was detected in any of the metabolic systems, suggesting a different metabolic pathway of formation. The contribution of the individual isoenzymes to NO formation was 63.1% for CYP2C19, 13.2% for CYP2C9 and 29.5% for CYP3A4 as determined by specific CYP inhibition in HLM and application of intersystem extrapolation factors to scale the metabolism in rhCYP. The type of inhibition and inhibitory potential of VRC, NO and OH-VRC were evaluated in HLM by their effects on CYP specific marker reactions for CYP2C19, CYP2C9 and CYP3A4. Regarding the half maximum inhibitory concentration (IC50), NO was the weakest and VRC and OH VRC comparably strong inhibitors of CYP2C9 and CYP3A4. CYP2C19 was significantly inhibited by VRC only. Time-independent inhibition by VRC, NO and OH-VRC was demonstrated by the absence of an IC50 shift when a pre-incubation step of inhibitor and enzyme in the absence or presence of NADPH re-generating system was performed. Lastly, the assessment of the inhibitory constant (Ki) confirmed the observations of inhibitory potential from IC50 investigations, as well as revealed competitive inhibition of CYP2C19 by VRC and OH VRC and non-competitive inhibition by NO. Inhibition of CYP2C9 was competitive while inhibition of CYP3A4 was non-competitive for VRC, NO and OH-VRC.
As a prerequisite for the assessment of target-site exposure of VRC and NO, the feasibility of simultaneous microdialysis of VRC and NO was first explored in vitro by investigating the relative recovery (RR) of both compounds in the absence and presence of the other. Dependencies of RR on compound combination, compound concentration, microdialysis catheter and study day were evaluated and quantified by a linear mixed-effects model. Median RR of VRC and NO during individual microdialysis were high with 87.6% and 91.1%, respectively. During simultaneous microdialysis of VRC and NO, median RR did not change relevantly being 87.9% and 91.1%, respectively. The linear mixed-effects model confirmed the graphically presumed absence of significant differences between RR of VRC and NO during individual and simultaneous microdialysis as well as between the two compounds (p>0.05). No impact of the investigated clinically relevant compound concentration on RR was found (p=0.284). The study day was the main source of variability (46.3%), while the microdialysis catheter had a minor impact (4.33%). VRC retrodialysis was a feasible catheter calibration method to derive ISF concentrations of VRC and NO simultaneously.
Hereinafter, to assess the in vivo feasibility and clinical applicability of the simultaneous microdialysis of VRC and NO, plasma, ultrafiltrate and ISF samples, obtained in a clinical microdialysis trial investigating VRC PK after administration of an approved VRC dosing regimen, were analysed. Concentration-time profiles, exposure assessed as area under the concentration-time curve (AUC) and metabolic ratios (concentrationNO/concentrationVRC) of four healthy male adults in plasma, ultrafiltrate and ISF were evaluated regarding the impact of multiple dosing and the CYP2C19 genotype-predicted phenotype. VRC and NO revealed distribution into ISF with AUC being up to 2.82- and 17.7-fold lower compared to plasma. Intraindividual variability of metabolic ratios was largest after the first VRC dose administration while interindividual differences increased with multiple dosing. The CYP2C19 genotype-predicted phenotype influenced interindividual differences with a maximum 6- and 24 fold larger AUC ratio (AUCNO/AUCVRC) between the intermediate and rapid metaboliser in plasma and ISF, respectively. VRC metabolism was saturated or auto-inhibited, indicated by decreasing metabolic ratios with increasing VRC concentrations.
Overall, the present thesis advanced the elucidation of VRC PK by generating mechanistic and quantitative insights into distribution and metabolism processes in humans. The application of the newly established bioanalytical LC-MS/MS assay enabled the thorough characterisation of VRC and its metabolites as substrates and inhibitors of the CYP isoenzymes 2C19, 2C9 and 3A4. Moreover, in vitro microdialysis feasibility investigations provided the basis for the evaluation of simultaneous microdialysis of VRC and NO in vivo. Thus, the exploratory PK analysis highlighted the potential sources of intra- and interindividual differences observed in the context of VRC treatment in humans. Ultimately, a thorough understanding of VRC target-site PK and metabolism is key to the optimisation of personalised VRC dosing regimens.Invasive Pilzinfektionen stellen eine zunehmende Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit dar und verursachen jedes Jahr weltweit etwa 1.5 Millionen Todesfälle. Da die Entstehung und Ausbreitung von Resistenzen gegen Antimykotika zunimmt und die Entwicklung neuer antimykotischer Wirkstoffe hinter dieser epidemiologischen Belastung zurückbleibt, ist ein wichtiger Aspekt der rationale Einsatz vorhandener Arzneimittel wie z. B. Voriconazol (VRC). Trotz der langjährigen und häufigen Anwendung am Menschen ist die Pharmakokinetik (PK) von VRC noch immer nicht vollständig verstanden, was sich in einer großen intra- und interindividuellen Variabilität sowie in Therapieversagen und unerwünschten Arzneimittelwirkungen zeigt. Es wird angenommen, dass die Hauptursache für die Variabilität im komplexen Metabolismus von VRC liegt, an dem die Cytochrom P450 (CYP)-Isoenzyme 2C19, 2C9 und 3A4 beteiligt sind. Darüber hinaus ist der Zielort von VRC, d. h. die interstitielle Flüssigkeit (ISF), für PK-Untersuchungen relevanter als die üblicherweise bestimmten Plasmakonzentrationen. Eine leistungsfähige Methode für ISF-Untersuchungen ist die minimal-invasive Probenahmetechnik der Mikrodialyse, die eine kontinuierliche Probenahme von nicht proteingebundenen Arzneistoffmolekülen über einen bestimmten Zeitraum ermöglicht.
Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, einen Beitrag zur Aufklärung der VRC PK zu leisten, indem mechanistische und quantitative Einblicke in die Verteilung und die Stoffwechselprozesse beim Menschen gewonnen werden, um letztendlich die Optimierung der Dosierungsstrategien für VRC zu unterstützen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden Untersuchungen in drei Hauptforschungsgebieten durchgeführt. Erstens wurde ein vielseitiger bioanalytischer Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Assay (LC-MS/MS) für die Quantifizierung von VRC und seinen Metaboliten in verschiedenen biologischen Matrices entwickelt und validiert. Zweitens wurden In-vitro-Metabolismusuntersuchungen zur umfassenden Charakterisierung von VRC und seinen Metaboliten als Substrate und Inhibitoren von CYP2C19, CYP2C9 und CYP3A4 durchgeführt. Drittens wurden In-vitro- und In-vivo-Mikrodialyse-Untersuchungen durchgeführt, um die Anwendung der gleichzeitige Mikrodialyse von VRC und dem potenziell toxischen Metaboliten, Voriconazol-N-Oxid (NO), beim Menschen zu bewerten.
Der entwickelte bioanalytische LC-MS/MS-Assay ermöglichte die gleichzeitige Quantifizierung von VRC, NO und Hydroxyvoriconazol (OH-VRC) in menschlichem Plasma, Ultrafiltrat und Mikrodialysat sowie in den In-vitro-Matrices menschlicher Leber-/Darm-Mikrosomen (HLM/HIM) und rekombinanter menschlicher CYP-Isoenzyme (rhCYP). In einem ersten Schritt wurde der Assay gemäß der Leitlinie zur „Validierung bioanalytischer Methoden für die Quantifizierung“ der Europäischen Arzneimittelagentur für VRC und NO in Plasma und Mikrodialysat vollständig validiert. Insgesamt war die Quantifizierung schnell, unkompliziert und verwendbar für klinisch relevante Konzentrationen von VRC und NO von 5 bis 5000 ng/mL in Plasma und Ultrafiltrat sowie von 4 bis 4000 ng/mL in Mikrodialysat. Aufgrund der hohen Sensitivität des Assays wurden nur 20 µL Plasma oder Ultrafiltrat und 5 µL Mikrodialysat benötigt. Für VRC und NO in Plasma und Mikrodialysat war die Richtigkeit zwischen den Messsequenzen mit einer maximalen mittleren Abweichung von 7.0 % von der Nennkonzentration hoch und die Präzision zwischen den Messsequenzen wurde mit einem Variationskoeffizienten von ≤11.8 % bestätigt. Beide Substanzen erwiesen sich unter verschiedenen Bedingungen als stabil. In einem zweiten Schritt wurde der Assay erfolgreich für PK-Analysen in In-vitro-Experimenten angepasst, die einen Konzentrationsbereich von 0.1 bis 500 ng/mL für NO und von 1.0 bis 500 ng/mL für OH-VRC bei einem Probenvolumen von nur 20 µL abdeckten. Insgesamt ermöglichte die bioanalytische Methode durch die Verringerung des erforderlichen Probenvolumens eine größere Anzahl von Plasmaproben in vulnerablen Bevölkerungsgruppen und die Erstellung von Konzentrations-Zeitprofilen mit einer höheren zeitlichen Auflösung in Mikrodialysestudien.
In-vitro-Metabolismusuntersuchungen ergaben, dass die NO-Bildung einer Michaelis-Menten-Kinetik folgt und durch die CYP-Isoenzyme 2C19, 2C9 und 3A4 vermittelt wird, wie durch Inkubation von VRC mit HLM, HIM und rhCYP festgestellt wurde. Die kinetischen Parameter der Reaktion, d. h. die Michaelis-Menten-Konstante (KM), die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) und die intrinsische Clearance (CLint), wurden bestimmt und deren Gültigkeit durch eine In-vitro-in-vivo-Extrapolation unter Verwendung des „well-stirred“-Lebermodells und den Vergleich mit In-vivo-Daten gezeigt. Im Gegensatz dazu wurde in keinem der Enzymsysteme eine Bildung von OH-VRC festgestellt, was auf einen anderen Stoffwechselweg der Bildung hindeutet. Der Beitrag der einzelnen Isoenzyme zur NO-Bildung betrug 63.1 % für CYP2C19, 13.2 % für CYP2C9 und 29.5 % für CYP3A4, wie durch spezifische CYP-Hemmung in HLM und Anwendung von Intersystem-Extrapolationsfaktoren zur Skalierung des Metabolismus in rhCYP ermittelt wurde. Die Art der Inhibition und das hemmende Potenzial von VRC, NO und OH-VRC wurden in HLM durch ihre Auswirkungen auf CYP-spezifische Markerreaktionen für CYP2C19, CYP2C9 und CYP3A4 bewertet. Hinsichtlich der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) waren NO der schwächste und VRC und OH VRC vergleichsweise starke Inhibitoren von CYP2C9 und CYP3A4. CYP2C19 wurde nur durch VRC signifikant gehemmt. Die zeitunabhängige Inhibition durch VRC, NO und OH-VRC wurde durch das Fehlen einer IC50-Verschiebung nachgewiesen, wenn ein Vorinkubationsschritt von Inhibitor und Enzym in Abwesenheit oder Anwesenheit eines NADPH-regenerierenden Systems durchgeführt wurde. Schließlich bestätigte die Bewertung der Inhibitionskonstanten (Ki) die Beobachtungen des inhibitorischen Potenzials aus den IC50-Untersuchungen und zeigte eine kompetitive Hemmung von CYP2C19 durch VRC und OH-VRC sowie eine nicht-kompetitive Hemmung durch NO. Die Hemmung von CYP2C9 war kompetitiv, während die Hemmung von CYP3A4 nicht-kompetitiv für VRC, NO und OH-VRC war.
Als Voraussetzung für die Bestimmung der VRC und NO Exposition am Zielort, wurde zunächst die Durchführbarkeit der gleichzeitigen Mikrodialyse von VRC und NO in vitro untersucht, indem die relative Wiederfindung (RR) beider Substanzen in Abwesenheit und Anwesenheit der jeweils anderen bestimmt wurde. Die Abhängigkeiten der RR von der Substanzkombination, der Konzentration der Substanz, dem Mikrodialysekatheter und dem Studientag wurden mit einem linearen gemischten Modell bewertet und quantifiziert. Die mediane RR von VRC und NO während der individuellen Mikrodialyse war mit 87.6 % bzw. 91.1 % hoch. Bei gleichzeitiger Mikrodialyse von VRC und NO änderte sich die mediane RR mit 87.9 % bzw. 91.1 % nicht wesentlich. Das lineare gemischte Modell bestätigte die grafisch vermutete Abwesenheit signifikanter Unterschiede zwischen der RR von VRC und NO bei individueller und gleichzeitiger Mikrodialyse sowie zwischen den beiden Substanzen (p>0.05). Es wurde kein Einfluss der untersuchten klinisch relevanten Konzentrationen der Substanzen auf die RR festgestellt (p=0.284). Der Studientag war die Hauptursache der Variabilität (46.3 %), während der Mikrodialysekatheter einen geringen Einfluss hatte (4.33 %). Die Retrodialyse mit VRC war als Katheterkalibrierungsmethode zur gleichzeitigen Bestimmung der ISF-Konzentrationen von VRC und NO geeignet.
Um die In-vivo-Durchführbarkeit und klinische Anwendbarkeit der gleichzeitigen Mikrodialyse von VRC und NO zu bewerten, wurden Plasma-, Ultrafiltrat- und ISF-Proben analysiert, die in einer klinischen Mikrodialysestudie zur Untersuchung der PK von VRC nach Verabreichung eines zugelassenen VRC-Dosierungsschemas gewonnen wurden. Die Konzentrations-Zeitprofile, die als Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve (AUC) bewertete Exposition und die metabolischen Quotienten (KonzentrationNO/KonzentrationVRC) von vier gesunden männlichen Erwachsenen in Plasma, Ultrafiltrat und ISF wurden im Hinblick auf die Auswirkung der Mehrfachdosierung und des vom CYP2C19-Genotyp vorhergesagten Phänotyps bewertet. VRC und NO zeigten eine Verteilung in die ISF, wobei die AUC im Vergleich zum Plasma bis zu 2.82- bzw. 17.7-mal niedriger war. Die intraindividuelle Variabilität der metabolischen Verhältnisse war nach der ersten Verabreichung von VRC am größten, während die interindividuellen Unterschiede bei mehrfacher Verabreichung zunahmen. Der vom CYP2C19-Genotyp vorhergesagte Phänotyp beeinflusste die interindividuellen Unterschiede mit einem maximal 6- bzw. 24-fach größeren AUC-Verhältnis (AUCNO/AUCVRC) zwischen dem intermediären und dem schnellen Metabolisierer im Plasma bzw. in der ISF. Der VRC-Metabolismus war gesättigt oder auto-inhibiert, was durch abnehmende metabolische Verhältnisse bei steigenden VRC-Konzentrationen ersichtlich wurde.
Insgesamt hat die vorliegende Arbeit einen Beitrag zur Aufklärung der PK von VRC geleistet, indem sie mechanistische und quantitative Erkenntnisse über die Verteilungs- und Stoffwechselprozesse beim Menschen lieferte. Die Anwendung des neu etablierten bioanalytischen LC-MS/MS-Assays ermöglichte die umfangreiche Charakterisierung von VRC und der Metabolite als Substrate und Inhibitoren der CYP-Isoenzyme 2C19, 2C9 und 3A4. Darüber hinaus formten die In-vitro-Mikrodialyse-Machbarkeitsuntersuchungen die Grundlage für die Bewertung der gleichzeitigen Mikrodialyse von VRC und NO in vivo. Die explorative PK-Analyse hat somit mögliche Ursachen der intra- und interindividuellen Unterschiede aufgezeigt, die im Zusammenhang mit der VRC-Behandlung beim Menschen beobachtet wurden. Letztendlich ist ein umfassendes Verständnis der Zielort-PK und des Metabolismus von VRC der Schlüssel zur Optimierung personalisierter VRC-Dosierungsschemata
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
koamabayili/VECTRON-author-checklist: VECTRON author checklist
No full textWe have done our best to complete the author checklist relating to the use of animals in the hut study. Note that the objective for the hut study was to evaluate the IRS treatment applications for residual efficacy against Anopheles mosquitoes, including the local An. coluzzii mosquito population. Cows were only used to attract mosquitoes into the huts and no tests were carried out directly on the cows. The author checklist is intended for use with studies where experiments are carried out on animals, which is why we have had such difficulty in completing this for the hut study, as many of the questions do not relate to how the cows were used
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