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A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS:
No full textAbstract tesi PhD
Dr. Zalfa Francesca
A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS:
a role for the Fragile X Mental Retardation Protein
FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) è una proteina che lega gli RNA altamente espressa nel cervello. L’assenza o la mutazione di FMRP causa la sindrome dell’X fragile, una disfunzione dominante legata al cromosoma X e la più frequente causa di ritardo mentale ereditario (con un’incidenza di 1 su 4000 maschi e di 1 su 6000 femmine). Utilizzando il modello murino della sindrome dell’X Fragile (il topo FMR1 knock-out), ho mostrato che FMRP è un repressore della traduzione in vivo e regola la traduzione di specifici mRNA dendritici e sinaptici, inclusi quelli codificanti le proteine del citoscheletro Arc/Arg3.1, MAP1B e la subunità alfa della chinasi calcio-calmodulina dipendente di tipo II (a-CaMKII). FMRP si associa non solo con questi mRNA bersaglio ma anche con il piccolo RNA dendritico e non tradotto BC1. Il blocco di BC1 inibisce l’interazione di FMRP con i suoi mRNA bersaglio. Inoltre, BC1 si lega direttamente a FMRP e può anche associarsi, in assenza di altre proteine, con gli mRNA regolati traduzionalmente da FMRP. Questo suggerisce un meccanismo di azione in cui la specificità della repressione traduzionale di FMRP è determinata dall’interazione diretta per appaiamento di basi tra BC1 a e gli mRNA da essa regolati. Quindi, quando FMRP non è presente, l’assenza della repressione traduzionale di specifici mRNA alle sinapsi può risultare nelle disfunzioni sinaptiche osservate nei pazienti affetti dalla sindrome dell’X Fragile.
Una fine analisi dell’interazione tra la proteina FMRP e l’RNA BC1, condotta tramite esperimenti EMSA, ha permesso di definire che il dominio N-terminale di FMRP si lega direttamente e specificamente all’RNA BC1 (Kdapp= 260 nM). È interessante notare che questo dominio non contiene nessun motivo precedentemente identificato di legame all’RNA, per cui rappresenta a tutti gli effetti un nuovo motivo di legame all’RNA. Inoltre, è stato dimostrato che il legame tra FMRP e BC1 coinvolge la forcina all’estremità 5’ di BC1, una regione che mostra interessanti complementarietà di sequenza con diversi mRNA target di FMRP. Questi risultati dimostrano che il dominio N-terminale di FMRP contiene un nuovo motivo capace di legare specificamente l’RNA e suggerisce che questa regione possa essere coinvolta nella formazione e/o nella stabilizzazione dei duplex BC1-mRNA.
Infine, anche l’analogo umano di BC1, chiamato BC200, fa parte del complesso ribonucleoproteico di FMRP umana ed è in grado di legarsi direttamente e specificamente a FMRP in corrispondenza del dominio N-terminale (Kdapp = 360 nM). Questo suggerisce che i due piccoli RNA abbiano lo stesso significato funzionale nelle cellule neuronali, contribuendo ad un più alto livello di regolazione di importanti processi biologici come la regolazione della traduzione dipendente da FMRP a livello delle sinapsi.Abstract PhD thesis
Dr. Zalfa Francesca
A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS:
a role for the Fragile X Mental Retardation Protein
FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) is an RNA binding protein highly expressed in the brain. Absence or mutation of FMRP leads to the Fragile X syndrome, an X-linked dominant disorder and the most frequent cause of inherited mental retardation (with an incidence of 1:4000 male and 1:6000 female).
Using the mouse model of Fragile X syndrome (the FMR1 knock-out mouse), I showed that FMRP is a repressor of translation in vivo and regulates translation of specific dendritic and synaptic mRNAs, including those encoding the cytoskeletal proteins Arc/Arg3.1 and MAP1B and the kinase alpha-CaMKII. Interestingly, FMRP associates not only with these target mRNAs, but also with the dendritic, non-translatable small RNA BC1. Blocking of BC1 inhibits the interaction of FMRP with its target mRNAs. Furthermore, BC1 binds directly to FMRP and can also associate, in the absence of any protein, with the mRNAs regulated by FMRP. This suggests a mechanism where the specificity of FMRP translational repression is defined through base-pairing interactions of the associated BC1 with the mRNAs by linking the regulated mRNAs and FMRP. Thus, when FMRP is not present, loss of translational repression of specific mRNAs at synapses could result in synaptic dysfunction phenotype of Fragile X patients.
A fine analysis of the BC1-FMRP interaction by EMSA experiments have pointed out that the N-terminal domain of FMRP binds directly and specifically to the BC1 RNA (Kdapp = 260 nM). Interestingly, the N-terminus of FMRP contains no previously identified motifs for specific RNA recognition, thus constitutes a new RNA binding motif to all intents and purposes. We further demonstrate that FMRP recognition involves the 5' stem-loop of BC1, a region which exhibits complementarity to several FMRP target mRNAs. These results demonstrate that the N-terminus contains a new motif capable of specific RNA binding and suggest that this region of FMRP may be involved in formation and/or stabilization of the BC1-mRNA duplex.
Finally, also the human analogue of BC1 RNA, named BC200, is part of hFMRP complex and is able to bind directly and specifically to human FMRP (Kdapp = 360 nM) via the N-terminal domain, strengthening the idea that the two BC RNAs have the same functional significance in neuronal cells contributing to higher level of regulation of key biological processes like the FMRP-dependent local regulation of translation at synapses.Abstract dettagliato tesi PhD
Dr. Francesca Zalfa
A new mechanism for regulating mRNA translation in the mammalian CNS:
a role for the Fragile X Mental Retardation Protein
La proteina FMRP (Fragile X Mental Retardation Protein) codificata dal gene FMR1 è una proteina che lega gli RNA, altamente espressa nel cervello e nelle gonadi. L’assenza di FMRP porta alla sindrome dell’X Fragile, una malattia dominante legata all’X e la più frequente causa di ritardo mentale ereditario. Oltre al ritardo mentale la sindrome è anche caratterizzata da macroorchidismo nei maschi in età post-pubertale, dismorfie del volto, anomalie del tessuto connettivo e, dal punto di vista comportamentale, anche da iperattività e comportamento simil-autistico. Nella maggior parte dei casi (99%) l’assenza di FMRP è causata dall’espansione di una tripletta CGG polimorfica posta nella regione 5’UTR del gene FMR1. L’espansione oltre le 200 volte di questa tripletta (condizione detta di “mutazione piena” o “full mutation”) porta all’iper-metilazione della isole CG a monte del promotore con successivo silenziamento trascrizionale del gene FMR1 e assenza della proteina FMRP (per una recente review vedi Zalfa and Bagni, 2004). FMRP è in grado di legare il 4% degli mRNAs neuronali e nel citoplasma neuronale forma un esteso network di interazioni con alcune proteine note e con i suoi mRNAs target formando un grande complesso ribonucleoproteico che è in grado di agire come repressore traduzionale in vitro (Li et al., 2001; Laggerbauer et al., 2001). Questi dati in vitro hanno fatto ipotizzare che FMRP nei neuroni (le cellule che esprimono a più alti livelli la proteina e anche quelle più direttamente colpite dalla sua assenza) svolgesse un importante ruolo nella regolazione di una classe di mRNAs che vengono trasportati dal corpo cellulare dei neuroni fino alle sinapsi e qui localmente tradotti. La sintesi proteica di questi RNA messaggeri alle sinapsi è un meccanismo molecolare molto importante che sta alla base di importanti processi quali la sinaptogenesi (la formazione delle sinapsi) e la plasticità sinaptica e che contribuisce ad orchestrare i processi di apprendimento e di memorizzazione (per una recente review, vedi Wang and Tiedge, 2004). A conferma di questo putativo ruolo di FMRP alle sinapsi, l’unica anomalia morfologica presente nel cervello di pazienti affetti dalla Sindrome dell’X Fragile, come anche nel cervello di topi mancanti del gene FMR1 (FMR1 knockout; Bakker et al., 1994), è la presenza di un alto numero di spine dendritiche molto allungate e sottili con una morfologia tipicamente immatura (Irwin et al., 2001; Nimchinsky et al., 2001).
Comunque, fino a pochi anni fa non era ancora noto quale ruolo svolgesse la proteina FMRP dei neuroni del CNS di mammifero e lo specifico meccanismo molecolare attraverso il quale FMRP riconoscesse i propri mRNAs bersaglio.
Nella prima fase del mio lavoro di dottorato, utilizzando la tecnica dell’analisi polisomiale su estratti citoplasmatici di cervello di topo, è stata valutata l’efficienza traduzionale di alcuni RNA messaggeri neuronali, importanti per la struttura e la funzione delle sinapsi, in presenza o in assenza di FMRP (cioè in topi wildtype o knockout per il gene FMR1). In questo modo è stato dimostrato che FMRP è un repressore della traduzione anche in vivo e che regola la traduzione di specifici mRNA neuronali (Zalfa et al., 2003). Allo scopo di studiare la funzione di FMRP alle sinapsi, la stessa tecnica è stata applicata a preparazioni di terminali sinaptici purificati (chiamati sinaptoneurosomi; Bagni et al., 2000). Anche alle sinapsi FMRP è un repressore traduzionale la cui azione è più forte e più marcata rispetto al cervello totale. E’ interessante notare che la repressione traduzionale di FMRP agisce specificamente solo su un gruppo di mRNAs dendritici codificanti proteine regolatorie chiave per la sinapsi come Arc/Arg3.1, MAP1B and a-CaMKII. Questo spiega come la mancanza di FMRP può avere effetto sulle funzioni sinaptiche.
Anche il meccanismo con cui FMRP inibisce la traduzione dei sui RNA messaggeri bersaglio è completamente nuovo: FMRP è stata trovata far parte di un complesso ribonucleoproteico che contiene un piccolo RNA dendritico, non tradotto chiamato BC1 (Zalfa et al., 2003). Noi abbiamo dimostrato tramite le tecniche dell’immunoprecipitazione e dell’Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), che l’RNA BC1 è in grado di legarsi direttamente e specificamente sia a FMRP che ad alcuni RNA messaggeri regolati traduzionalmente da FMRP. Il blocco di BC1 tramite oligonucleotidi competitori inibisce l’interazione di FMRP con i suoi mRNA bersaglio. Questo suggerisce che la specificità della repressione traduzionale di FMRP sia definita attraverso diretto appaiamento di basi tra l’RNA BC1 e gli RNA regolati da FMRP (Zalfa et al., 2003). In accordo con i nostri dati, recentemente è stato dimostrato che BC1 è un repressore della traduzione in lisati di reticolociti di coniglio che è in grado di inibire la formazione del complesso di preinizio 48S (Wang et al., 2002) associandosi con due proteine chiave per la regolazione traduzionale, la Poly(A) Binding Protein (PABP) ed il fattore di inizio della traduzione eIF4A (Muddashetty et al., 2002; Wang et al., 2002).
In questo senso, BC1 potrebbe agire in maniera simile ai micro RNAs (miRNAs) una classe di RNA non-codificanti molto piccoli (22 nt in media) che si appaiano in maniera non perfetta ai loro mRNA target e ne inibiscono la traduzione. A conferma di ciò, recentemente si è visto che FMRP in mammifero (come il suo omologo in Drosophila, dFXR; Caudy et al., 2002; Ishizuka et al., 2002) può legare micro-RNAs ed interagire con alcune proteine coinvolte nella biogenesi dei micro-RNAs come la esonucleasi DICER ed eIF2C2 (Jin et al., 2004).
Durante la seconda fase del mio progetto di Dottorato ho condotto una analisi fine dell’interazione tra l’RNA BC1 e la proteina FMRP, allo scopo di comprendere meglio il significato funzionale di questo complesso nelle cellule neuronali di mammifero. Determinando la costante di dissociazione apparente (Kdapp) in esperimenti EMSA è stato possibile stimare che l’interazione tra BC1 e FMRP rientra in un range di interazioni proteina-RNA mediamente forti (Kdapp ~ 170 nM).
Allo scopo di mappare il dominio di FMRP responsabile del legame a BC1 sono stati utilizzati in esperimenti EMSA diversi domini strutturati di FMRP prodotti in E. coli. In particolare ho testato l’intero dominio N-terminale (aa 1-217), due frammenti più piccoli dell’N-terminale (aa 1-134 e aa 1-180), il dominio KH1 (aa 205-280), il dominio KH2 (aa 281-422) e l’intero dominio C-terminale (aa 516-632). Questi esperimenti hanno permesso di evidenziare che l’RNA BC1 si lega fortemente (Kdapp ~ 260 nM) e specificamente alla regione N-terminale di FMRP. Questa regione non contiene nessun dominio canonico di legame all’RNA, ma in un recente articolo è stato dimostrato che questa regione di FMRP è in grado di legare specificamente omopolimeri di RNA in vitro (Adinolfi et al., 2003). Inoltre, utilizzando costrutti di delezione per BC1, abbiamo osservato che il riconoscimento di FMRP coinvolge l’estremità 5’ di questo RNA che si struttura come una lunga forcina. Un dato molto interessante è che questa regione di BC1 è la stessa regione che mostra complementarietà con gli mRNAs target di FMRP (Zalfa et al., 2003), suggerendo quindi che FMRP possa giocare un ruolo diretto nell’appaiamento BC1/mRNAs (Zalfa et al., submitted). In accordo con questi dati è stato recentemente dimostrato che FMRP ha molte caratteristiche proprie di uno chaperone degli acidi nucleici che è in grado di favorire e stabilizzare le interazioni RNA-RNA (Gabus et al., 2004).
L’RNA BC1 è specifico dei roditori, ma nei primati e nell’uomo esiste un potenziale analogo di BC1, chiamato BC200. L’RNA BC200 è molto simile a BC1 per pattern di espressione, per distribuzione intra-neuronale e per putativa struttura secondaria, suggerendo un ruolo di questo piccolo RNA non-codificante nel trasporto e/o nella traduzione degli mRNAs dendritici. Noi abbiamo dimostrato che BC200, il quale presenta forti complementarità di sequenza con gli mRNA umani Arc, a-CaMKII e MAP1B (Zalfa et al., 2003), fa parte del complesso di FMRP in cellule neuronali umane ed è in grado di legarsi fortemente e direttamente al dominio N-terminale di FMRP umana (Kdapp ~ 360 nM). Questo suggerisce che questi due piccoli RNA non codificanti svolgano lo stesso ruolo funzionale nelle cellule neuronali murine e di mammifero rispettivamente, contribuendo ad un livello di regolazione di importanti processi biologici più alto, come la regolazione della traduzione dipendente da FMRP alle sinapsi.
In conclusione, quando FMRP non è presente, la mancanza di repressione traduzionale di importanti proteine sinaptiche mediata dal complesso FMRP/BC200 può portare al fenotipo neuronale osservato nei pazienti affetti dalla sindrome dell’X Fragile. Inoltre, poiché le funzioni cerebrali come la capacità di apprendimento e la memoria dipendono dalla funzionalità sinaptica, i nostri dati suggeriscono fortemente che mutazioni nel dominio N-terminale di FMRP o nella forcina 5’ dell’RNA BC200 possano essere la causa di casi di Sindrome dell’X Fragile in cui la proteina FMRP è normalmente espressa (Clarke et al., 2004)
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Get PDF“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Get PDFWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Get PDFWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
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koamabayili/VECTRON-author-checklist: VECTRON author checklist
No full textWe have done our best to complete the author checklist relating to the use of animals in the hut study. Note that the objective for the hut study was to evaluate the IRS treatment applications for residual efficacy against Anopheles mosquitoes, including the local An. coluzzii mosquito population. Cows were only used to attract mosquitoes into the huts and no tests were carried out directly on the cows. The author checklist is intended for use with studies where experiments are carried out on animals, which is why we have had such difficulty in completing this for the hut study, as many of the questions do not relate to how the cows were used
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No full textAuthor-wise bibliometric analysis based on entropy.</p
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