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Protein-protein interaction dynamics in photosynthetic membrane: biochemical and in silico comparative analysis
No full textSOMMARIO
Nelle piante superiori, nelle alghe e nei cianobatteri la fotosintesi clorofilliana dipende dall’attività di due supercomplessi proteici, il Fotosistema I (il centro PSI e la sua antenna, LHCI) e il Fotosistema II (il centro PSII e la sua antenna, LHCII). Ai fotosistemi sono legati cromofori che assorbono parte dello spettro solare trasferendo l’energia acquisita sino ai centri di reazione, ove avvengono la separazione di carica e le principali reazioni fotochimiche. I complessi fotosintetici sono localizzati su membrane dette tilacoidi, ripiegate in modo da formare due distinti domini: i grana impilati, connessi tra loro dalle membrane del secondo dominio, le lamelle stromatiche. Il PSII e LHCII sono principalmente localizzati nei grana impilati, mentre il PSI, più rapido, è localizzato nelle lamelle stromatiche. Queste strutture possono variare in dimensioni, e organizzazione, in riposta a fattori tra cui l’intensità luminosa, essendovi la necessità di bilanciare il massimo assorbimento con il rischio che si verifichi un eccesso di energia luminosa. La dissipazione non fotochimica dell’eccesso di energia per mezzo di calore (Non-Photochemical Quenching, NPQ) rappresenta la più veloce reazione. Le antenne del PSII, potendo passare da una configurazione di raccolta ad una di dissipazione dell’energia sono coinvolte anche nel meccanismo NPQ.
La tesi riportata i risultati dello studio del ruolo dell’organizzazione del PSII, nella regolazione di NPQ; presenta un’analisi comparata con metodi di biochimici uniti ad una simulazione in silico, con lo scopo di chiarire il legame tra l’organizzazione della membrana tilacoidale e la regolazione della fase luminosa della fotosintesi.
La parte I è incentrata sullo studio dell’organizzazione della membrana fotosintetica, dei fattori che la determinano, approfondendo il significato della dinamica della dissociazione reversibile di un complesso facente parte del PSII e della sua correlazione con il NPQ.
Nel Capitolo 2 è discussa l’organizzazione della membrana tilacoidale, i fattori che determinano la separazione di PSI e PSII nei diversi domini e il significato della dinamica distribuzione della membrana tra di essi.
Nel Capitolo 3 sono discussi i fattori che contribuiscono alla morfologia dei tilacoidi. I casi specifici di mutanti in cui sono assenti le antenne del PSII (chlorina-f2) o il core del PSII (viridis- 115) sono considerati per chiarire il loro ruolo nella morfologia dei tilacoidi.
Il Capitolo 4 tratta dell’importanza delle interazioni tra i suoi componenti nella determinazione dell’organizzazione delle superfici dei grana. Il mutante viridis zb63, in cui è assente il PSI, presenta una drastica riduzione dell’antenna del PSII; al microscopio elettronico il PSII appare organizzato in strutture ordinate da cui sono desumibili le posizioni dei componenti rimasti tramite analisi single particle. In seguito è descritto uno studio riguardante i mutanti in cui sono assenti in modo specifico alcune antenne minori del PSII (CP24-, CP26- e CP24/26-). I risultati dimostrano come CP26 sia meno importante per l’organizzazione dei grana e più coinvolto nella fotoprotezione. L’assenza di CP24, viceversa, induce nei grana un’organizzazione cristallina simile a quella osservata in immagini di viridis zb63. Infine nel mutante CP24/26- si osserva la formazione di brevi catenelle di PSII e una separazione in microdomini ricchi di PSII o LHCII. I parametri fotosintetici sono influenzati in vario modo dall’assenza delle antenne minori, a partire dal tasso di trasporto elettronico e il NPQ (particolarmente limitati nel mutante CP24-), fino alla migrazione delle antenne dal PSII al PSI e viceversa (più veloce nei mutanti in cui CP24- e CP24/26-).
Nel Capitolo 5 viene descritta la correlazione tra la dissociazione del complesso di membrana denominato B4C (formato dalle antenne minori CP24, CP29 e da un trimero di antenna), e l’induzione di NPQ. La proteina PsbS è fondamentale per l’attivazione dei meccanismi di NPQ e controlla l’associazione/dissociazione del B4C. Inoltre quando il B4C è presente la sua dissociazione è risultata necessaria al verificarsi di NPQ. I mutanti CP24- e CP29- hanno un livello ridotto di NPQ e non presentano B4C. L’osservazione diretta al microscopio elettronico ha permesso di correlare la dissociazione e l’associazione del B4C anche alla riduzione dello spazio tra PSII core in alta luce e al suo incremento durante il successivo recupero al buio. Il mutante npq4, in cui manca PsbS e dunque NPQ, non subisce alcuna riorganizzazione quando esposto alla luce. Concludiamo che PsbS interagisce con dei componenti del B4C, a indurre la riorganizzazione della membrana fotosintetica per adattarla alle variazioni dell’intensità luminosa sia sul breve che sul medio-lungo periodo.
Nella Parte II il fenomeno della dissociazione reversibile del B4C è oggetto di uno studio in silico per verificare se una variazione nella forza delle interazioni tra proteine possa essere un fattore importante per l’instaurarsi della riorganizzazione nelle membrane dei grana tilacoidali.
I Capitolo 6 tratta del movimento nelle cellule; nelle eucariote il movimento si basa principalmente sulla presenza del citoscheletro ed è caratterizzato da direzionalità e consumo di ATP. Nelle cellule procariote numerose molecole sono omologhe a quelle che permettono il movimento nelle eucariote e i processi biologici avvengano in modo analogo ma passivo, basato sulla diffusione e sulla polarità.
Il Capitolo 7 sulla base dei principi individuati nel capitolo precedente, illustra le possibili strategie tra cui occorre scegliere per la creazione di un modello computazionale delle interazioni proteina-proteina a livello mesoscopico.
Nel Capitolo 8 è riportato un lavoro di simulazione delle dinamiche di interazione tra proteine del PSII nella dissociazione reversibile della B4C. Il software Meredys è stato adattato ed utilizzato per simulare l’associazione e la dissociazione dei complessi e supercomplessi proteici nella membrana dei grana, con riferimento al fenomeno della dinamica del complesso B4C. Ogni elemento della simulazione rappresenta una proteina o un complesso proteico e l’attenzione è principalmente volta alla formazione e rottura dei legami con coefficienti consistenti con le evidenze sperimentali. Il processo di formazione della configurazione più abbondante per i supercomplessi, in cui due core, 4 trimeri antenna e 6 antenne minori sono combinati regolarmente, è simulato a partire da entità separate che rappresentano il core del PSII, i monomeri e i trimeri del suo complesso antenna. Il volume di simulazione è suddiviso tra uno spazio corrispondente alla superficie di un grana, al centro, in comunicazione con un altro che rappresenta il bordo verso la lamella stromatica, opportunamente popolati. La dinamica è discussa nelle condizioni che corrispondono al campione adattato al buio e al trattato ad alta luce. I risultati riproducono, nella distribuzione dell’orientamento e della distanza tra core di PSII più prossimi, i dati rilevati sperimentalmente nel lavoro sul complesso B4C e in altri, basati sulla microscopia elettronica. La modifica dei parametri concernenti le interazioni putativamente interessate dall’azione di PsbS, ha indotto una variazione nelle distanze analoga a quella misurata nel passaggio del campione adattato al buio in condizioni di alta luce. Inoltre i coefficiente di diffusione dei trimeri presenti nel complesso B4C è più basso nelle condizioni che ne favoriscono la dissociazione, in accordo con la formazione di microdomini in cui l’antenna separata viene segregata, in opposizione ad altri più ricchi in PSII con antenna ridotta. I risultati ottenuti avvalorano l’ipotesi che le interazioni proteina-proteina siano un fattore chiave per l’organizzazione dei grana tilacoidali e che il complesso B4C sia uno dei più importanti siti per le interazioni che regolano la risposta allo stress tramite NPQ.SUMMARY
In higher plants, algae and cyanobacteria the photosynthesis depends on the activity of two protein supercomplexes, the photosystem I (PSI core and its antenna LHCI) and the photosystem II (PSII core and its antenna LHCII). Several photosystem subunits bind chromophores to absorb sun light and transfer excitation energy to the reaction centers, where charge separation and the main photochemical reactions occur. Photosynthetic complexes are localized in thylakoids membranes, folded so that two distinct domains are formed: stacked grana domains, connected to each other by the second type of membrane domain, the stroma lamellae. PSII and its antenna are mainly located in stacked grana, while the faster PSI in stroma lamellae. These structures can vary in dimensions and organization, depending on factors such as light intensity, as there is a continuous need for balancing the absorbed energy with the formation of dangerous free radicals. The non-photochemical quenching of energy excess in the form of heat (NPQ) is the fastest response to the photooxidative stress. PSII antenna proteins, being able to assume a light-harvesting or a dissipative configuration are involved in the NPQ mechanism.
This thesis presents the results of the study of the role of PSII organization in the regulation of photoprotection and NPQ; the analysis is a biochemical and in silico comparative analysis with the intent of clarifying the relation between thylakoids membrane organization and the light harvesting regulation. Part I is focused on the photosynthetic membrane organization and on its determining factors, delving into the meaning of the reversible dissociation of a complex comprised in PSII and into its correlation with the NPQ phenomenon.
In Chapter 2 the organization of thylakoids membrane is discussed along with the factors that
determine the separation of PSI and PSII in its compartments and the meaning of the dynamic distribution of the membrane among them.
In Chapter 3 the factors that contribute to the morphology of thylakoid are discussed. The specific cases of mutants missing PSII antennae (chlorina-f2) or the PSII core (viridis-115) are considered to clarify their contribution in the morphology.
Chapter 4 focuses on the importance of the interactions among PSII components in determining the grana membrane organization. The mutant viridis zb63, lacking PSI, a drastic reduction of PSII antenna size occurs. In electron microscopy investigation of the organization of the minimal PSII configuration under extreme stress, appearing as an ordered array, singular composing proteins are identified by single particle analysis. Subsequently, a study focused on specific PSII minor antennae knockouts (CP24-, and CP26- CP24/26-) is presented. CP26 appears to be less important for the organization and more involved in photoprotection. The absence of CP24, conversely, leads to the formation of ordered arrays on grana membranes similar to the figure observed in viridis zb63. Finally, in mutant CP24/26- the formation of short chains of PSII is observed along with microdomains enriched either in PSII or LHCII. The photosynthetic parameters are influenced in various ways by the deletion of minor antennas, starting from the rate of electronic transport and NPQ (especially limited in mutant CP24-), to the reversible migration of the PSII antenna to PSI (faster in mutants in which CP24 and CP24 - / 26 -).
In Chapter 5 the dependence between the dissociation of the membrane complex called B4C (formed by the minor antennas CP24, CP29 and a LHCII trimer), and NPQ was studied by correlating the two phenomena: the PsbS protein is essential for the NPQ and controls the association/dissociation of the B4C. Conversely when the B4C is present its dissociation is necessary for the onset of the NPQ. The mutant lacking CP24 and CP29 have a reduced level of NPQ and do not present the B4C. Direct observation by electron microscopy allowed to directly correlate the dissociation and association of B4C to the reduction of the space between PSII core upon high light exposure, and to its increase upon successive recovery in darkness. The mutant npq4, which lacks PsbS and therefore NPQ, does not undergo reorganization upon light exposure. We conclude that PsbS interacts with components of B4C to induce the reorganization of the photosynthetic membrane to adapt to changes in light intensity on both short and long term.
In Part II, the phenomenon of reversible dissociation of B4C is the subject of an in silico study to determine whether a change in the strength of interactions between proteins can be an important factor for the onset of the reorganization in grana membranes.
In Chapters 6 and 7 two key issues for a simulation of protein-protein interactions in biological membranes are discussed. Movement in eukaryotic cells is based primarily on the presence of the cytoskeleton; its fibers interacts with molecular motors, characterized by directionality and by the consumption of ATP. The prokaryotic cell contains many molecules homologue to those which allow movement in eukaryotic cells and several biological processes occur in a similar, but passive, way exploiting concentration and polarity.
Chapter 7, on the basis of the principles outlined in the previous chapter, outlines the possible strategies for creating a computational model of protein-protein interactions at a mesoscopic level, abstracting from atomic details. In Chapter 8 I presents my work in the simulation of the dynamics of the interactions between proteins of PSII in the reversible dissociation of B4C. The software Meredys, suitably adapted, was used to simulate at a mesoscopic level the association and dissociation of protein complex and supercomplexes on grana membranes, with a particular reference to the phenomenon of the dynamics of B4C complex, activated by energy dissipation mechanisms. Each element of the simulation represents a protein or a protein complex and the attention is mainly focused on the bond formation and dissociation with rates consistent with experimental evidences. The process of formation of the more abundant configuration (C2S2M2) of the supercomplexes, where two cores, 4 major antennas trimers and 6 minor antennas are regularly combined, is simulated starting from PSII cores and light harvesting complexes monomers. The simulation volume is divided between an area corresponding to the grana membrane in the center, in communication with another that represents the edge to the stroma lamellae, suitably populated. The dynamic is discussed, in conditions corresponding to the dark adapted sample and to the high light exposed one. The simulation reproduce in orientations and distances distributions between nearest neighbors PSII cores, the experimental results assessed in B4C investigation and in others, based on electron microscopy. The change of the parameters related to the interactions putatively affected by the action of PsbS, has triggered a change in distances similar to that measured in the passage of the dark adapted sample under high light. Moreover, the diffusion coefficient of LHCII-M trimers associated in B4C is lower in conditions leading to its dissociation, in agreement with the hypothetical formation of microdomains in which the separated antenna is segregated as opposed to other enriched in PSII with reduced antenna. These results support the hypothesis that protein-protein interactions are a key factor for the organization of the whole grana thylakoids and B4C is one of the most important sites for interactions that regulate stress response by NPQ
Analysis of antibody microarrays high throughput data: from data processing to network inference. The case of B-cell chronic lymphocytic leukemia.
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A photosynthetic process modelled by a metabolic P system
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No full textMOTIVATION: Comparative studies are encouraged by the fast increase of data availability from the latest high-throughput techniques, in particular from functional genomic studies. Yet, the size of datasets, the challenge of complete orthologs findings and not last, the variety of identification formats, make information integration challenging. With HOMECAT, we aim to facilitate cross-species relationship identification and data mapping, by combining orthology predictions from several publicly available sources, a convenient interface for high-throughput data download and automatic identifier conversion into a Cytoscape plug-in, that provides both an integration with a large set of bioinformatics tools, as well as a user-friendly interface.
AVAILABILITY: HOMECAT and the Supplementary Materials are freely available at http://www.cbmc.it/homecat/.
CONTACT: [email protected]
SUPPLEMENTARY INFORMATION: Supplementary data are available at Bioinformatics online
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
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