1,721,008 research outputs found
Le système de contrôle qualité nucléaire des protéines pour l'élimination des agrégats induit par le stress protéotoxique
No full textLes cellules sont fréquemment exposées à des stress environnementaux tels que des températures élevées, du stress oxydatif ou de l’acidose qui peuvent provoquer un mauvais repliement des protéines. Les protéines aberrantes ont la capacité de former des agrégats insolubles et toxiques qui sont liés à de nombreuses maladies neurodégénératives, certains cancers ainsi que le vieillissement. Les cellules ont développé des mécanismes cellulaires sophistiqués afin de faire face à de tels stress et d’éviter l’accumulation de protéines dans des inclusions (agrégats). En effet, le système de contrôle qualité des protéines maintien l’homéostasie des protéines en réparant, repliant ou en ciblant les protéines endommagées pour la dégradation. La famille de l’ubiquitine (ub) ainsi que les molécules similaires à l’ubiquitine telles que NEDD8 et SUMO jouent un rôle clef dans ce système de contrôle qualité. La formation de chaînes d’ubiquitine sur les protéines aberrantes est une étape importante pour pouvoir éliminer les protéines sujettes à l’agrégation.Cependant, nous avons récemment découvert que lors des stress protéotoxiques tels que le choc thermique ou l’inhibition du protéasome, NEDD8 altère le signal de l’ubiquitine. En effet, la formation de chaînes « hybrides » ub/NEDD8 sur des protéines spécifiques mal repliées va les conduire à leur agrégation au sein du noyau. Alors que le système contrôle qualité des protéines du cytoplasme est plutôt bien connu, celui du noyau a été très peu exploré. Dans cette étude, nous avons enquêté sur la nature et les mécanismes d’élimination des agrégats protéines nucléaires formés lors d’un stress protéotoxique. Améliorer la compréhension des mécanismes qui régulent leur élimination pourrait révéler des approches thérapeutiques pour ré-établir une fonction cellulaire normale.Dans cette étude, j’ai découvert un système de contrôle qualité des protéines qui opère spécifiquement dans le noyau afin de faire face aux agrégats nucléaires. En particulier, j’ai trouvé que la formation des agrégats nucléaires est liée au nucléole : le centre de la biogénèse des ribosomes. Le nucléole représente l’un des organelles dépourvu de membrane formé via le phénomène de séparation de phase liquide-liquide le mieux caractérisé. En utilisant diverse techniques de microscopie, j’ai montré que les propriétés biophysiques du nucléole sont perturbées au cours du stress protéotoxique, ce qui provoque une réorganisation dramatique du protéome nucléolaire. Ainsi, la fraction du protéomenucléolaire (les protéines ribosomales) qui est modifiée par les chaînes hybrides ub/NEDD8 est exclue du nucléole et séquestrée dans un agrégat immobile. J’ai également trouvé que ce processus est réversible puisqu’une fois que le stress disparait les agrégats sont désassemblés au sein du compartiment nucléaire. Cette phase de récupération dépend de la présence d’un protéasome nucléaire actif au sein des agrégats. En effet, alors que des données précédentes indiquaient que les chaînes hybrides ub/NEDD8 altéraient le signal qui conduit à leur dégradation par le protéasome, j’ai mis en lumière que le protéasome nucléaire peut reconnaître ce type de signal afin de désassembler l’inclusion pendant la phase de récupération. De plus, j’ai révélé l’importance de l’expression des ARN synthétisés par la RNA Polymerase I pendant le stress afin de permettre le désassemblage d’agrégats nucléaires une fois que le stress disparaît.Mon étude a donc révélé un signal auparavant non caractérisé, qui peut être reconnu par le protéasome nucléaire afin de promouvoir l’élimination des agrégats nucléaires. J’ai également déterminé que le nucléole est le centre du système de contrôle qualité des protéines nucléaires via la gestion des agrégats protéiques et le contrôle de leur élimination.Cells are frequently exposed to environmental stresses including exposure to high temperatures, oxidative stress or acidosis that cause protein misfolding. Aberrant proteins have the propensity to form toxic insoluble aggregates that have been linked to many neurodegenerative diseases, cancer and ageing. Cells have developed sophisticated pathway to cope with such stresses and avoid the accumulation of proteins into inclusions. The Protein Quality Control (PQC) maintains protein homeostasis by repairing, refolding or targeting for degradation damaged proteins. The family of ubiquitin and ubiquitin-like molecules such as NEDD8 and SUMO play a key role in the PQC system. The formation of ubiquitin (ub) chains on target substrates is an important step towards the elimination of aggregation prone proteins.However, we recently discovered that under proteotoxic stress such as heat shock and proteasomal inhibition, NEDD8 alters the ubiquitin signal via the formation of “hybrid” ub/NEDD8 chains on specific misfolded proteins that lead to their aggregation within the nucleus. While the cytosolic PQC is pretty well explored, knowledge about the nucleus and how it can deal with misfolded proteins is still very limited. In this study, we investigated the nature and mechanisms of elimination of stress-induced nuclear protein aggregates. Understanding the mechanisms that regulate the elimination of aggregates may reveal approaches to re-establish normal cellular function.I discovered a protein quality control pathway specifically operating in the nucleus to deal with nuclear aggregates. Indeed, I found that nuclear aggregate formation is related to the nucleolus, the center of ribosome biogenesis. The nucleolus represents one of the best characterized membranes less organelles, formed by the phenomenon of liquid-liquid phase separation. By using diverse microscopy techniques, I found that the biophysical properties of the nucleolus are altered upon proteotoxic stress, resulting in a dramatic reorganization of the nucleolar proteome. In particular, the fraction of the nucleolar proteome (ribosomal proteins) that is modified with hybrid ub/NEDD8 chains are excluded from the nucleolus and sequestered into an immobile aggregate compartment. I found that this is a reversible process, as once stress is alleviated aggregates are disassembled within the nuclear compartment. The recovery is mediated by active nuclear proteasomes that is recruitedwithin the aggregates. In particular, while previous data indicate that hybrid ub/NEDD8 chains alters the proteasomal-dependent degradation signal during stress, I found out that nuclear proteasome can deal with it in order to disassemble the inclusions during the recovery period. More interestingly, I revealed the importance of the expression of RNA Polymerase I-dependent RNAs during the stress period to allow the disassembly of nuclear aggregates once stress is alleviated.My studies revealed previously uncharacterized and unconventional signals that can be recognized by the nuclear proteasome and promote the elimination of nuclear aggregates. More importantly, I found out that the nucleolus is at the center of the nuclear PQC by managing protein aggregates and controlling their elimination
Caenorhabditis elegans, a model to study the nucleus compartments : from the nucleolar stress by neddylation pathway inhibition to the nanoscale chromatin compaction measurements in vivo
No full textNEDD8, molécule de la famille de l’ubiquitine est essentielle au développement, à la croissance et à la viabilité d’un organisme, de plus c’est une cible prometteuse en thérapeutique. Nous avons découvert que l’inhibiteur spécifique de la NEDDylation, MLN4924 altère la morphologie sans fragmentation et augmente la surface du nucléole de cellules humaines et de noyaux de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans. Une approche de protéomique quantitative (SILAC) combiné à l’analyse de la production des ARNr et des ribosomes montrent que MLN4924 change la composition protéique du nucléole sans affecter l’activité transcriptionnelle de l’ARN pol I. Notre analyse montre que MLN4924 active p53 par la voie RPL11/RPL5-Mdm2 caractéristique d’un stress du nucléole. Cette étude identifie le nucléole comme une cible intéressante dans l’utilisation d’inhibiteurs de la NEDDylation et apporte un nouveau mécanisme d’activation de p53 par inhibition de la voie NEDD8.Dans une seconde étude nous avons adapté la méthode de FLIM-FRET (« Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy – Förster Resonance Energy Transfer ») à l’étude de la compaction de la chromatine à l’échelle du nanomètre dans un organisme vivant. Le nématode Caenorhabditis elegans s’est révélé être un modèle de choix. Au sein des chromosomes méiotiques, nous avons identifié différentes régions de compaction, de niveau variable par mesure du FRET entre histones fusionnées à des protéines fluorescentes. Par une approche originale d’ARN interférence et injection d’un « extra-chromosome » nous avons défini l’architecture à une nano-échelle de différents états de l’hétérochromatine et montré que cette organisation est contrôlée par les protéines HP1 « Heterochromatin Protein 1 » et SETDB1, une protéine « H3-Lysine 9 methyl transferase ». Nous avons également montré que la compaction de l’hétérochromatine est dépendante des condensines I et II et plus particulièrement la condensine I contrôle l’état faiblement compacté de la chromatine.Nos travaux ont confirmé que C. elegans est un modèle d’intérêt majeur pour l’étude des compartiments nucléaires et parfaitement adapté pour des études pré-clinique.The ubiquitin-like molecule NEDD8 is conserved and essential for viability, growth and development; its activation pathway is a promising target for therapeutic intervention. We found that the small molecule inhibitor of NEDDylation, MLN4924, alters the morphology and increases the surface size of the nucleolus in human cells and Caenorhabditis elegans germ cells in the absence of nucleolar fragmentation. Through SILAC proteomic analysis and rRNA production, processing and ribosome profiling, we show that MLN4924 changes the composition of the nucleolar proteome but does not inhibit RNA Pol I transcription. Further analysis demonstrates that MLN4924 activates the p53 tumour suppressor through the RPL11/RPL5-Mdm2 pathway, with characteristics of nucleolar stress. The study identifies the nucleolus as a target of the NEDDylation pathway and provides a mechanism for p53 activation upon NEDD8 inhibition.Then we adapted a quantitative FRET (Förster resonance energy transfer)-based fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) approach to assay the nano-scale chromatin compaction in a living organism, the nematode Caenorhabditis elegans. By measuring FRET between histone-tagged fluorescent proteins, we visualized distinct chromosomal regions and quantified the different levels of nanoscale compaction in meiotic cells. Using RNAi and repetitive extrachromosomal array approaches, we defined the heterochromatin state and showed that its architecture presents a nanoscale-compacted organization controlled by Heterochromatin Protein-1 (HP1) and SETDB1 H3-lysine-9 methyl-transferase homologs in vivo. Next, we functionally explored condensin complexes. We found that condensin I and condensin II are essential for heterochromatin compaction and that condensin I additionally controls lowly compacted regions. Our data show that, in living animals, nanoscale chromatin compaction is controlled not only by histone modifiers and readers but also by condensin complexes.We confirm that C. elegans is an interesting model to study nuclear signalling and perfectly adapt to be a platform for pre-clinical studies
Le rôle de la voie de NEDD8 dans l'invasion cellulaire et le developpement de stratégies pour l'utilisation des inhibiteurs de NEDD8 en clinique
No full textLes modifications post-transrationnelles avec les molécules ubiquitine et ubiquitine-like sont des mécanismes essentiels pour la régulation des fonctions protéiques et des voies de signalisations. Les ubiquitine-like molécules comme par exemple NEDD8 jouent un rôle majeur dans la fonction des protéines et sont impliqués dans des maladies humaines comme par exemple les maladies neuro dégénératives. NEDD8 est essentiel pour la survie, la croissance et le développement. C’est pour ceci, l’élucidation de leurs mécanismes d’action est très importante.Dans notre laboratoire, nous nous intéressons à l’ubiquitine-like molécule NEDD8. Le mécanisme de modification avec cette protéine est dit NEDDylation et il nécessite une intervention enzymatique médiées par E1, E2 et E3. Le rôle majeur de NEDD8 est la régulation de l’activité des Cullins, des E3 ubiquitine ligases. Les Cullins sont des scaffolds dont le rôle est de faciliter la dégradation des substrats en assemblant tout le complex enzymatique. La dérégulation de l’activité des Cullins a été montrée de contribuer à l’oncogenèse suite à l’accumulation des oncoprotéines ou suite à la dégradation excessive des suppresseurs de tumeurs. Récemment, la voie de NEDDylation a été ciblée pour des interventions thérapeutiques ; MLN4924 (Provenodistat) (Millenium Pharmaceuticals) bloque la voie de NEDDylation en formant une liaison covalente avec l’enzyme E1 de la voie de NEDDylation. L’identification des mécanismes de régulation des fonctions protéiques par NEDD8 fournira plus d’informations sur le mécanisme d’action de NEDD8 d’un point de vu moléculaire, ce qui permettra l’identification de nouvelles cibles pour de nouvelles interventions thérapeutiques. Dans 50% des tumeurs, le gène p53 est muté. Dans les 50% qui restent, le gène p53 est intact mais la protéine est non fonctionnelles dû à des dérégulations des voies de signalisations. Nous avons trouvé que l’inhibition de la NEDDylation via MLN4924 bloque l’invasion des cellules de mélanomes métastatiques. D’un point de vu moléculaire, MLN4924 provoque la dégradation de Mdmx, l’homologue de Mdm2, tous les deux sont des majeurs régulateurs négatifs de p53. Ceci est dû à la formation d’un complexe entre Mdmx, Mdm2 et Cullin4A inactif. On a démontré que la dégradation de Mdmx est essentielle pour l’activation de la voie RhoA/ROCK capable de bloquer l’invasion tout en modulant le cytosquelette d’actine.De plus, Mdmx a été identifié en tant que régulateur de l’activité de RhoA. Mdmx se lie à la forme inactive de RhoA (GDP-RhoA) et contrôle son activation. Durant les travaux de recherche, nous avons aussi essayé de développer une méthode nous permettant d’utiliser MLN4924 d’une façon spécifique dans le but de minimiser les effets secondaires normalement accompagnant les traitements de chimiothérapies. MLN4924 comme tout agent chimio-thérapeutique, est toxique envers les cellules normales. Dans le but d’utiliser MLN4924 d’une manière spécifique nous permettant de cibler uniquement les cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales, nous avons testé cette molécule dans une approche basée sur le statut de p53 appelé « cyclotherapie ».Nos résultats montrent que l’activation de p53 avec des concentrations minimes d’Actinomycine D, induit un arrêt du cycle cellulaire dans la phase G1, protégeant ainsi les cellules de l’effet toxique de MLN4924. Ceci n’est pas le cas pour les cellules cancéreuses dont p53 est déficient ou sans p53. Celles-ci progressent en phase S où elles seront éliminées par apoptose. Cette combinaison a été aussi testée in vivo, plus spécifiquement en utilisant les zebrafish comme model, ce qui nous a permis de confirmer l’effet protecteur de l’Actinomycine D contre l’effet toxique de MLN4924. Nos résultats constituent une nouvelle possibilité de combinaison de MLN4924 basé sur le statut de p53.Post-translational modifications with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (ubls) are essential regulatory mechanisms of protein function and signalling networks. Ubiquitin-like molecules, such as NEDD8 have emerged as major mechanisms of protein function regulation and implicated in human diseases including cancer and neurodegeneration. It is essential for viability, growth and development. Therefore, the elucidation of their mechanism of action is critical. In our lab, research is focused on NEDD8. The process called NEDDylation, involves the three enzymatic activities (E1, E2 and E3). The well-known role of NEDD8 is the regulation of the activity of E3 ubiquitin ligases called Cullin Ring Ligases through modification of Cullins. Cullins are scaffolds to facilitate E3 ligase complex assembly and mediated substrate degradation. Deregulation of Cullins activity has been shown to contribute to oncogenesis through the accumulation of oncoproteins or excessive degradation of tumour suppressors. Recently, the NEDDylation pathway has been targeted for therapeutic intervention; MLN4924 (Pevonedistat) (Millenium Parmaceuticals) forms a covalent adduct with the NEDD8 E1 enzyme and blocks the NEDDylation cascade. Identification of mechanisms of protein function regulation by NEDDylation will provide the molecular basis for the action of the NEDD8 inhibitors in clinic and potentially identify novel targets for therapeutic intervention. In 50% of tumours the TP53 is mutant. In cancer cells where TP53 is WT, upstream or downstream signalling pathways are deregulated. We found that inhibition of NEDDylation by MLN4924 dramatically blocks invasion of metastatic melanoma cells. At the molecular level, MLN4924 induces proteasomal degradation of the Mdmx oncogene product, a key negative regulator of the p53 tumor suppressor. Mechanistically, MLN4924 induces the complex formation of Mdmx with Mdm2 and inactive Cullin4A that promote Mdmx degradation. We found that the degradation of Mdmx is required for the activation of the RhoA/ROCK pathway which blocks cell invasion through changes in the cell cytoskeleton. Interestingly, Mdmx was identified as regulator of RhoA activity through binding with inactive RhoA (GDP- bound RhoA). Another question was addressed which is how to use MLN4924 in a specific manner, thus reducing side effects usually resulting from chemo treatments. MLN4924 as all chemo-agents, is toxic towards healthy cells. In order to use MLN4924 in a specific manner targeting cancer cells specifically leaving healthy cells unharmed, a p53 based cyclotherapy was tested. Our results show that low activation of wild type p53 by low doses of Actinomycin D, causes a G1 cell cycle arrest and protects normal cells from MLN4924 treatment leaving cancerous cells with mutant p53 or no p53 to progress to S-phase and selectively commit apoptosis upon MLN4924 treatment. Our protocol was tested in vivo, in zebrafish model system confirming the protective effect of LDACTD against the cytotoxic effect of MLN4924. Our results provide a possible combination therapy for MLN4924 based on the p53 status
Régulation de protéotoxicité via la NEDDylation atypique
No full textLes cellules sont constamment exposées à des stress « protéotoxiques » qui altèrent leurs protéines. Si les protéines endommagées ne sont pas réparées ou éliminées, elles peuvent former des agrégats toxiques pouvant conduire à l’émergence de plusieurs maladies, telle que les maladies neurodégénératives et le cancer. Pour éviter cette toxicité, les cellules ont développé plusieurs stratégies qui collaborent et communiquent afin d'assurer le contrôle de qualité des protéines et maintenir l’intégrité du protéome cellulaire. L’ensemble de ces stratégies forment le réseau de l’homéostasie protéique ou « protéostasie ». Ce réseau inclus les chaperonnes moléculaires, les systèmes protéolytiques (lysosomes, protéasomes) et des systèmes de séquestration des protéines endommagées. L’Ubiquitine et les protéines apparentées à l’Ubiquitine telle que SUMO et NEDD8, sont des effecteurs essentiels de ce réseau. Ces molécules modifient leurs substrats de façon covalente, grâce à l’action d’une cascade d’enzymes E1, E2 et E3. En principe, on considérait que chacune de ces voies employait sa propre cascade enzymatique pour la modification post-traductionnelle de ses substrats. L’Ubiquitination joue un rôle essentiel dans la réponse au stress cellulaire, surtout en assurant la dégradation protéasomique des protéines mal repliées. Récemment, notre laboratoire a trouvé que plusieurs stress protéotoxiques telle que l’inhibition du protéasome, un choc thermique et un stress oxydatif, causent une augmentation de NEDDylation. De manière remarquable, cette augmentation ne dépend pas de l’enzyme d’activation de NEDD8 NAE, mais plutôt de celle de l’Ubiquitine Ube1. De plus, elle se caractérise par la formation des chaînes poly-NEDD8 et des chaînes mixtes entre NEDD8 et Ubiquitine. Ce processus est réversible et une restauration cellulaire est obtenue une fois le stress atténué. Le but de notre projet est de caractériser la réponse de NEDD8 au stress cellulaire ou ce qu’on appelle « la NEDDylation atypique » en vue de comprendre son effet biologique pendant ces conditions. Nos résultats montrent que la NEDDylation atypique dépend des protéines de stress Hsp70/90 et qu’elle cible principalement les protéines nouvellement synthétisées et mal repliées. On montre que, suite à leur modification par NEDD8/Ubiquitin, ces protéines sont transloquées du cytosol au noyau, où elles sont dégradées par le protéasome. Cependant, des conditions de stress prolongé causent une atténuation de l’activité nucléaire des protéasomes 26S, ce qui provoque alors l’accumulation des protéines endommagées sous forme d’inclusions nucléaires. Ces dernières sont réversibles et peuvent être éliminées par le protéasome une fois le stress atténué. Afin d’identifier les cibles de NEDD8 dans des conditions de stress, nous avons développé une approche protéomique basée sur une stratégie de mutation ponctuelle (NEDD8R74K). Cette stratégie permet l’identification des sites spécifiques de NEDDylation au sein des protéines cibles. Cette approche en combinaison avec le SILAC a permis l’identification de NEDD8, Ubiquitine, SUMO-2 et les protéines ribosomiques en tant que principales cibles de NEDD8 en réponse au stress. Ce qui était plus intéressant est que, en appliquant l’étude protéomique SILAC, on a pu constater que le rôle essentiel de la NEDDylation atypique est d’induire l’agrégation/séquestration d’un ensemble spécifique de protéines au sein des inclusions nucléaires. De plus, nous avons montré que l’agrégation induite par NEDD8 protège les protéasomes nucléaires d’une sévère déficience et permet une meilleure survie cellulaire pendant le stress. Notre étude présente NEDD8 comme un nouvel effecteur dans le réseau de protéostasie, elle identifie une nouvelle inclusion nucléaire cytoprotectrice et montre que la NEDDylation atypique est essentielle pour la réponse cellulaire au stress.Cells are continuously endangered by a variety of proteotoxic stresses that cause protein misfolding and accumulation. Defects in repair or elimination of protein damage can lead to the formation of toxic aggregates that have been associated with diseases, such as neurodegenerative disorders and cancer. To prevent this toxicity, cells have evolved multiple quality control processes that interact and cooperate to maintain protein homeostasis leading to cellular fitness. These processes form “the proteostasis network”, and include molecular chaperones, proteolytic machineries (lysosomes, proteasomes) and pathways for protein damage sequestration. One of the main effectors of this network is the Ubiquitin and the Ubiquitin-like molecules, such as SUMO and NEDD8. These molecules covalently modify proteins through the action of E1, E2 and E3 enzymes. Historically, it was believed that each pathway employed its own and unique set of enzymes to post-translationally modify its substrates. Ubiquitination is essential for the cellular response to stress, especially by targeting misfolded proteins for proteasomal degradation. However, we recently discovered that proteotoxic stresses including proteasome inhibition, heat shock and oxidative stress induce a global increase in protein NEDDylation. Surprisingly, this increase does not depend on the NEDD8 activating enzyme NAE, but rather on the Ubiquitin activating enzyme Ube1, and is characterized by the formation of poly-NEDD8 chains and mixed chains between NEDD8 and Ubiquitin. Importantly, this process is reversible and cell recovery is accomplished once stress is alleviated. In this study, we focused on characterizing the NEDD8 response to stress or “atypical NEDDylation” in order to understand its biological relevance under these conditions.Our results showed that atypical NEDDylation depends on Hsp70/90 and targets mainly newly synthesized damaged proteins. We showed that, after their NEDDylation/Ubiquitination, misfolded proteins are progressively translocated from the cytosol into the nucleus for proteasomal degradation. However, upon prolonged stress conditions, the activity of nuclear 26S proteasome is compromised, resulting in the accumulation of these conjugates into nuclear inclusions. These inclusions are reversible and eliminated by nuclear proteasomes once stress is alleviated. In order to identify NEDD8 targets upon these conditions, we developed a proteomic approach based on a point mutation strategy (NEDD8R74K) that enables a site-specific analysis of NEDDylated proteins. This approach in combination with SILAC allowed the identification of NEDD8, Ubiquitin, SUMO-2, and ribosomal proteins as the major NEDD8 targets upon stress. Interestingly, by SILAC proteomics we found that the main function of atypical NEDDylation is to induce the aggregation/sequestration of a specific subset of proteins within the nuclear inclusions. We showed that this NEDD8-induced aggregation protects nuclear proteasomes from a severe impairment and allows a better cell survival upon proteotoxic stress.Our study defines NEDD8 as a new effector in the proteostasis network, identifies a new cytoprotective nuclear inclusion and shows that atypical NEDDylation is essential for the cellular response to stress
Protein ubiquitylation profiling in bortezomib resistant cells : role of ubiquitin enzymes
No full textL’altération de la protéostase peut être la cause ou conséquence de pathologies comme le lymphome à cellules du manteau (MCL), lymphome non-hodgkinien agressif avec un faible taux de survie et des rechutes après un traitement par l'inhibiteur de protéasome Bortezomib (BTZ). Les voies Ubiquitine-protéasome (UPS) et autophagie-lysosome (ALS) reposent sur l'Ubiquitine (Ub) pour la dégradation intracellulaire des protéines au sein d’un seul réseau protéolytique coordonné. A l’aide de pièges à Ub (TUBEs) associés à la spectrométrie de masse (MS) pour comparer le protéome de l'Ub de la lignée cellulaire MCL résistante au BTZ (ZBR) et de son homologue parental (Z138), notre équipe a découvert que l’Ub joue un rôle dans la réponse au BTZ et dévoilé un passage moléculaire de l'UPS à l'ALS, décrivant la protéaphagie comme une caractéristique de la résistance au BTZ. On observe également un enrichissement des chaînes d'Ub K63 dans la lignée ZBR. Notre hypothèse est que cet enrichissement pourrait la prédisposer à activer l'autophagie et les événements de signalisation liés à la résistance au BTZ, le but étant d’identifier le mécanisme et protéines impliqués. A cette fin, nous avons identifié le protéome d'Ub associé aux chaînes d'Ub K63 et K48 des cellules Z138/ZBR. Des traitements chimiques combinatoires permettent en outre de bloquer les enzymes E3 enrichies dans ZBR (TRIM24, UBR2, UBR4 et UBR5) et le récepteur d'autophagie p62. TRIM24 est plus enrichi dans les cellules ZBR aux niveaux basaux. Sa stabilité est compromise différemment dans les cellules Z138 et ZBR après inhibition du protéasome ou de l'autophagie en utilisant la Bafilomycine A (BafA), suggérant qu’elle joue un rôle dans la diaphonie UPS-ALS. Nous avons utilisé dTRIM24, une chimère validée ciblant la protéolyse (PROTAC) pour cibler TRIM24 dans nos modèles. Un traitement dTRIM24/ZBR réduit le protéasome et favorise les effets apoptotiques coopératifs dans les cellules ZBR. Leur traitement par dTRIM24 favorise la formation des chaînes K48 et K63 et la fraction associée à l'Ub de p62 et des sous-unités du protéasome. Les protéines UBR participent à la régulation de la voie de la règle N-end, qui cible le protéome Arg pour la dégradation via le domaine ZZ du récepteur d'autophagie p62/SQSTM1 en situation de stress protéotoxique. La vertéporfine (VTP) induit fortement l'apoptose des cellules ZBR, seule ou en combinaison avec le BTZ. Comme la VTP induit des espèces ROS, nous avons utilisé un inhibiteur du domaine ZZ de la p62 (XRK3F2) pour explorer le rôle de la p62 sur les enzymes UBR. Nous avons constaté que XRK3F2 a un impact différent sur la stabilité des enzymes UBR dans les cellules ZBR et Z138. La viabilité des cellules Z138 et ZBR est similaire lors d'un traitement individuel ou combiné au BTZ, ce qui suggère que les changements dans les niveaux de protéines des enzymes UBR ne sont pas associés à la résistance au BTZ et que la VTP est un meilleur traitement pour augmenter l'apoptose dans les cellules ZBR.Pour mieux comprendre la réponse à la VTP dans les cellules résistantes au BTZ, nous avons caractérisé les nanobodies spécifiques des chaînes K48 et K63 avec Hybrigenics (outils commercialisés par Nanotag). Après avoir établi les conditions pour les nanobodies-précipitations (NP), le protéome d'Ub des cellules ZBR et Z138 traitées ou non avec la VTP a été analysé par MS. Les résultats confirment l’enrichissement des chaînes K63 dans ZBR, fournissant une liste de protéines candidates jouant un rôle dans la résistance au BTZ.Disruption of proteostasis is often the cause or consequence of pathologies, including haematological malignancies like Mantle Cell lymphoma (MCL). MCL is an aggressive non-Hodgkin lymphoma, with a poor rate of survival and frequent relapses after Bortezomib (BTZ) treatment. The two major intracellular degradation pathways, the Ubiquitin-proteasome (UPS) and autophagy-lysosome (ALS) systems, rely on Ubiquitin (Ub) to drive protein degradation acting as a single coordinated network. Using Ub traps (TUBEs) associated to mass spectrometry (MS) to compare the Ub proteome of the BTZ-resistant MCL cell line (ZBR) and its parental BTZ-sensitive counterpart (Z138), the hosting lab found Ub playing a major role in BTZ response/resistance and unveiled a molecular switch from UPS to ALS, describing proteaphagy as a hallmark of resistance. K63 Ub chains and other enzymes were also detected enriched in ZBR in this analysis. We hypothesized that this enrichment could predispose them to activate autophagy and signaling events implicated in MCL cell survival and BTZ resistance, being focused on the identification of mechanism and proteins directly involved. To explore this hypothesis, we used several experimental strategies including the isolation and identification of the Ub proteome, and the used of combinatorial chemical treatments. TRIM24, which is known to regulate the activity of the tumor suppressor p53, was found more enriched in ZBR cells at basal levels. TRIM24 stability is compromised differently after inhibition of the proteasome (BTZ) or autophagy using Bafilomycin A (BafA), in Z138 and ZBR cells suggesting a possible role in UPS-ALS crosstalk. We have used dTRIM24, a validated Proteolysis Targeting Chimeric (PROTAC) to target TRIM24 in our MCL model. Our results show that a combined dTRIM24/ZBR treatment reduces proteasome levels and promotes cooperative apoptotic effects in the ZBR cell line. Interestingly, a dTRIM24 treatment enhanced the formation of K48 and K63 chains and the Ub-associated fraction of p62 and proteasome subunits in ZBR cells. UBR proteins (UBR2, UBR4 and UBR5 found enriched in ZBR) are involved in the regulation of the N-end rule pathway, related to the ZZ domain of the autophagy receptor p62/SQSTM1 under proteotoxic stress conditions. Verteporfin (VTP), one of the most effective p62 inhibitors, strongly induces apoptosis in ZBR cells. However, since VTP also induces ROS (oxygen-containing reactive species), we used an inhibitor of the p62 ZZ domain (XRK3F2) to further explore the role of p62 and its impact on UBR enzymes. We found that XRK3F2 differently affects the stability of UBR enzymes in ZBR compared to Z138 cells. However, the viability of Z138 and ZBR cells was similar, suggesting that changes in protein levels of UBR enzymes are not associated to BTZ resistance and that VTP is a better treatment to enhance apoptosis in ZBR cells. To better understand the response to VTP in BTZ-resistant cells, we collaborated with Hybrigenics to characterise K48 and K63 Ub chain specific nanobodies (now commercialised by Nanotag)
Approches de biologie chimique dans la voie NEDD8
No full textUne famille de petites protéines, appelée famille des molécules d'ubiquitine (Ubls), joue un rôle essentiel dans de nombreux aspects de la réponse au stress. Des défauts dans les composants de la famille de l'ubiquitine sont souvent retrouvés dans les pathologies, notamment dans certain type de cancer et les maladies neurodégénératives.L'une des Ubls qui présente le plus d'identité et de similarité avec l'Ubiquitine est NEDD8. NEDD8 fonctionne de manière similaire à Ub mais utilise un mécanisme de conjugaison distinct. La modification de NEDD8 est essentielle au maintien de l'homéostasie de la cellule car elle joue un rôle majeur dans la régulation de la viabilité, de la croissance et du développement. Pour cette raison, de nombreux composants de NEDD8 ont été dérégulés dans de nombreux cancers. NEDD8 peut modifier un large éventail de substrat protéique, et peut également s’auto-modifier entrainant la création de chaînes polyNEDD8. Récemment, la présence de chaînes polyNEDD8 a été liée à la régulation de la mort cellulaire - apoptose et parthanatos. De plus, il a été récemment rapporté que NEDD8 pendant un stress protéotoxique peut être employé par la machinerie de conjugaison Ub. Cela aboutit à la création de chaînes NEDD8 hybrides tels que NEDD8-Ub et NEDD8-SUMO. En effet, des articles récents ont montré que NEDD8 a non seulement la capacité de modifier Ub mais également SUMO-2. La présence des chaînes hybrides NEDD8 a été liée à la création d'agrégats nucléaires formés pendant le stress protéotoxique, ce qui peut jouer un rôle protecteur pendant l'exposition au stress.Connaissant l'importance de la régulation des protéines par la NEDDylation, nous étions également conscients du manque de connaissances sur le mécanisme qui joue un rôle dans la création et la déconjugaison des différentes entités NEDD8. Jusqu'à présent, deux enzymes déNEDDylantes ont été signalées, mais aucune enzyme n'a été testée pour sa capacité à reconnaître et à traiter les chaînes hybrides NEDD8. De plus, nos connaissances sur les ligases E3 responsables de la NEDDylation du substrat, bien qu'en expansion, sont encore très limitées. De plus, étant donné que NEDD8 peut s’auto-modifier via l’utilisation de l’une de ses dix lysines, elle peut générer une très large gamme de signaux par la formation de chaînes polyNEDD8 et hybrides NEDD8. Ces chaines peuvent être reconnues de la même manière que les chaînes polyUb, mais aucune étude ne s'est concentrée sur la détermination de leurs interacteurs jusqu'à présent.Dans ce travail, nous nous sommes concentrés sur l'exploration de ces mécanismes inconnus de conjugaison et de déconjugaison de NEDD8 mentionnées précédemment. En utilisant des approches de biologie chimique, nous avons testé une variété d'enzymes et déterminé que les chaînes polyNEDD8 sont exclusivement traitées par l'enzyme NEDP1. Cependant, la déconjugaison des chaînes hybrides NEDD8 nécessite l'action coordonnée de différentes enzymes de déconjugaison avec une spécificité distincte pour Ub ou SUMO. Nous avons également utilisé des dimères NEDD8-NEDD8 et NEDD8-Ub synthétisés chimiquement afin de rechercher leurs interacteurs et utiliser les données recueillies pour approfondir nos connaissances sur la biologie des chaînes hybrides NEDD8 dans les agrégats nucléaires. En utilisant les sondes NEDD8-Dha, nous avons identifié un groupe de protéines qui sont potentiellement impliquées dans la machinerie de NEDDylation. Par la confirmation biologique des résultats obtenus, nous avons montré que les ARNt ligases - GARS et SARS fonctionnent comme des ligases E3 de NEDD8. De plus, RNF20 fonctionne également comme une NEDD8 E3 ligase responsable de la NEDDylation de l'histone H2B mais aussi de PARP1 - une des protéines acteurs clés dans la formation des SG.Understanding how organisms respond to environmental stress has critical implications both on quality of life and treatment of diseases. Organisms have developed a series of sophisticated processes to detect and repair such damages. A family of small proteins called the family of Ubiquitin molecules (Ubls), play a critical role in many aspects of the stress response. Defects in components of the Ubiquitin family are often found in pathologic conditions including cancer and neurodegenerative diseases. Understanding how the ubiquitin family is involved in the cellular stress response is an important step in the understanding of this process and can lead to the development of novel therapeutic approaches to treat diseases caused by malfunction of this system.One of the Ubls that has the highest identity and similarity to Ubiquitin is NEDD8. NEDD8 works in a similar manner to Ub, using a distinct conjugation machinery. NEDD8 modification is essential for maintaining the homeostasis of the cell as it plays a major role in the regulation of viability, growth, and development. Because of that, many components of NEDD8 have been found deregulated in many cancers. NEDD8 can modify a wide range of substrate proteins, including itself, which results in the creation of polyNEDD8 chains. Recently the presence of polyNEDD8 chains has been linked to the regulation of cell death – apoptosis and parthanatos. Moreover, it has been recently reported that NEDD8 during proteotoxic stress can be employed by the Ub conjugation machinery. This results in the creation of hybrid NEDD8 chains where except for NEDD8, we can also find Ub and SUMO, as recent papers have shown that NEDD8 has the ability to modify Ub and SUMO-2. The presence of the hybrid NEDD8 chains was linked with the creation of nuclear aggregates formed during proteotoxic stress, which can play a potential protective role during stress exposure.Knowing how important the regulation of proteins through NEDDylation is, we were also aware of the lack of knowledge about the machinery that plays a role in the creation and deconjugation of different NEDD8 entities. So far two deNEDDylating enzymes were reported but no enzyme was tested for its ability to recognise and process the hybrid NEDD8 chains. Moreover, our knowledge about E3 ligases that are responsible for substrate NEDDylation, even though expanding, is still very limited. Additionally, NEDD8 having ten lysines through which it can modify itself, can generate a very broad range of signals through polyNEDD8 and hybrid NEDD8 chain formation, which can be recognised similarly to polyUb chains, yet no studies have focused on determining their interactors so far.In this work, we focused on exploring the beforementioned unknown elements of the NEDD8 conjugation and deconjugation machineries. Using chemical biology approaches we tested a variety of enzymes and determined that polyNEDD8 chains are exclusively processed by the NEDP1 enzyme, however, deconjugation of hybrid NEDD8 chains requires the coordinated action of different deconjugating enzymes with distinct specificity for Ub or SUMO. We also employed chemically synthesized NEDD8-NEDD8 and NEDD8-Ub dimers in order to look for their interactors and used the gathered data to deepen our knowledge about the biology of hybrid NEDD8 chains in nuclear aggregates. Using NEDD8-Dha probes we identified a group of proteins that are potentially involved in the NEDDylation machinery. Through biological confirmation of obtained results we have shown that tRNA ligases – GARS and SARS are working as NEDD8 E3 ligases. Moreover, RNF20 is also working as a NEDD8 E3 ligase responsible for NEDDylation of histone H2B but also PARP1 – one of the proteins that are key players in the formation of SG
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Get PDF“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Get PDFWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
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