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Investigação sobre os efeitos da administração intracerebral do ácido D-2-hidroxiglutárico sobre a homeostase redox e histopatologia em cérebro de ratos neonatos
Full text linkA acidúria D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) é uma doença neurometabólica primeiramente descrita por Chalmers e colaboradores, caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária do ácido D-2-hidróxiglutárico (D-2-HG). A nível molecular, a D2HGA pode ser causada por mutações no gene que codifica a enzima mitocondrial D-2-hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGDH) levando a deficiência desta enzima ou por mutações específicas de ganho de função da isocitrato desidrogenase 2 (IDH2). As manifestações clínicas da D-2-HGA são majoritariamente neurológicas, tais como epilepsia, hipotonia e retardo no desenvolvimento mental e psicomotor. Esse erro inato do metabolismo apresenta dois fenótipos distintos: uma forma neonatal grave e com risco de vida e uma variante mais branda da doença. Visto que os mecanismos fisiopatogênicos responsáveis pelo dano ao SNC nos pacientes afetados por essa doença ainda não estão totalmente elucidados, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos ex vivo da administração intracerebroventricular (icv) do D-2HG a ratos Wistar neonatos sobre a homeostase redox e a imunohistopatologia nas principais estruturas cerebrais afetadas nos pacientes com D-2-HGA (estriado e córtex cerebral). Em alguns experimentos, os animais foram pré-tratados intraperitonealmente com o antioxidante melatonina ou com o antagonista de receptores glutamatérgico do tipo NMDA MK-801 uma hora antes da administração icv de D-2-HG. Inicialmente, avaliamos os efeitos do D-2-HG 6 horas após a administração icv sobre os parâmetros de homeostase redox. Os resultados mostraram que a administração de D-2-HG induziu lipoperoxidação, determinada pelo aumento significativo nos níveis de malondialdeído (MDA), em estriado e córtex cerebral dos animais neonatos. Também verificamos que o D-2-HG promoveu uma redução significativa do conteúdo de grupos sulfidrilas em estriado e aumento na formação de grupamentos carbonila no córtex cerebral, evidenciando dano oxidativo às proteínas em ambas as estruturas. Além disso, o metabólito aumentou a oxidação da 2’,7’ - diclorofluoresceína (DCFH) no córtex cerebral e estriado, o que, somado ao aumento nos níveis de nitratos e nitritos em cérebro total, sugere que o D-2-HG provocou um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio. Por outro lado, as concentrações de GSH foram diminuídas no córtex cerebral e as atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) aumentadas, indicando um provável mecanismo compensatório com aumento da transcrição gênica secundário a elevação das espécies reativas. Demonstramos também que o dano oxidativo aos lipídeos e proteínas e o aumento da produção de espécies reativas induzido por D-2-HG foram prevenidos pelo pré-tratamento dos animais com melatonina e MK-801. Contudo, tanto a melatonina quanto o MK-801 não foram capazes de reverter o aumento provocado pelo D-2-HG na atividade da SOD e CAT observados no córtex cerebral. Finalmente, a avaliação morfológica do cérebro por meio da coloração por hematoxilina e eosina, 24 horas após a injeção icv de D-2-HG, revelou a presença de numerosos vacúolos e edema no córtex cerebral, com efeitos semelhantes, mas menos expressivos no estriado. Também observamos, 15 dias após a administração icv do metabólito, um aumento da proteína glial fibrilar ácida (GFAP), indicando a indução de astrogliose. Concluindo, presumimos que um comprometimento da homeostase redox, bem como a excitotoxicidade glutamatérgica possam estar associados às alterações histopatológicas observadas e contribuir, pelo menos em parte, para a neuropatologia encontrada nos pacientes afetados pela D-2-HGA.D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) is a neurometabolic disorder first described by Chalmers et al., biochemically characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxygluataric acid (D-2-HG). At the molecular level, D-2-HGA can be caused by mutations in the gene encoding the mitochondrial enzyme D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGDH) leading to deficiency of this enzyme or by specific gain-of-function mutations in the isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2). The clinical manifestations of D-2-HGA are mostly neurological, such as epilepsy, hypotonia and psychomotor/mental retardation. The neuropathological findings of this disease are mainly anatomical changes in the central nervous system (CNS) such as enlargement of the lateral ventricles (cortical atrophy), changes in the basal ganglia, subependymal cysts and delayed brain maturation. This inborn error of metabolism presents two distinct phenotypes: a severe and life-threatening neonatal form or a mild form of disorder. Considering that the pathophysiological mechanisms underlying the CNS damage observed in affected individuals remain unclear, the aim of the present work was to investigate the ex vivo effects of D-2-HG intracerebroventricular (icv) administration to neonatal Wistar rats on parameters of redox homeostasis and on the immunohistotopathology of the main structures affected in patients with D-2-HGA (striatum and cerebral cortex). In some experiments, the animals were pretreated intraperitoneally with antioxidant (melatonin) or NMDA receptor antagonist (MK-801) one hour prior to icv administration of D-2-HG. D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) is a neurometabolic disorder first described by Chalmers et al., biochemically characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxygluataric acid (D-2-HG). At the molecular level, D-2-HGA can be caused by mutations in the gene encoding the mitochondrial enzyme D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGDH) leading to deficiency of this enzyme or by specific gain-of-function mutations in the isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2). The clinical manifestations of D-2-HGA are mostly neurological, such as epilepsy, hypotonia and psychomotor/mental retardation. The neuropathological findings of this disease are mainly anatomical changes in the central nervous system (CNS) such as enlargement of the lateral ventricles (cortical atrophy), changes in the basal ganglia, subependymal cysts and delayed brain maturation. This inborn error of metabolism presents two distinct phenotypes: a severe and life-threatening neonatal form or a mild form of disorder. Considering that the pathophysiological mechanisms underlying the CNS damage observed in affected individuals remain unclear, the aim of the present work was to investigate the ex vivo effects of D-2-HG intracerebroventricular (icv) administration to neonatal Wistar rats on parameters of redox homeostasis and on the immunohistotopathology of the main structures affected in patients with D-2-HGA (striatum and cerebral cortex). In some experiments, the animals were pretreated intraperitoneally with antioxidant (melatonin) or NMDA receptor antagonist (MK-801) one hour prior to icv administration of D-2-HG. On the other hand, GSH concentrations were decreased only in the cerebral cortex, besides provoking an increase in the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD) and Catalase (CAT), indicating a probable compensatory mechanism with increased gene transcription secondary to observed reactive species elevation. In the striatum, the activity of SOD, CAT and glutathione peroxidase (GPx) were decreased, an effect that can be attributed to oxidative damage to protein structures, leading to a decrease in the catalytic activity of these enzymes. Furthermore, D-2-HG-induced lipid and protein oxidative damage and increase of reactive species production in the cerebral cortex and striatum were prevented by the pretratament with melatonin or MK-801. However, melatonin and MK-801 were not able to reverse the increase caused by D-2-HG in the SOD and CAT activity observed in the cerebral cortex. Finally, histological brain sections 24 hours after the D-2-HG icv injection, stained with hematoxilin and eosin, showed the presence of numerous vacuoles and edema in the cerebral cortex, with less effects in the striatum. Moreover, we observed that 15 days after the administration of metabolite, an increase of the glial fibrillary acidic protein (GFAP), suggesting that D-2-HG promotes astrogliosis. In conclusion, it may be presumed that the disturbance of cell redox homeostasis and glutamatergic excitotoxicity are associated with the histopathological changes observed, and may contribute at least in part to the neuropathology found in patients affected by D-2-HGA
Efeitos da administração in vivo do ácido fitânico sobre parâmetros de homeostase redox em cerebelo de ratos jovens
Full text linkO ácido fitânico (Fit) é um ácido graxo saturado de cadeia ramificada que se acumula em diversas doenças peroxissomais, como na síndrome de Zellweger (SZ) e particularmente na doença de Refsum (DR). Essas doenças podem ocorrer devido a defeitos na biogênese do peroxissomo ou em alguma proteína peroxisomal envolvida na β ou α-oxidação de ácidos graxos. Os pacientes afetados geralmente apresentam disfunções neurológicas, incluindo anormalidades cerebelares. Considerando que a patogênese das alterações cerebelares nas doenças peroxisomais onde o Fit se acumula ainda é pouco conhecida, o presente trabalho se propôs a investigar os efeitos ex vivo de injeção intracerebelar aguda do ácido Fit sobre a homeostase redox e imunohistoquímica em cerebelo de ratos jovens. Os parâmetros de estresse oxidativo determinados foram o dano oxidativo lipídico através dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o dano oxidativo proteico através do conteúdo de sulfidrilas e da formação de carbonilas, as defesas antioxidantes através dos níveis de glutationa total (tGS) e glutationa reduzida (GSH) e da atividade das enzimas antioxidantes glutationa-peroxidase (GPx), glutationa-redutase (GR), glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD), superóxido-dismutase (SOD) e catalase (CAT), bem como a produção de espécies reativas através da formação de nitratos e nitritos (produtos do óxido nítrico, NO•) e da oxidação de 2,7-diclorofluoresceína diacetato (DCF-DA). Além disso, foram feitas análises imunohistoquímicas para avaliar alterações morfológicas, bem como avaliar marcadores de estresse oxidativo no cerebelo dos animais. Nossos resultados demonstraram que o Fit aumentou significativamente a formação de TBA-RS em cerebelo, indicando dano oxidativo lipídico. Além disso, verificamos que os níveis de GSH diminuíram e a produção de óxido nítrico aumentou, demonstrando que esse ácido graxo diminui as defesas antioxidantes e aumenta os níveis de espécies reativas de nitrogênio. Verificamos ainda que a administração prévia de L-NAME preveniu o aumento de TBA-RS e de óxido nítrico, bem como a diminuição de GSH causados pelo Fit em cerebelo. As análises imunohistoquímicas indicaram que o Fit causa astrogliose e dano oxidativo por espécies reativas de nitrogênio, além de demonstrarem que o L-NAME diminui a astrogliose e o dano oxidativo causados pelo Fit. Em resumo, concluímos que o Fit induz dano oxidativo, diminuição das defesas antioxidantes e astrogliose, provavelmente através do aumento das espécies reativas de nitrogênio. Assim, presumimos que as alterações no estado redox celular podem representar um mecanismo patológico que contribui, pelo menos em parte, para a patofisiologia da DR e de outras desordens em que esse ácido graxo se acumula.The phytanic acid (Phyt) is a branched chain saturated fatty acid that accumulates in various peroxisomal diseases such as Zellweger syndrome (ZS) and particularly in Refsum disease (RD). These diseases may occur due to defects in peroxisome biogenesis or some peroxisomal protein involved in β or α-oxidation of fatty acids. Affected patients usually present neurological disorders, including cerebellar abnormalities. Whereas the pathogenesis of cerebellar changes in peroxisomal diseases where Phyt accumulates is still unknown, the present study aimed to investigate the ex vivo effects of an acute intracerebellar injection of Phyt on redox homeostasis and immunohistochemistry in cerebellum of young rats. The oxidative stress parameters determined were the lipid oxidative damage through the levels of thiobarbituric acid (TBA-RS), the protein oxidative damage through the sulfhydryl content and carbonyl formation, antioxidant defenses through the levels of total (tGS) and reduced glutathione (GSH) and activity of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), and the production of reactive species by forming nitrates and nitrites (nitric oxide product, NO) and the oxidation of 2,7-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA). In addition, immunohistochemical analyzes were performed to assess morphological changes and to assess oxidative stress markers in the animals cerebellum. Our results showed that Phyt significantly increased TBA-RS formation in the cerebellum, indicating lipid oxidative damage. In addition, we found that GSH levels decreased and nitric oxide production increased, demonstrating that this fatty acid decreases the antioxidant defenses and increases the levels of reactive nitrogen species. We also found that the prior administration of L-NAME prevented the increase of TBARS and nitric oxide, as well as the decrease of GSH caused by Phyt in cerebellum. Immunohistochemical analyzes indicated that Phyt caused astrogliosis and oxidative damage by reactive nitrogen species, and showed that L-NAME decreased astrogliosis and oxidative damage caused by Phyt. In summary, we conclude that the Phyt induces oxidative damage, decreased antioxidant defenses and astrogliosis, probably by increasing reactive nitrogen species. Thus, we assume that changes in the cellular redox state can represent a pathological mechanism that contributes at least in part to the pathophysiology of RD and other disorders where this fatty acid accumulates
Investigação dos efeitos da ornitina e da homocitrulina sobre as homeostases energética e redox em cerebelo e cultura de astrócitos de córtex cerebral de ratos
Full text linkA síndrome hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinúria (HHH) é um erro inato do metabolismo do ciclo da ureia, de caráter autossômico recessivo e caracterizada por um defeito no transporte mitocondrial de ornitina (Orn), levando a um acúmulo citosólico desse aminoácido, além do acúmulo de homocitrulina (Hcit) e amônia. Os sinais e sintomas clínicos são variáveis, dentre eles podemos citar coagulopatia, coma, letargia, retardo mental, atrofia cortical e ataxia cerebelar. Embora os sintomas neurológicos sejam frequentes, a fisiopatogenia dessa doença ainda é desconhecida. Nesse trabalho investigamos os efeitos in vitro e ex vivo da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos de 30 dias de vida. Além disso, também investigamos os efeitos desses metabólitos sobre alguns parâmetros em astrócitos cultivados de córtex cerebral. Primeiramente investigamos os efeitos in vitro da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos jovens. Ambos metabólitos aumentaram significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Além disso, esses níveis foram totalmente prevenidos pela melatonina e pela glutationa reduzida (GSH). Observamos também que os níveis da produção de nitratos e nitritos não foi alterada por nenhum dos metabólitos utilizados, por outro lado, a Hcit aumentou a produção de peróxido de hidrogênio Ao investigarmos os níves de GSH observamos que tanto a Orn quanto a Hcit reduziram esse parâmetro e que a Orn reduziu o conteúdo de grupamentos sulfidrila, indicando uma dimunioção nas defeas antioxidantes não enzimáticas. Com relação ao metabolism energetic, a Orn e Hcit diminuíram a atividade da enzima aconitase, porém não alteraram outros parâmetros estudados. Além disso, a redução causada pela Orn foi prevenida pela GSH, indicando que essa enzima é suscetível a oxidação causada por exxe aminoácido. Também investigamos os efeitos ex vivo da injeção intracerebelar de Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo e sobre a ativdade da Na+, K+ ATPase. A Orn aumentou significativamente os níveis de TBA-RS e atividade da superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e glucose 6-fosfato desidrogenase e diminuiu a ativdade da Na+,K+-ATPase. Por outro lado, as concentrações de GSH não foram alteradas pelo tratamento com ornitina. Por fim, a Hcit não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros avaliados. Os efeitos da Orn e Hcit foram também investigados em astrócitos cultivados a partir de córtex cerebral de ratos neonatos. Observamos que Orn e Hcit diminuíram a viabilidade celular, a função mitocondrial e os níveis de GSH, porém não alteraram a produção de citocinas. Nossos resultados demonstram um prejuízo moderado na homeostase energética, porém, quando observamos a homeostase redox, observamos um dano mais pronunciado. Dessa forma, concluímos que alterações na homeostase energética, mas principalmente na homeostase redox podem estar envolvidos na fisiopatogenia do dano neurológico observado nos pacientes com a síndrome HHH.Hyperornithinemia-hyperammonemia-homocitrullinuria (HHH) syndrome is an autosomal recessive disorder of urea cycle characterized by a defect in the transport of ornithine (Orn) into mitochondrial matrix leading to accumulation of Orn, homocitrulline (Hcit) and ammonia. The clinical signs and symptoms are variable, ranging from coagulopathy, coma, lethargy, mental retardation, cortical atrophy and cerebellar ataxia. Although neurological symptoms are frequent, the pathophysyology of this disorder is poorly known. In the present study, we investigated the in vitro and ex vivo effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of 30-day-old rats. Besides that, we also investigated the effects of these metabolites on some parameters in cultured cortical astrocytes. We first studied the in vitro effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of young rats. Orn and Hcit significantly increased thiobarbituric acid reative species (TBA-RS) levels that was totally prevented by melatonin and reduced glutathione (GSH). We also found that nitrate and nitrite production was not altered by any of the metabolites, in contrast to hydrogen peroxide production, which was significantly enhanced by Hcit. These results suggest that probably reactive nitrogen species were not involved on the observed results Furthermore, GSH concentrations were significantly reduced by Orn and Hcit and sulfhydryl content by Orn, implying an impairment of antioxidant defenses. As regards to energy metabolism, Orn and Hcit provoked a significant reduction of aconitase activity, without altering other parameters of energy metabolism. Furthermore, Orn-elicited reduction of aconitase activity was totally prevented by GSH, indicating that critical groups of this enzyme were susceptible to oxidation caused by this amino acid. We also investigated the ex vivo effects of intracerebellar administration of Orn and Hcit on important parameters of oxidative stress and on Na+, K+ ATPase activity. Similarly with our in vitro results, Orn significantly increased TBA-RS levels and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and reduced Na+,K+-ATPase activity. In contrast, GSH concentrations were not changed by Orn treatment. Furthermore, intracerebellar administration of Hcit was not able to alter any of these parameters. The effects of Orn and Hcit were also investigated in cultured cortical astrocytes. We observed that Orn and Hcit diminished cellular viability, mitochondrial function, GSH levels, without altering cytokine production. Our results demonstrate a mild impairment in energy metabolism, but mostly in redox homeostasis in cerebellum and cortical cultured astrocytes. Therefore, we conclude that alterations of energy metabolism and especially redox homeostasis may be involved in the pathophysiology of the neurological damage observed in patients with HHH syndrome
Efeitos de ácidos graxos hidroxilados de cadeia longa acumulados nas deficiências da 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase de cadeia longa e da proteína trifuncional mitocondrial sobre a homeostase energética mitocondrial nos músculos cardíaco e esquelético de ratos jovens
Full text linkAs deficiências da 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase de cadeia longa (LCHAD) e da proteína trifuncional mitocondrial (MTP) são defeitos hereditários na oxidação de ácidos graxos. Os pacientes apresentam acúmulo de ácidos graxos hidroxilados de cadeia longa (LCHFA), especialmente os ácidos 3- hidroxitetradecanoico (3HTA) e 3-hidroxipalmítico (3HPA), no sangue e outros tecidos. A sintomatologia é bastante variada, incluindo cardiomiopatia severa e sintomas musculares como fraqueza, dor e episódios recorrentes de rabdomiólise, assim como hepatopatia, retinopatia, hipotonia, neuropatia periférica, atraso no desenvolvimento e na fala, podendo levar a morte ainda na infância. Considerando que os mecanismos patogênicos do dano aos tecidos musculares cardíaco e esquelético apresentados por esses pacientes ainda não estão esclarecidos, o presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos in vitro do 3HTA e 3HPA sobre importantes parâmetros da bioenergética mitocondrial, tais como os parâmetros respiratórios estado 3, estado 4, razão de controle respiratório (RCR) e estado desacoplado, bem como o potencial de membrana (ΔΨm), o inchamento, a liberação de citocromo c, a capacidade de retenção de Ca2+ e o conteúdo do NAD(P)H em mitocôndrias isoladas de músculo cardíaco e esquelético de ratos jovens. Inicialmente, observamos que o 3HTA e 3HPA em baixas concentrações (10-30 UM) aumentaram o estado 4 e diminuíram o RCR em mitocôndrias de músculo esquelético, indicando um efeito desacoplador. Quando em concentrações mais elevadas (50-100 UM), esses ácidos graxos diminuíram o estado 4, o estado 3 e o estado desacoplado da respiração mitocondrial, característicos de inibidores metabólicos. Ainda observamos que o 3HPA foi capaz de produzir efeitos semelhantes sobre a respiração mitocondrial em fibras musculares permeabilizadas, validando os resultados obtidos em mitocôndrias isoladas. Além disso, demonstramos que o 3HPA e o 3HTA (30 UM) diminuíram marcadamente o ΔΨm, o conteúdo de NAD(P)H, a capacidade de retenção de Ca2+ e a produção de ATP, além de induzirem inchamento, em mitocôndrias obtidas de ambos os tecidos e suplementadas com Ca2+. Esses efeitos foram prevenidos por ciclosporina A e ADP, assim como pelo rutênio vermelho, indicando o envolvimento do PTP e do Ca2+, respectivamente. O fato de termos verificado que o 3HPA aumentou marcadamente a fluidez das membranas mitocondriais em músculo esquelético indica que esse mecanismo pode estar envolvido no prejuízo da homeostase mitocondrial causado por esses compostos. Finalmente, verificamos que o análogo dicarboxílico do 3HTA, o ácido 3-hidroxitetradecanodioico, que também se acumula nos pacientes, não alterou os parâmetros avaliados, indicando uma ação seletiva para os ácidos monocarboxílicos. Analisando nossos resultados em conjunto, demonstramos que os principais LCHFA acumulados nas deficiências da LCHAD e MTP prejudicam a homeostase mitocondrial em músculo cardíaco e esquelético. Presumimos que esse mecanismo possa explicar, pelo menos em parte, a cardiomiopatia severa, os sintomas e alterações musculares que acometem os pacientes afetados.Long-chain 3-hydroxy-acyl-CoA dehydrogenase (LCHAD) and mitochondrial trifunctional protein (MTP) deficiencies are inborn errors of fatty acid oxidation. Affected patients present accumulation of long-chain hydroxylated fatty acids (LCHFA), particularly 3-hydroxytetradecanoic (3HTA) and 3-hydroxypalmitic (3HPA) acids, in blood and other tissues. The symptomatology is varied, including severe cardiomyopathy and muscular symptoms such as weakness, muscle pain and recurrent episodes of rhabdomyolysis, as well as hepatopathy, retinopathy, hypotonia, peripheral neuropathy, speech and development delay, leading to premature death. Considering that the pathogenesis of cardiac and skeletal muscle damage presented by the patients are still not established, the aim of the present work was to investigate the in vitro effects of 3HTA and 3HPA on important parameters of mitochondrial bioenergetics, namely the respiratory parameters state 3, state 4, respiratory control ratio (RCR) and uncoupled respiration, as well as mitochondrial membrane potential (ΔΨm), swelling, Ca2+ retention capacity and NAD(P)H redox state in cardiac and skeletal muscle mitochondria isolated from young rats. Initially, we observed that 3HTA and 3HPA at lower concentrations (10-30 UM) increased state 4 and decreased RCR in skeletal muscle mitochondria, indicating an uncoupling effect. At higher concentrations (50-100 UM), these fatty acids decreased state 4, state 3 and uncoupled respiration, suggesting metabolic inhibition. Furthermore, we observed that 3HPA was capable to provoke similar effects on mitochondrial respiration in permeabilized skeletal muscle fibers, validating the results obtained in isolated mitochondria. We also demonstrated that 3HPA and 3HTA (30 UM) strongly decreased the ΔΨm, NAD(P)H content, Ca2+ retention capacity and ATP production, besides inducing swelling, in mitochondria obtained from both tissues and supplemented with Ca2+. These effects were prevented by cyclosporin A and ADP, as well as by ruthenium red, indicating the involvement of mitochondrial permeability transition and Ca2+, respectively. The fact that 3HPA strongly increased the mitochondrial membrane fluidity in skeletal muscle indicates that this mechanism may be involved in the mitochondrial bioenergetics impairment caused by these compounds. Finally we verified that the 3HTA dicarboxylic analogue, 3-hydroxytetradecanodioic acid, which also accumulates in the affected patients, did not alter the tested parameters, indicating a selective action of the monocarboxylic acids. Taken together, we demonstrated that the major LCHFA accumulated in LCHAD and MTP deficiencies impair mitochondrial homeostasis in cardiac and skeletal muscle. We presume that these mechanisms may explain, at least in part, the severe cardiomyopathy, symptomatology and muscle alterations characteristics of the patients affected by these disorders
Experimental evidence that in vivo intracerebral administration of L-2-hydroxyglutaric acid to neonatal rats provokes disruption of redox status and histopathological abnormalities in the brain
Full text linkTissue accumulation of L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG) is the biochemical hallmark of L- 2-hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA), a rare neurometabolic inherited disease characterized by neurological symptoms and brain white matter abnormalities whose pathogenesis is not yet well established. L-2-HG was intracerebrarly administered to rat pups at postnatal day 1 (P1) to induce a rise of L-2-HG levels in the central nervous system (CNS). Thereafter, we investigated whether L-2- HG in vivo administration could disturb redox homeostasis and induce brain histopathological alterations in cerebral cortex and striatum of neonatal rats. L-2-HG markedly induced the generation of reactive oxygen species (increase of 2′,7′-dichloroflurescein-DCFH- oxidation), lipid peroxidation (increase of malondialdehyde concentrations) and protein oxidation (increase of carbonyl formation and decrease of sulfhydryl content), besides decreasing the antioxidant defenses (reduced glutathione - GSH) and sulfhydryl content in cerebral cortex. Alterations of the activities of various antioxidant enzymes were also observed in cerebral cortex and striatum following L-2-HG administration. Furthermore, L-2-HG-induced lipid peroxidation and GSH decrease in cerebral cortex were prevented by the antioxidant melatonin and by the classical antagonist of NMDA glutamate receptor MK-801, suggesting the involvement of reactive species and of overstimulation of NMDA receptor in these effects. Finally, L-2-HG provoked vacuolation and edema particularly in the cerebral cortex with less intense alterations in the striatum that were possibly associated with the unbalanced redox homeostasis caused by this metabolite. Taken together, it is presumed that these pathomechanisms may underlie the neurological symptoms and brain abnormalities observed in the affected patients
Efeitos dos principais ácidos graxos acumulados na deficiência da desidrogenase de acilas-CoA de cadeia muito longa sobre importantes funções mitocondriais em coração, fígado e músculo esquelético
Full text linkAs doenças de oxidação mitocondrial de ácidos graxos são patologias genéticas reconhecidas como importantes causas de morbidade e mortalidade na população infanto-juvenil. Uma das mais comuns é a deficiência da desidrogenase de acilas- CoA de cadeia muito longa (VLCAD). Essa doença é caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa e de seus conjugados de carnitina nos tecidos e líquidos biológicos dos pacientes afetados e, clinicamente, por disfunção cardíaca, hepática e muscular. Os ácidos cis-5-tetradecenoico (Cis-5) e mirístico (Myr) são os que mais se acumulam nessa doença, sendo que o primeiro é o marcador bioquímico. As disfunções cardíaca e hepática, que podem levar os pacientes à morte, bem como os recorrentes episódios de rabdomiólise ainda não possuem sua fisiopatologia esclarecida. A presente investigação objetivou estudar os efeitos desses metabólitos acumulados sobre parâmetros importantes da função mitocondrial (parâmetros respiratórios, potencial de membrana (ΔΨm), conteúdo de NAD(P)H, inchamento mitocondrial, capacidade de retenção de Ca2+, liberação de citocromo c, produção de ATP, atividades dos complexos da cadeia respiratória e enzimas do ciclo do ácido cítrico) em mitocôndrias isoladas de coração, fígado e músculo esquelético de ratos jovens, bem como em fibras permeabilizadas de coração e de músculo esquelético e células hepáticas e cardíacas cultivadas. Verificamos que o Cis-5 e o Myr, em concentrações patológicas, reduziram significativamente os estados 3 e desacoplado da respiração celular, a produção de ATP, o ΔΨm e a capacidade de retenção de Ca2+ nos três tecidos testados, bem como o conteúdo de NAD(P)H na matriz mitocondrial no coração, e a atividade do complexo I no coração, do complexo I-III no fígado e músculo esquelético e da enzima α-cetoglutarato desidrogenase no fígado. Estes ácidos graxos também aumentaram o estado 4 da respiração celular (efeito desacoplador) em todos os tecidos testados, com o envolvimento do translocador de nucleotídeos de adenina em coração e fígado, pois o carboxiatractilosídeo atenuou significantemente o aumento do estado 4 provocado pelos Cis-5 e Myr. Além disso, o Cis-5 e o Myr induziram inchamento mitocondrial e a liberação de citocromo c no fígado. Observamos ainda que os inibidores clássicos da formação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPT) ciclosporina A mais ADP, bem como o inibidor da captação de Ca2+ rutênio vermelho preveniram completamente a diminuição do ΔΨm mitocondrial em todos os tecidos testados, bem como a indução do inchamento mitocondrial em fígado, provocados pelo Myr e Cis-5 na presença de Ca2+, sugerindo, respectivamente, que a indução da abertura do poro de MTP e a contribuição do Ca2+ estão envolvidas nesses efeitos. Os efeitos observados na respiração celular obtidos em mitocôndrias isoladas se confirmaram em preparações in situ de células cultivadas (cardiomiócitos e hepatócitos) e em fibras musculares cardíacas e esqueléticas, reforçando os efeitos deletérios desses ácidos graxos. Não foram observadas alterações na homeostase redox avaliados através do conteúdo de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico e glutationa reduzida em coração. Os achados no presente trabalho indicam que, em concentrações patológicas, os ácidos graxos de cadeia longa que mais se acumulam na deficiência da VLCAD prejudicam a bioenergética mitocondrial e a homeostase do Ca2+, atuando como desacopladores e inibidores metabólicos da fosforilação oxidativa, além de serem indutores da abertura do poro de MPT em coração, fígado e músculo esquelético. Assim, presumimos que o comprometimento na bioenergética e na homeostase do Ca2+ possam contribuir para as manifestações cardíacas, hepáticas e musculares observadas na deficiência da VLCAD.The genetic fatty acid oxidation disorders are genetic pathologies recognized as important causes of morbidity and mortality in child-juvenile population. One of the most common is very-long-chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) deficiency. This disease is biochemically characterized by accumulation of fatty acids and their correspondent carnitine derivatives in tissues and biological fluids from affected patients, and clinically by cardiac, hepatic and muscular dysfunction. Cis-5- tetradecenoic (Cis-5) and myristic (Myr) acids are those that most accumulate in this disorder, wherein the first one is the biochemical hallmark. The cardiac and hepatic dysfunction, which may lead the patients to death, as well as the recurrent rhabdomyolysis episodes have the pathogenesis still poorly unknown. The present investigation was aimed to study the effects of these accumulated metabolites on important mitochondrial function parameters (respiratory parameters, membrane potential (ΔΨm), NAD(P)H content, mitochondrial swelling, Ca2+ retention capacity, cytochrome c release, ATP production, respiratory chain complexes and citric acid cycle enzymes activities) in isolated mitochondria of heart, liver and skeletal muscle from young rats, as well as in permeabilized heart and skeletal muscle fibers and hepatic and cardiac cultivated cells. We verified that Cis-5 and Myr, at pathological concentrations, strongly reduced states 3 and uncoupled of respiration, ATP production, ΔΨm and Ca2+ retention capacity in all tested tissues, as well as matrix mitochondrial NAD(P)H content in heart, complex I activity in heart, complex I-III in liver and skeletal muscle and α-ketoglutarate dehydrogenase activity in liver. Also, these fatty acids increased state 4 respiration (uncoupling effect) in all tested tissues, with the involvement of the adenine nucleotide translocator in heart and liver since carboxyatractyloside significantly attenuated the increased state 4 respiration provoked by Cis-5 and Myr. In addition, Cis-5 and Myr caused mitochondrial swelling and cytochrome c release in liver. We also observed that the classical inhibitors of mitochondrial permeability transition (MPT) pore cyclosporin A plus ADP, as well as the Ca2+ uptake blocker ruthenium red, fully prevented the decrease of ΔΨm in all tested tissues as well as mitochondrial swelling induction in liver provoked by Myr and Cis-5 in Ca2+-loaded mitochondria, suggesting, respectively, induction of MPT pore opening and the contribution of Ca2+ in these effects. The effects observed in cellular respiration obtained in isolated mitochondria were confirmed in in situ cell preparations (cardiomyocytes and hepatocytes), as well as in cardiac and skeletal muscle fibers, reinforcing the deleterious effects of the fatty acids. In contrast, there were no alterations of redox homeostasis evaluated by the content of thiobarbituric acid reative species and reduced glutathione in heart. The present findings indicate that the major long-chain fatty acids that accumulate in VLCAD deficiency disrupt mitochondrial bioenergetics and Ca2+ homeostasis, acting as uncouplers and metabolic inhibitors of oxidative phosphorylation, as well as inducers of MPT pore opening in the heart, liver and skeletal muscle at pathological relevant concentrations. It is therefore presumed that disturbance of bioenergetics and Ca2+ homeostasis may contribute to the cardiac, hepatic and muscular manifestations observed in VLCAD deficiency
Efeitos da administração intracerebral dos principais metabólitos acumulados nas acidúrias D-2-hidroxiglutárica e L-2-hidroxiglutárica sobre a homeostase redox e histopatologia no estriado e cerebelo de ratos jovens
Full text linkAs acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são doenças neurometabólicas hereditárias causadas pelas deficiências das atividades da D-2-hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGA do tipo I) ou isocitrato desidrogenase 2 (D-2-HGA do tipo II) e L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGA). Os pacientes afetados por essas doenças desenvolvem principalmente sintomas e sinais neurológicos como convulsões, coma e atrofia cerebral. As lesões cerebrais ocorrem majoritariamente nos gânglios da base (D-2-HGA e L-2-HGA) e no cerebelo (L-2-HGA). Bioquimicamente, a D-2-HGA e a L-2-HGA são caracterizadas pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidroxiglutárico (D-2-HG) e L-2-hidróxiglutárico (D-2-HG), respectivamente. Tendo em vista que a fisiopatologia da disfunção cerebral encontrada nestes pacientes ainda é pouco conhecida, o presente trabalho investigou os efeitos da administração intracerebral in vivo em ratos jovens dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre parâmetros de estresse oxidativo e sobre a histopatologia das principais estruturas afetadas nos pacientes com D-2-HGA (estriado) ou L-2-HGA (estriado e cerebelo). Inicialmente, avaliamos o efeito dos ácidos D-2-HG e L-2-HG sobre os níveis de malondialdeído (MDA) e sobre a formação de carbonilas em estriado e cerebelo. Verificamos que ambos os ácidos orgânicos aumentaram significativamente os níveis de MDA (dano oxidativo lipídico) no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). Por outro lado, apenas o D-2-HG foi capaz de aumentar a formação de carbonilas (dano oxidativo proteico) no estriado. Além disso, o D-2-HG diminuiu as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e as atividades enzimáticas da glutationa peroxidase (GPx) e da superóxido dismutase (SOD), além de aumentar as concentrações de glutationa oxidada (GSSG) no estriado. Já o L-2-HG foi capaz de diminuir as concentrações de GSH e de gutationa total (tGS), bem como a atividade da GPx e da glutationa redutase (GR). Por fim, o L-2-HG aumentou as concentrações de GSSG no estriado e no cerebelo. Também investigamos o efeito da administração intracerebral in vivo do D-2-HG e do L-2-HG sobre a oxidação de diclorofluorosceína (DCFH), produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e sobre o conteúdo de nitratos e nitritos, com o objetivo de verificar quais as principais espécies reativas envolvidas nos danos induzidos por estes ácidos orgânicos. O D-2-HG aumentou os níveis de nitratos e nitritos, mas não foi capaz de alterar a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, indicando o envolvimento de espécies reativas de nitrogênio (ERN) nesses efeitos. Já o L-2-HG aumentou a oxidação de DCFH e a produção de H2O2, não alterando o conteúdo de nitratos e nitritos. Tais resultados sugerem que o L-2-HG provavelmente induz as alterações observadas através do aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Também demonstramos que os antioxidantes melatonina, creatina, ácido ascórbico mais α-tocoferol (Vit C + E), N-acetilcisteína (NAC), maleato de dizocilpina (MK-801) e Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) foram capazes de prevenir o dano oxidativo lipídico e a diminuição das defesas antioxidantes induzidos pelo D-2-HG e pelo L-2-HG. Melatonina, creatina e a solução de Vit C + E preveniram vários efeitos induzidos pelo L-2-HG, enquanto o MK-801 e o L-NAME foram capazes de prevenir apenas os efeitos induzidos pelo D-2-HG e o NAC não preveniu os efeitos induzidos pelos dois ácidos orgânicos. Observamos ainda que os ácidos 3-metilglutacônico (3-MGT; estruturalmente similar ao D-2-HG) e L-2-hidróxi-3-metilvalérico (L-HMV; estruturalmente similar ao L-2-HG), não foram capazes de alterar esses parâmetros, sugerindo uma ação seletiva para as atividades pro-oxidantes induzidas pelos D-2-HG e L-2-HG. Finalmente, estudos histológicos mostraram que o D-2-HG e L-2-HG são capazes de alterar a morfologia tecidual no estriado (D-2-HG e L-2-HG) e no cerebelo (L-2-HG). O D-2-HG causou vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico no estriado. Já o L-2-HG, além de causar vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico, também induziu necrose, formação de corpos granulares eosinofílicos e astrogliose (aumento da proteína ácida fibrilar glial). Também observamos em ratos injetados com L-2-HG perda da população neuronal (diminuição da imunodetecção da proteína neuronal nuclear específica) no estriado, enquanto que no cerebelo o L-2-HG induziu vacuolização e infiltrado linfocítico e macrofágico. Concluindo, este trabalho foi o primeiro a demonstrar efeitos in vivo do D-2-HG e do L-2-HG (administração intracerebral) sobre parâmetros de estresse oxidativo e alterações histopatológicas em cérebro de ratos jovens. Presumimos que o comprometimento da homeostase redox possa estar associado às alterações histopatológicas observadas, podendo contribuir pelo menos em parte, para a neuropatologia encontrada nos pacientes afetados pela D-2-HGA e pela L-2-HGA.D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-Hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are inherited neurometabolic disorders caused by enzymatic defects in D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGA type I) or isocitrate dehydrogenase 2 (D-2-HGA type II) and L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGA), respectively. Patients affected by these disorders develop severe neurological damage, which leads to seizures, coma and cerebral atrophy. Brain lesions occur mainly in the basal ganglia (D-2-HGA and L-2-HGA) and in cerebellum (L-2-HGA) Biochemically, D-2-HGA and L-2-HGA are characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D-2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. Since the pathophysiology of the tissue damage in these diseases is still poorly unknown, the present study investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG in adolescent rats on important parameters of oxidative stress and on the histopathology of the principal cerebral structures damaged in patients with D-2-HGA (striatum) and L-2-HGA (striatum and cerebellum). Initially, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on malondialdehyde (MDA) levels and carbonyl formation in striatum and cerebellum. We verified that both organic acids significantly elevated MDA levels (lipid oxidative damage) in striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG), whereas only D-2-HG was able to elevate carbonyl formation (protein oxidative damage) in striatum. Furthermore, D-2-HG and L-2-HG significantly diminished reduced glutathione (GSH) concentrations, glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD) activities, besides increasing oxidized glutathione (GSSG) concentrations in striatum. Otherwise, L-2-HG reduced GSH, total glutathione (tGS) concentrations and the activities of GPx and reductase glutathione (GR). Finally, L-2-HG augmented GSSG concentrations in striatum and cerebellum. In the next step of this work, we investigated the effects of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on 2’,7’-diclorofluorescein oxidation (DCFH), hydrogen peroxide production (H2O2) and nitrate and nitrite content in order to elucidate the main reactive species involved in the oxidative damage induced by these organic acids. D-2-HG elevated nitrate and nitrite content, whereas it did not change DCFH oxidation and H2O2 production, suggesting the involvement of reactive nitrogen species (RNS) in these effects. On the other hand, L-2-HG injection increased DCFH oxidation and H2O2 production, but did not change nitrate and nitrite content. These results suggest that L-2-HG-induced alterations occur by an elevated generation of reactive oxygen species (ROS). We also demonstrated that antioxidants such as melatonin, creatine, a mixture of ascorbic acid plus α-tocopherol (Vit C + E), N-acethylcysteine (NAC), dizocilpine maleate (MK-801) and Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) were able to prevent D-2-HG- and L-2-HG-induced lipid oxidative damage and the reduction of the antioxidant defenses induced by D-2-HG and L-2HG. Melatonin, creatine and Vit C + E prevented some of the effects induced by L-2-HG, whereas MK-801 and L-NAME were only able to prevent the D-2-HG-elicited effects and NAC did not prevent D-2-HG and L-2-HG-induced alterations. We also observed that 3-methylglutaconic (3-MGT, structurally similar to D-2-HG) and L-2-hydroxy-3-methylvaleric (L-HMV, structurally similar to L-2-HG) acids were not able to change these parameters, suggesting a selective effect on the pro-oxidant activities induced by D-2-HG- and L-2-HG. Finally, histological studies demonstrated that D-2-HG and L-2-HG were able to cause histopathological alterations in the striatum (D-2-HG and L-2-HG) and cerebellum (L-2-HG). D-2-HG provoked vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration in the striatum. Furthermore, L-2-HG induced vacuolation, lymphocytic and macrophage infiltration, necrosis, granular eosinophilic bodies, astrogliosis (glial fibrillary acidic protein (elevated glial fibrillary acidic protein immunostaining) and neuronal loss (decreased neuron-specific nuclear protein (NeuN) immunostaining) in striatum. On the other hand, L-2-HG provoked only vacuolation and lymphocytic and macrophage infiltration in the cerebellum. To the best of our knowledge this is the first report that demonstrates the influence of in vivo intracerebral administration of D-2-HG and L-2-HG on oxidative stress parameters and histopathological alterations in brain of adolescent rats. We presumed that the disturbance of cell redox homeostasis was probably associated with the histopathological abnormalities observed, that possibly contribute at least in part to the neuropathology of the brain injury of patients affected by D-2-HGA and L-2-HGA
Efeito in vitro do ácido isovalérico e isovalerilglicina sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens
Full text linkA acidemia isovalérica é uma doença hereditária neurometabólica causada pela deficiência da atividade da enzima isovaleril-CoA desidrogenase da rota de degradação da leucina. É caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo nos tecidos e fluidos biológicos dos pacientes afetados principalmente dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA), bem como isovalerilglicina (IVG). Os achados clínicos caracterizam-se fundamentalmente por sintomas neurológicos graves, tais como convulsões, coma e letargia. O presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos in vitro do IVA e IVG sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida, tendo em vista que os mecanismos envolvidos no dano cerebral dessa doença até o momento são pouco conhecidos e que recentemente foi demonstrado que o 3-OHIVA, também acumulado nas acidúrias 3-metilglutacônica e 3-hidroxi-3-metilglutárica, induz peroxidação lipídica em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados demonstraram que o a IVG, mas não o IVA, aumentou significativamente os níveis de TBA-RS e quimiluminiscência, indicando que este metabólito induz lipoperoxidação in vitro. Com a finalidade de investigar se este efeito foi devido à glicina que faz parte da molécula de IVG, testamos o efeito da glicina sobre estes mesmos parâmetros e verificamos que este aminoácido também induziu dano oxidativo lipídico nesta estrutura cerebral de mesma ordem de magnitude que a IVG. Verificamos também que os antioxidantes trolox (vitamina E solúvel), L-NAME, GSH, melatonina, creatina e uma combinação de CAT+SOD nas doses usualmente suplementadas em estudos in vitro não foram capazes de impedir o aumento dos níveis de TBA-RS induzido pela IVG. Já a presença de N-acetilcisteína, precursora de GSH, em concentrações usuais preveniu esta peroxidação lipídica in vitro induzida por IVG, indicando que o IVG provavelmente provoca um decréscimo das concentrações cerebrais de glutationa reduzida (GSH) provavelmente secundário à elevada produção de espécies ativas induzida pelo metabólito. Por outro lado, a adição ao meio de incubação de doses altas desses antioxidantes, com exceção da combinação SOD e CAT, preveniu totalmente o aumento do TBA-RS induzido por IVG, indicando uma alta produção de espécies reativas com conseqüente dano oxidativo lipídico. O próximo passo de nossa investigação foi determinar a influência do IVA e IVG sobre a oxidação do DCFH e dos níveis de glutationa reduzida (GSH). Tanto o IVA, quanto o IVG não alteraram os níveis de DCFH. Por outro lado, o IVA não modificou, enquanto a IVG provocou uma diminuição significativa dos níveis do GSH. Tal efeito não se deveu a uma ação pró-oxidante direta do IVG ou à interferência desse composto na medida dos níveis de GSH. Tais resultados estão de acordo com o fato de que a N-acetilcisteína, substrato para a formação de GSH, foi capaz de prevenir o aumento da lipoperoxidação lipídica induzida pelo IVG.Verificamos também que o IVA e o IVG não afetaram o TRAP e o TAR que representam o potencial antioxidante total e a reatividade antioxidante total, respectivamente. Por outro lado, a IVG não induziu dano oxidativo protéico medido pela oxidação de sulfidrilas e pela formação de carbonilas, enquanto o IVA causou um aumento significativo na formação de carbonilas, sem alterar os níveis de tióis. Concluindo, nossos resultados indicam que a IVG é o metabólito acumulado na acidemia isovalérica que induz em maior grau estresse oxidativo em homogeneizados de córtex cerebral de ratos jovens, enquanto o IVA é capaz de provocar dano oxidativo protéico. Um aumento do estado pró-oxidante e uma menor capacidade antioxidante, representada pelo decréscimo do GSH cerebral, indica que o estresse oxidativo possa representar um mecanismo na fisiopatologia do dano neurológico característico da acidemia isovalérica.Isovaleric acidemia is an inherited neurometabolic disorder caused by isovaleryl-CoA dehydrogenase deficiency. It is biochemically characterized by accumulation of isovaleric acid (IVA) and 3-hydroxyisovaleric acid (3-OHIVA), as well as isovalerylglycine (IVG) in tissues and biological fluids of affected patients. Clinical features are mainly severe neurological symptoms, such as convulsions, coma, lethargy and ataxia. The present work aimed to investigate the in vitro effects of IVA and IVG on various parameters of oxidative stress in cerebral cortex of 30-day-old rats since the mechanisms of brain damage are poorly known in this disease and that recently it was demonstrated that 3-OHIVA, also accumulating in 3-methylglutaconic aciduria and 3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria, induces lipid peroxidation in cerebral cortex of young rats. Our results showed that IVG, but not IVA, significantly increased TBA-RS and quimiluminescence, indicating that this metabolite induces lipid peroxidation in vitro. Aiming to evaluate whether this effect was due to glycine that is a component of IVG molecule, we tested the effect of glycine on the same parameters and verified that this amino acid also induced lipid oxidative damage of the same order of magnitude than IVG. We also observed that the antioxidants trolox (soluble vitamin E), L-NAME, GSH. Melatonine, creatine and the combination CAT + SOD at doses usually supplememented in vitro studies were not able to prevent the increase of TBA-RS levels induced by IVG. In contrast, the presence of N-acethylcisteine, precursor of GSH, at usual concentrations, totally prevented IVG-induced increase of TBA-RS levels, indicating that IVG probably provoked a decrease of brain GSH concentrations probably secondary to elevated formation of free radicals by this metabolite. On the other hand, the presence of higher amounts of these antioxidants, except the combination SOD + CAT, totally prevented the increase of TBA-RS elicited by IVG, indicating that a high production of reactive species with consequent lipid oxidative damage. The next step of our investigation was to determine the influence of IVA and IVG on DCFH-DA oxidation and on GSH levels. Both IVA and IVG did not alter DCFH-DA levels, whereas IVG caused a significant decrease of GSH levels. This effect was not due to a direct pro-oxidant action of IVG or due to IVG interference in the reaction used to measure GSH. Such effects are in line with those showing that N-acethylcystein, the substrate of GSH formation, was able to prevent the increase of lipid peroxidation elicited by IVG. We also found that IVA and IVG did not affect TRAP and TAR that represent total tissue antioxidant potential and total antioxidant reactivity, respectively. On the other hand, IVG did not provoke protein oxidative damage measured by sulfhydryl oxidation and carbonyl formation, whereas IVA causes a significant increase of carbonyl formation, without altering thiol concentration. Concluding, our findings indicate that IVG is the accumulating metabolite in isovaleric acidemia that induces in higher degree oxidative stress in cortical homogenates from young rats, while IVA is able to provoke protein oxidative damage. An increase of pro-oxidant status and a lower antioxidant capacity, represented by a decrease of cerebral GSH, indicate that oxidative stress may represent a mechanism in the pathophysiology of the brain damage characteristic of isovaleric acidemia
Alterações neuroquímicas e neurocomportamentais causadas pela administração in vivo do ácido L-2-hidroxiglutárico em ratos neonatos e disfunção energética provocada pelo ácido D-2-hidroxiglutárico in vitro em coração de ratos adolescentes
Full text linkAs acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são distúrbios neurometabólicos caracterizados bioquimicamente pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidróxiglutárico (D-2-HG) e L-2- hidroxiglutárico (L-2-HG), respectivamente. A D-2HGA tipo 1 (D-2-HGA1) é causada por mutações patogênicas no gene que codifica a enzima mitocondrial D-2- hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGDH), enquanto mutações de ganho de função da enzima isocitrato desidrogenase 2 (IDH2) são a causa da D-2HGA2. As manifestações clínicas da D-2HGA1 e D-2-HGA2 são predominantemente neurológicas tais como convulsões, hipotonia e atraso no desenvolvimento psicomotor, devido a isso são consideradas acidemias orgânicas cerebrais. No entanto, a D-2HGA2 é mais severa, manifestando-se no período neonatal com alto risco de vida causada pela cardiomiopatia que acomete metade dos pacientes, ocorrendo concomitante a graves manifestações neurológicas, enquanto a D-2HGA1 corresponde a uma variante mais branda da doença com sinais exclusivamente neurológicos. Por outro lado, a acidúria L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) tem como causa mutações patogênicas no gene que codifica a enzima mitocondrial FAD-dependente L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGDH). Os pacientes afetados pela L-2-HGA apresentam um fenótipo clínico mais brando, homogêneo e progressivo, apresentando exclusivamente sinais neurológicos, como atraso no desenvolvimento motor e cognitivo, epilepsia, ataxia cerebelar, macrocefalia e sintomas extrapiramidais, tais como tremor e distonia, sendo também considerada uma acidúria orgânica cerebral. A neuropatologia da D-2HGA é caracterizada por atraso na maturação cerebral e anormalidades na substância branca cerebral, com alargamento dos ventrículos laterais e alterações anatômicas nos gânglios da base, enquanto a L-2HGA apresenta alterações na substância branca (leucodistrofia) e anormalidades no córtex cerebral, nos núcleos da base (núcleo denteado, globo pálido, putamen e no núcleo caudado) e no cerebelo. Tendo em vista que a patogênese do dano cerebral nos pacientes afetados por essas doenças ainda é pouco conhecida, bem como da cardiomiopatia da D- 2HGA2, a presente investigação teve por objetivo inicial avaliar os efeitos ex vivo da administração intracerebroventricular (icv) do L-2HG a ratos neonatos sobre a homeostase redox no cerebelo, bem como parâmetros imunohistoquimicos de viabilidade neuronal, reatividade astrocitária, ativação microglial e mielinização no córtex cerebral e estriado dos animais. Também foram avaliados os efeitos da administração icv de L-2- HG sobre o desenvolvimento neurocomportamental, motor e cognitivo. Em alguns experimentos, os animais foram pré-tratados intraperitonealmente com o antioxidante melatonina uma hora antes da administração icv de L-2HG. Por fim, avaliamos os efeitos in vitro do D-2-HG sobre a homeostase energética em coração de ratos adolescentes e em culturas de cardiomioblastos (H9c2). Inicialmente, avaliamos os efeitos do L-2-HG 6 horas após a administração icv sobre os parâmetros de homeostase redox no cerebelo. Os resultados mostraram que a administração de L-2-HG aumentou a oxidação da 2’,7’ - diclorofluoresceína (DCFH), refletindo uma maior produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), acompanhada de uma maior lipoperoxidação, determinada pelo aumento significativo nos níveis de malondialdeído (MDA). A injeção icv do metabólito provocou alterações do sistema antioxidante cerebelar, diminuindo as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e aumentando as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD), indicando um provável mecanismo compensatório com aumento da transcrição gênica dessas enzimas secundário a elevação das espécies reativas no cerebelo dos animais neonatos. Demonstramos também que o pré-tratamento com melatonina preveniu totalmente o aumento na produção de EROs, a lipoperoxidação e a diminuição do GSH, sem alterar as atividades das enzimas antioxidantes. Na sequência, observamos nos dias pós-natais (DPN) 15 e 75, que a administração neonatal do metabólito aumentou significativamente o conteúdo da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e da proteína ligante de cálcio S100B, indicando aumento da reatividade astrocitária, bem como induziu a diminuição do número de células NeuN-positivas (perda neuronal), aumentou o conteúdo de Iba1 (ativação microglial) e redução das proteínas de mielina MBP e CNPase (distúrbio na mielinização) no córtex cerebral e no estriado. Além disso, a melatonina preveniu esses efeitos, sugerindo que o estresse oxidativo pode estar relacionado a esses efeitos deletérios do L-2-HG. Por fim, observou-se que uma única injeção icv de L-2-HG no período neonatal causou atraso no neurodesenvolvimento de ratos jovens e déficit cognitivo e motor nestes animais em idade adulta. Mais uma vez, a melatonina preveniu o comprometimento do desenvolvimento neuromotor e o déficit cognitivo provocado pelo L-2-HG. Em conjunto, nossos dados fornecem pela primeira vez evidências de vários mecanismos patológicos de dano cerebral causados pelo principal metabólito acumulado na L-2-HGA administrado a ratos neonatos e, mais importante, que a melatonina foi capaz de prevenir a maioria das alterações neuroquímicas, histológicas e comportamentais provocadas por este metabólito, indicando que o estresse oxidativo pode ser central na patogênese da L-2- HGA. Nesse particular, o uso de antioxidantes poderia representar uma nova estratégia terapêutica para a doença. O presente trabalho também investigou a toxicidade do D-2-HG sobre o coração, estudando seus efeitos in vitro sobre um amplo espectro de parâmetros do metabolismo energético em coração de ratos jovens e em cardiomioblastos cultivados (H9c2). O D-2- HG inibiu a respiração celular em preparações mitocondriais purificadas e homogeneizados brutos de coração de ratos jovens, bem como em células H9c2. A produção de ATP e as atividades das enzimas citocromo c oxidase (complexo IV), alfacetoglutarato desidrogenase, citrato sintase e creatina quinase também foram inibidas pelo D-2-HG, enquanto as atividades dos complexos I, II e II-III da cadeia respiratória, glutamato, succinato e malato desidrogenases não foram alterados. Também verificamos que este ácido orgânico comprometeu a capacidade de retenção de Ca²+ mitocondrial em preparações mitocondriais de coração. Finalmente, o D-2-HG reduziu a viabilidade dos cardiomioblastos H9c2 cultivados, como determinado por uma diminuição do MTT e aumento da incorporação de iodeto de propídio. Enfatize-se que o L-2-HG não alterou alguns desses parâmetros (atividades do complexo IV e da creatina quinase) em preparações mitocondriais do coração, indicando um efeito inibitório seletivo do enantiômero D. Em conclusão, presume-se que o D-2-HG compromete a bioenergética mitocondrial e a capacidade de retenção de Ca²+, o que pode contribuir potencialmente para a cardiomiopatia comumente observada na D2HGA2. Assim, drogas estimuladoras da respiração celular, tais como o bezafibrato, e a triheptanoína que é uma droga anaplerótica poderiam beneficiar os pacientes com essa doença.D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are neurometabolic disorders biochemically characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D -2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. D-2HGA type 1 (D-2-HGA1) is caused by pathogenic mutations in the gene encoding the mitochondrial enzyme D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGDH), while mutations with gain of function of the enzyme isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) causes D-2HGA2. The clinical manifestations of D- 2HGA1 and D-2-HGA2 are predominantly neurological, including seizures, hypotonia and delayed psychomotor development, hence they are considered cerebral organic acidurias. However, D-2HGA2 is more severe, manifesting in the neonatal period with high risk of life caused by the cardiomyopathy that affects one third of patients, occurring concomitantly with severe neurological manifestations, while D-2HGA1 corresponds to a milder variant of the disease with exclusively neurological signs. On the other hand, L- 2-hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) is caused by pathogenic mutations in the gene encoding the mitochondrial FAD-dependent enzyme L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGDH). Patients affected by L-2-HGA have a milder, homogeneous and progressive clinical phenotype, presenting exclusively neurological signs, such as delayed motor and cognitive development, epilepsy, cerebellar ataxia, macrocephaly and extrapyramidal symptoms, such as tremor and dystonia, being also considered a cerebral organic aciduria. The neuropathology of D-2HGA is characterized by delayed brain maturation and abnormalities in the cerebral white matter, with enlargement of the lateral ventricles and anatomical changes in the basal ganglia, while L-2HGA has white matter changes (leukodystrophy) and abnormalities in the cerebral cortex, the basal ganglia (dentate nucleus, globus pallidus, putamen, and caudate nucleus), and the cerebellum. Considering that the pathogenesis of brain damage in patients affected by these diseases is still poorly understood, as well as of D-2HGA2 cardiomyopathy, the present investigation initially aimed to evaluate the ex vivo effects of intracerebroventricular (icv) administration of L-2HG to neonatal rats on redox homeostasis in the cerebellum, as well as immunohistochemical parameters of neuronal viability, astrocyte reactivity, microglial activation, and myelination in the cerebral cortex and striatum of the animals. The effects of icv administration of L-2-HG on neurobehavioral, motor and cognitive development were also evaluated. In some experiments, animals were intraperitoneally pretreated with the antioxidant melatonin one hour before icv administration of L-2HG. Finally, we evaluated the in vitro effects of D-2-HG on energy homeostasis in adolescent rat hearts and in cardiomyoblast (H9c2) cultures. Initially, we evaluated the effects of L-2-HG 6 hours after icv administration on redox homeostasis parameters in the cerebellum. The results showed that L-2-HG administration increased the oxidation of 2',7' - dichlorofluorescein (DCFH), reflecting an increased production of reactive oxygen species (ROS), accompanied by an increased lipoperoxidation, determined by a significant increase in malondialdehyde (MDA) levels. The icv injection of the metabolite also altered the brain antioxidant system, decreasing the concentrations of reduced glutathione (GSH) and increasing the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD), indicating a likely compensatory mechanism with increased gene transcription of these enzymes secondary to the elevation of reactive species in the cerebellum of neonatal animals. We also demonstrated that pretreatment with melatonin totally prevented the increase in ROS production, lipid peroxidation and decrease in GSH, without altering the activities of the antioxidant enzymes. Subsequently, we observed at postnatal days (PND) 15 and 75, that neonatal administration of the metabolite significantly increased the content of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and calcium-binding protein S100B, indicating increased astrocyte reactivity, as well as induced a decrease in the number of NeuN-positive cells (neuronal loss), increased Iba1 content (microglial activation) and reduced myelin proteins MBP and CNPase (disturbance in myelination) in the cerebral cortex and striatum. Furthermore, melatonin prevented these effects, suggesting that oxidative stress may be involved in these deleterious effects. Finally, it was observed that a single icv injection of L-2-HG in the neonatal period caused delayed neurodevelopment in young rats and cognitive and motor deficits in these animals at adulthood. Once again, melatonin prevented the impairment of neuromotor development and cognitive deficit caused by L- 2-HG. Taken together, our data provide for the first time evidence for several pathological mechanisms of brain damage caused by the major metabolite accumulated in L-2-HGA administered to neonatal rats and, more importantly, that melatonin was able to prevent most of the neurochemical, histological and behavioral changes caused by this metabolite, indicating that oxidative stress may be central to the pathogenesis of L-2-HGA. We propose that antioxidants may serve in the future as adjunctive therapy for patients with L-2-HGA. The present work also investigated the toxicity of D-2-HG on the heart, studying its in vitro effects on a wide spectrum of energy metabolism parameters in young rat hearts and in cultured cardiomyocytes (H9c2). D-2-HG inhibited cellular respiration in purified mitochondrial preparations and crude homogenates from young rat hearts, as well as in H9c2 cells. ATP production and the activities of cytochrome c oxidase (complex IV) of the respiratory chain, as well as of alpha-ketoglutarate dehydrogenase, citrate synthase and creatine kinase were also inhibited by D-2-HG, while the activities of complexes I, II and II- II, glutamate, succinate and malate dehydrogenases were not altered. We also verified that this organic acid compromised the mitochondrial Ca²+ retention capacity in mitochondrial preparations from the heart and in H9c2 myoblasts. Finally, D-2-HG reduced the viability of cultured H9c2 cells, as determined by a decrease in MTT and by an increase in propidium iodide incorporation. It should be emphasized that L-2-HG did not change some of these parameters (complex IV and creatine kinase activities) in heart mitochondrial preparations, indicating a selective inhibitory effect of the D-enantiomer. In conclusion, it is assumed that D-2-HG compromises mitochondrial bioenergetics and Ca²+ retention capacity, which could potentially contribute to the cardiomyopathy commonly seen in D2HGA2. Thus, drugs that stimulate cellular respiration, such as bezafibrate, and triheptanoin, which is an anaplerotic drug, could benefit patients with this disease
Avaliação dos efeitos in vitro do ácido hexacosanóico sobre parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens
Full text linkA adrenoleucodistrofia ligada ao X (ALD-X) é uma doença peroxissomal na qual ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) acumulam-se nos tecidos dos pacientes, sendo o ácido hexacosanóico (HXCO) o principal ácido graxo acumulado. A doença é caracterizada principalmente por disfunção neurológica e possui variados fenótipos. Considerando que os mecanismos da fisiopatologia da doença são pouco conhecidos, o presente estudo investigou os efeitos in vitro do ácido hexacosanóico sobre diversos parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Nossos resultados mostraram que o HXCO não induz lipoperoxidação, já que os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) não sofreram modificação, assim como não provoca dano oxidativo proteico, pois a formação de carbonilas não foi alterada. Além disso, os níveis de DCF e e a produção de óxido nítrico (NO) não se alteraram, sugerindo que a geração de espécies reativas não está envolvida nesse processo. O ácido hexacosanóico também não alterou os níveis de glutationa (GSH) e o estado antioxidante total (TAS), o que demonstra que o ácido não interfere nas defesas antioxidantes do cérebro. Os resultados presentes indicam que o ácido hexacosanóico no meio de incubação (in vitro) não induz estresse oxidativo em córtex cerebral de ratos jovens. Logo, pode-se dizer que este mecanismo patológico provavelmente não está envolvido nos danos neurológicos encontrados em pacientes afetados pela ALD-X
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