194 research outputs found
Phenotypic and Functional Impacts of Genetic Modification on Natural Killer Cells to Express A Chimeric Antigen Receptor (CAR) or High Affinity CD16 Receptor with Specificity to the Tumor-associated Antigen ErbB2
No full textAccording to the National Institute of Health in 2018, new cases of cancer exceeded 18 million with 9.6 million deaths caused by cancer worldwide. It is well known that cancer is a leading cause of death worldwide, yet conventional medical treatments such as chemotherapy are unable to fully treat the disease which has encouraged the development of new therapies. Initially, cell therapies involving T cells were explored and paved the way for further enhancements in genetic modification that could be key to closing the current gap in treatment; however, different forms of genetic modification can impact a treatment in a multitude of ways. This is what inspired the evaluation of the NK-92 cell line efficiency, expandability, and safety amongst genetically modified variants expressing a CAR or high affinity CD16 receptor with endogenous IL-2 production. In this study, I have characterized features of a second generation ErbB2-specific CAR-engineered NK-92 with NK-92 expressing a recombinant Fc receptor to the parental NK-92 cell line with respect to cell surface receptor expression using flow cytometry, growth characteristics, cytotoxicity against ErbB2/HER2 positive and negative breast cancer cell lines, cytokine release, and outgrowth profiles post-irradiation. Cell surface receptors were comparable with a few exceptions. CD2, CD11a, CD52, CD54, CD56, and CD337 (NKp30) expression was maintained amongst all cell lines while CD3 and CD158a expression remained negative. FcγRIII/IL-2 NK-92 gained expression of CD314 (NKG2D) when compared to the other NK-92 cell lines, making it preactivated for target cells expressing ligands of NKG2D. Although WT NK-92 expressed CD336 (NKp44), expression of this receptor was not present on NK-92/5.28.z and FcγRIII/IL-2 NK-92 cell lines. Expansion of all NK-92 cell lines was comparable: WT NK-92 and NK-92/5.28.z were able to expand up to 1.0 x 106 cells/mL while FcγRIII/IL-2 NK-92 was able to expand up to 1.2 x 106 cells/mL. All expansion halted after two to three days with the addition of radiation, especially a dose 7.5 Gy or more. NK-92/5.28.z and FcγRIII/IL-2 NK-92 cell lines were able to lyse almost 100% of ErbB2(+) target cells without irradiation. However, even with the addition of 10 Gy irradiation, NK-92/5.28.z cells were able to maintain 100% lysis of target cells while FcγRIII/IL-2 NK-92 cells dropped down to 75% lysis. Cytokine profiles were similar for NK-92 WT and FcγRIII/IL-2 NK-92 in the presence of ErbB2(+) target cells: both NK-92 cell lines secreted more granzyme B than IFN-γ whereas NK-92/5.28.z secreted more IFN-γ in the presence of ErbB2(+) target cells than granzyme B. The addition of radiation did not affect the trend in cytokine profiles for any NK-92 cell lines. The data found in the experiments included in this study can be used for selecting which NK-92 variant should enter clinical trials as well as for screening other NK-92 variants for similar purposes. The goal of this study was to address some of the issues revolving around NK cell use in cellular therapy by characterizing and comparing a preclinical NK-92 cell expressing high affinity Fc-γ receptor combined with intracellular IL-2 against an NK-92 cell modified to express a second-generation CAR consisting of an intracellular CD3 ζ domain and CD28 costimulatory molecule. The efficiency of each NK-92 cell line seen in the various experiments can be compared to other cell therapies in order to further determine whether another treatment is optimal or if combinatorial treatments are an option.:Abstract IV
List of Figures VII
List of Tables VIII
Abbreviations IX
Symbols and Units XII
1. Introduction 1
1.1 The Natural Killer Cell 2
1.1.1 Maturation 2
1.1.2 Cells of the Adaptive Immune System 4
1.1.3 Function 6
1.1.4 NK Cell Activation Receptors 6
1.1.5 NK Cell Inhibition Receptors 7
1.1.6 Targeted Natural Cytotoxicity 8
1.1.7 Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity 9
1.1.8 Death-receptor-mediated Apoptosis 10
1.1.9 IFN-γ 11
1.1.10 Intracellular Signaling Cascades in ADCC-mediated VS Natural Cytotoxicity 12
1.2 Establishment of a Natural Killer Cell Line 14
1.2.1 NK-92 Cells 15
1.2.2 NK-92/5.28.z 15
1.2.3 FcγRIII/IL-2-expressing Preclinical Clone 18
1.3 Therapeutic Monoclonal Antibodies (mAbs) 18
1.4 The Tumor Cell 19
1.5 Objectives/Motivation 19
2. Materials and Methods 21
2.1 Cell Lines and Culture Conditions 22
2.2 Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) 22
2.2.1 Acquisition of Fluorescence-labeled Cells 22
2.2.2 Verification of ErbB2 Expression on Breast Cancer Cell Line 22
2.2.3 Analysis of Expression of the ErbB2 Chimeric scFv Receptor on NK-92/5.28.z Cells 23
2.2.4 Phenotypic Characterization of NK-92 cells 23
2.3 Growth Characteristics 26
2.4 Dye Exclusion for Cell Viability Determination 26
2.5 Radiation of NK-92 cells 26
2.6 Statistical Analysis 26
2.7 Potency Assay 27
2.8 Cytokine Profile in Steady State and Post-activation 28
2.9 Impact of γ-radiation on Cell Growth Kinetics 29
2.10 Impact of Radiation on Potency 29
2.11 Impact of Radiation on Cytokine Profile 29
2.12 Impact of Radiation on Outgrowth of NK-92 30
3. Results 31
3.1 Transgene Expression (Fc Receptor and CAR) on NK-92 32
3.1.1 ErbB2-CAR Expression 32
3.1.2 Fc Receptor Expression 33
3.1.3 Cell Surface Receptor Expression on NK-92 Variants 34
3.2 Impact on Growth Characteristics 35
3.3 Functional Cytotoxicity Against ErbB2-positive and Negative Cell Lines 37
3.4 Cytokine Profile in Steady State and Post-activation 38
3.5 Impact of γ-radiation on Cell Growth Kinetics 41
3.6 Impact of Radiation on Potency 43
3.7 Cytokine Profile Post-radiation 44
3.8 Impact of Radiation on Outgrowth 47
4. Discussion 49
5. Summary 62
5.1 Summary 63
5.2 Zusammenfassung 65
6. Appendix 67
6.1 Declaration of Compliance with Legal Requirements 68
6.2 Supplementary Data 69
References 76
Acknowledgements 87
Publications 88
Declaration of Authorship 89Laut dem National Institute of Health überstiegen im Jahr 2018 neue Krebsfälle 18 Millionen mit 9,6 Millionen krebsbedingten Todesfällen weltweit. Es ist bekannt, dass Krebs weltweit eine der häufigsten Todesursachen ist, jedoch können konventionelle medizinische Behandlungen, wie eine Chemotherapie, nicht vollständig behandeln, was die Entwicklung neuer Therapien gefördert hat. Zunächst wurden Zelltherapien mit T-Zellen erprobt, welche den Weg für weitere genetische Verbesserungen geebnet haben, die in der Lage sein könnten die derzeitige Behandlungslücke zu schließen. Verschiedene Formen einer genetischen Veränderung können eine Behandlung auf vielfältige Weise beeinflussen. Dies war der Grund für die Bewertung der Effizienz, Erweiterbarkeit und Sicherheit der NK-92-Zelllinie und ihrer genetisch veränderten Varianten, die jeweils einen chimären Antigenrezeptor (CAR) oder einen hochaffinen CD16-Rezeptor zusammen mit einem endogen exprimierten IL-2 exprimieren. In dieser Arbeit habe ich Eigenschaften einer mit einem ErbB2- spezifischen CAR der 2. Generation ausgestatteten NK-92 Zelllinie mit einer NK-92 Zelllinie mit rekombinanter Fc Rezeptor Expression und mit parentalen NK-92 Zellen in Bezug auf die Oberfächenrezeptorexpression mittels Durchflusszytometrie, Wachstumseigenschaften, Zyototoxizität gegen ErbB2/HER2-positive und negative Brustkrebszelllinien, Zytokinfreisetzung und Auswachsen nach einer Bestrahlung charakterisiert. Zelloberflächenrezeptoren waren mit wenigen Ausnahmen vergleichbar. Die Expression von CD2, CD11a, CD52, CD54, CD56 und CD337 (NKp30) wurde unter allen Zelllinien aufrechterhalten, während die Expression von CD3 und CD158a negativ blieb. FcγRIII/IL-2 NK-92 regulierte, im Vergleich zu den anderen NK-92-Zelllinien, die Expression von CD314 (NKG2D) hoch, wodurch sie für Zeilzellen preaktiviert ist, welche NKG2D Liganden exprimieren. Obwohl Wildtyp NK-92 Zellen eine Expression von CD336 (NKp44) aufzeigt, war die Expression dieses Rezeptors auf NK-92/5.28.z- und FcγRIII / IL-2-NK-92 nicht vorhanden. Die Expansion aller NK-92-Zelllinien war vergleichbar: NK-92 WT und NK-92 / 5.28.z konnten zu einer Dichte von 1,0 x 10 6 Zellen/ml expandieren, während sich FcγRIII /IL-2 NK-92 auf bis zu 1,2 x 10 6 Zellen wachsen können. Eine Bestrahlung der NK-92 Zellen führte in allen Fällen zu einer Inhibition des Zellwachstums innerhalb von zwei bis drei Tagen, insbesondere bei einer Dosis von 7,5 Gy oder mehr. Ohne Bestrahlung konnten NK-92/5.28.z- und FcγRIII/IL-2-NK-92-Zelllinien fast 100% der ErbB2 (+) - Zielzellen lysieren. Selbst nach einer Bestrahlung mit 10 Gy-konnten NK-92/5.28.z-Zellen eine 100% ige Lyse der Zielzellen aufrechterhalten, während die Zyototoxizität von FcγRIII/IL-2 NK-92 auf 75% Lyse abfiel. Die Zytokinprofile waren in Gegenwart von ErbB2 (+) - Zielzellen für NK-92 WT und FcγRIII / IL-2 NK-92 ähnlich: Beide NK-92-Zelllinien sekretierten mehr Granzym B als IFN-γ, während NK-92/5.28.z in Gegenwart von ErbB2 (+) – Zielzellen mehr IFN-γ als Granzym B sekretierte. Eine Bestrahlung hatte keinen Einfluss auf die Zytokinprofile irgendeiner NK-92-Zelllinie. Die in dieser Arbeit gewonnenen experimentellen Daten können zur Auswahl einer geeigneten NK-92-Variante für klinische Studien, sowie zum Screening anderer NK-92-Varianten für ähnliche Zwecke verwendet werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, einige der Fragestellungen zu adressieren, die sich im Hinblick auf eine therapeutische Anwendung NK-Zell basierter Zelltherapie ergeben. Hierzu wurde eine präklinische NK-92-Zelllinie, die einen hochaffinen Fc-γ-Rezeptor in Kombination mit intrazellulärem IL-2 exprimiert, mit einer NK-92-Zelle verglichen, die einen 2. Generation CAR exprimiert, der aus einer intrazellulären CD3-ζ-Domäne und einem kostimulatorischen CD28-Molekül besteht. Die Effizienz jeder NK-92-Zelllinie, die in den verschiedenen Experimenten beobachtet wurde, kann mit anderen Zelltherapien verglichen werden, um weiter zu bestimmen, ob eine andere Behandlung optimal ist oder ob kombinatorische Behandlungen eine Option sind.:Abstract IV
List of Figures VII
List of Tables VIII
Abbreviations IX
Symbols and Units XII
1. Introduction 1
1.1 The Natural Killer Cell 2
1.1.1 Maturation 2
1.1.2 Cells of the Adaptive Immune System 4
1.1.3 Function 6
1.1.4 NK Cell Activation Receptors 6
1.1.5 NK Cell Inhibition Receptors 7
1.1.6 Targeted Natural Cytotoxicity 8
1.1.7 Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity 9
1.1.8 Death-receptor-mediated Apoptosis 10
1.1.9 IFN-γ 11
1.1.10 Intracellular Signaling Cascades in ADCC-mediated VS Natural Cytotoxicity 12
1.2 Establishment of a Natural Killer Cell Line 14
1.2.1 NK-92 Cells 15
1.2.2 NK-92/5.28.z 15
1.2.3 FcγRIII/IL-2-expressing Preclinical Clone 18
1.3 Therapeutic Monoclonal Antibodies (mAbs) 18
1.4 The Tumor Cell 19
1.5 Objectives/Motivation 19
2. Materials and Methods 21
2.1 Cell Lines and Culture Conditions 22
2.2 Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) 22
2.2.1 Acquisition of Fluorescence-labeled Cells 22
2.2.2 Verification of ErbB2 Expression on Breast Cancer Cell Line 22
2.2.3 Analysis of Expression of the ErbB2 Chimeric scFv Receptor on NK-92/5.28.z Cells 23
2.2.4 Phenotypic Characterization of NK-92 cells 23
2.3 Growth Characteristics 26
2.4 Dye Exclusion for Cell Viability Determination 26
2.5 Radiation of NK-92 cells 26
2.6 Statistical Analysis 26
2.7 Potency Assay 27
2.8 Cytokine Profile in Steady State and Post-activation 28
2.9 Impact of γ-radiation on Cell Growth Kinetics 29
2.10 Impact of Radiation on Potency 29
2.11 Impact of Radiation on Cytokine Profile 29
2.12 Impact of Radiation on Outgrowth of NK-92 30
3. Results 31
3.1 Transgene Expression (Fc Receptor and CAR) on NK-92 32
3.1.1 ErbB2-CAR Expression 32
3.1.2 Fc Receptor Expression 33
3.1.3 Cell Surface Receptor Expression on NK-92 Variants 34
3.2 Impact on Growth Characteristics 35
3.3 Functional Cytotoxicity Against ErbB2-positive and Negative Cell Lines 37
3.4 Cytokine Profile in Steady State and Post-activation 38
3.5 Impact of γ-radiation on Cell Growth Kinetics 41
3.6 Impact of Radiation on Potency 43
3.7 Cytokine Profile Post-radiation 44
3.8 Impact of Radiation on Outgrowth 47
4. Discussion 49
5. Summary 62
5.1 Summary 63
5.2 Zusammenfassung 65
6. Appendix 67
6.1 Declaration of Compliance with Legal Requirements 68
6.2 Supplementary Data 69
References 76
Acknowledgements 87
Publications 88
Declaration of Authorship 8
Phenotypic and Functional Impacts of Genetic Modification on Natural Killer Cells to Express A Chimeric Antigen Receptor (CAR) or High Affinity CD16 Receptor with Specificity to the Tumor-associated Antigen ErbB2
No full textAccording to the National Institute of Health in 2018, new cases of cancer exceeded 18 million with 9.6 million deaths caused by cancer worldwide. It is well known that cancer is a leading cause of death worldwide, yet conventional medical treatments such as chemotherapy are unable to fully treat the disease which has encouraged the development of new therapies. Initially, cell therapies involving T cells were explored and paved the way for further enhancements in genetic modification that could be key to closing the current gap in treatment; however, different forms of genetic modification can impact a treatment in a multitude of ways. This is what inspired the evaluation of the NK-92 cell line efficiency, expandability, and safety amongst genetically modified variants expressing a CAR or high affinity CD16 receptor with endogenous IL-2 production. In this study, I have characterized features of a second generation ErbB2-specific CAR-engineered NK-92 with NK-92 expressing a recombinant Fc receptor to the parental NK-92 cell line with respect to cell surface receptor expression using flow cytometry, growth characteristics, cytotoxicity against ErbB2/HER2 positive and negative breast cancer cell lines, cytokine release, and outgrowth profiles post-irradiation. Cell surface receptors were comparable with a few exceptions. CD2, CD11a, CD52, CD54, CD56, and CD337 (NKp30) expression was maintained amongst all cell lines while CD3 and CD158a expression remained negative. FcγRIII/IL-2 NK-92 gained expression of CD314 (NKG2D) when compared to the other NK-92 cell lines, making it preactivated for target cells expressing ligands of NKG2D. Although WT NK-92 expressed CD336 (NKp44), expression of this receptor was not present on NK-92/5.28.z and FcγRIII/IL-2 NK-92 cell lines. Expansion of all NK-92 cell lines was comparable: WT NK-92 and NK-92/5.28.z were able to expand up to 1.0 x 106 cells/mL while FcγRIII/IL-2 NK-92 was able to expand up to 1.2 x 106 cells/mL. All expansion halted after two to three days with the addition of radiation, especially a dose 7.5 Gy or more. NK-92/5.28.z and FcγRIII/IL-2 NK-92 cell lines were able to lyse almost 100% of ErbB2(+) target cells without irradiation. However, even with the addition of 10 Gy irradiation, NK-92/5.28.z cells were able to maintain 100% lysis of target cells while FcγRIII/IL-2 NK-92 cells dropped down to 75% lysis. Cytokine profiles were similar for NK-92 WT and FcγRIII/IL-2 NK-92 in the presence of ErbB2(+) target cells: both NK-92 cell lines secreted more granzyme B than IFN-γ whereas NK-92/5.28.z secreted more IFN-γ in the presence of ErbB2(+) target cells than granzyme B. The addition of radiation did not affect the trend in cytokine profiles for any NK-92 cell lines. The data found in the experiments included in this study can be used for selecting which NK-92 variant should enter clinical trials as well as for screening other NK-92 variants for similar purposes. The goal of this study was to address some of the issues revolving around NK cell use in cellular therapy by characterizing and comparing a preclinical NK-92 cell expressing high affinity Fc-γ receptor combined with intracellular IL-2 against an NK-92 cell modified to express a second-generation CAR consisting of an intracellular CD3 ζ domain and CD28 costimulatory molecule. The efficiency of each NK-92 cell line seen in the various experiments can be compared to other cell therapies in order to further determine whether another treatment is optimal or if combinatorial treatments are an option.:Abstract IV
List of Figures VII
List of Tables VIII
Abbreviations IX
Symbols and Units XII
1. Introduction 1
1.1 The Natural Killer Cell 2
1.1.1 Maturation 2
1.1.2 Cells of the Adaptive Immune System 4
1.1.3 Function 6
1.1.4 NK Cell Activation Receptors 6
1.1.5 NK Cell Inhibition Receptors 7
1.1.6 Targeted Natural Cytotoxicity 8
1.1.7 Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity 9
1.1.8 Death-receptor-mediated Apoptosis 10
1.1.9 IFN-γ 11
1.1.10 Intracellular Signaling Cascades in ADCC-mediated VS Natural Cytotoxicity 12
1.2 Establishment of a Natural Killer Cell Line 14
1.2.1 NK-92 Cells 15
1.2.2 NK-92/5.28.z 15
1.2.3 FcγRIII/IL-2-expressing Preclinical Clone 18
1.3 Therapeutic Monoclonal Antibodies (mAbs) 18
1.4 The Tumor Cell 19
1.5 Objectives/Motivation 19
2. Materials and Methods 21
2.1 Cell Lines and Culture Conditions 22
2.2 Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) 22
2.2.1 Acquisition of Fluorescence-labeled Cells 22
2.2.2 Verification of ErbB2 Expression on Breast Cancer Cell Line 22
2.2.3 Analysis of Expression of the ErbB2 Chimeric scFv Receptor on NK-92/5.28.z Cells 23
2.2.4 Phenotypic Characterization of NK-92 cells 23
2.3 Growth Characteristics 26
2.4 Dye Exclusion for Cell Viability Determination 26
2.5 Radiation of NK-92 cells 26
2.6 Statistical Analysis 26
2.7 Potency Assay 27
2.8 Cytokine Profile in Steady State and Post-activation 28
2.9 Impact of γ-radiation on Cell Growth Kinetics 29
2.10 Impact of Radiation on Potency 29
2.11 Impact of Radiation on Cytokine Profile 29
2.12 Impact of Radiation on Outgrowth of NK-92 30
3. Results 31
3.1 Transgene Expression (Fc Receptor and CAR) on NK-92 32
3.1.1 ErbB2-CAR Expression 32
3.1.2 Fc Receptor Expression 33
3.1.3 Cell Surface Receptor Expression on NK-92 Variants 34
3.2 Impact on Growth Characteristics 35
3.3 Functional Cytotoxicity Against ErbB2-positive and Negative Cell Lines 37
3.4 Cytokine Profile in Steady State and Post-activation 38
3.5 Impact of γ-radiation on Cell Growth Kinetics 41
3.6 Impact of Radiation on Potency 43
3.7 Cytokine Profile Post-radiation 44
3.8 Impact of Radiation on Outgrowth 47
4. Discussion 49
5. Summary 62
5.1 Summary 63
5.2 Zusammenfassung 65
6. Appendix 67
6.1 Declaration of Compliance with Legal Requirements 68
6.2 Supplementary Data 69
References 76
Acknowledgements 87
Publications 88
Declaration of Authorship 89Laut dem National Institute of Health überstiegen im Jahr 2018 neue Krebsfälle 18 Millionen mit 9,6 Millionen krebsbedingten Todesfällen weltweit. Es ist bekannt, dass Krebs weltweit eine der häufigsten Todesursachen ist, jedoch können konventionelle medizinische Behandlungen, wie eine Chemotherapie, nicht vollständig behandeln, was die Entwicklung neuer Therapien gefördert hat. Zunächst wurden Zelltherapien mit T-Zellen erprobt, welche den Weg für weitere genetische Verbesserungen geebnet haben, die in der Lage sein könnten die derzeitige Behandlungslücke zu schließen. Verschiedene Formen einer genetischen Veränderung können eine Behandlung auf vielfältige Weise beeinflussen. Dies war der Grund für die Bewertung der Effizienz, Erweiterbarkeit und Sicherheit der NK-92-Zelllinie und ihrer genetisch veränderten Varianten, die jeweils einen chimären Antigenrezeptor (CAR) oder einen hochaffinen CD16-Rezeptor zusammen mit einem endogen exprimierten IL-2 exprimieren. In dieser Arbeit habe ich Eigenschaften einer mit einem ErbB2- spezifischen CAR der 2. Generation ausgestatteten NK-92 Zelllinie mit einer NK-92 Zelllinie mit rekombinanter Fc Rezeptor Expression und mit parentalen NK-92 Zellen in Bezug auf die Oberfächenrezeptorexpression mittels Durchflusszytometrie, Wachstumseigenschaften, Zyototoxizität gegen ErbB2/HER2-positive und negative Brustkrebszelllinien, Zytokinfreisetzung und Auswachsen nach einer Bestrahlung charakterisiert. Zelloberflächenrezeptoren waren mit wenigen Ausnahmen vergleichbar. Die Expression von CD2, CD11a, CD52, CD54, CD56 und CD337 (NKp30) wurde unter allen Zelllinien aufrechterhalten, während die Expression von CD3 und CD158a negativ blieb. FcγRIII/IL-2 NK-92 regulierte, im Vergleich zu den anderen NK-92-Zelllinien, die Expression von CD314 (NKG2D) hoch, wodurch sie für Zeilzellen preaktiviert ist, welche NKG2D Liganden exprimieren. Obwohl Wildtyp NK-92 Zellen eine Expression von CD336 (NKp44) aufzeigt, war die Expression dieses Rezeptors auf NK-92/5.28.z- und FcγRIII / IL-2-NK-92 nicht vorhanden. Die Expansion aller NK-92-Zelllinien war vergleichbar: NK-92 WT und NK-92 / 5.28.z konnten zu einer Dichte von 1,0 x 10 6 Zellen/ml expandieren, während sich FcγRIII /IL-2 NK-92 auf bis zu 1,2 x 10 6 Zellen wachsen können. Eine Bestrahlung der NK-92 Zellen führte in allen Fällen zu einer Inhibition des Zellwachstums innerhalb von zwei bis drei Tagen, insbesondere bei einer Dosis von 7,5 Gy oder mehr. Ohne Bestrahlung konnten NK-92/5.28.z- und FcγRIII/IL-2-NK-92-Zelllinien fast 100% der ErbB2 (+) - Zielzellen lysieren. Selbst nach einer Bestrahlung mit 10 Gy-konnten NK-92/5.28.z-Zellen eine 100% ige Lyse der Zielzellen aufrechterhalten, während die Zyototoxizität von FcγRIII/IL-2 NK-92 auf 75% Lyse abfiel. Die Zytokinprofile waren in Gegenwart von ErbB2 (+) - Zielzellen für NK-92 WT und FcγRIII / IL-2 NK-92 ähnlich: Beide NK-92-Zelllinien sekretierten mehr Granzym B als IFN-γ, während NK-92/5.28.z in Gegenwart von ErbB2 (+) – Zielzellen mehr IFN-γ als Granzym B sekretierte. Eine Bestrahlung hatte keinen Einfluss auf die Zytokinprofile irgendeiner NK-92-Zelllinie. Die in dieser Arbeit gewonnenen experimentellen Daten können zur Auswahl einer geeigneten NK-92-Variante für klinische Studien, sowie zum Screening anderer NK-92-Varianten für ähnliche Zwecke verwendet werden. Das Ziel dieser Arbeit war es, einige der Fragestellungen zu adressieren, die sich im Hinblick auf eine therapeutische Anwendung NK-Zell basierter Zelltherapie ergeben. Hierzu wurde eine präklinische NK-92-Zelllinie, die einen hochaffinen Fc-γ-Rezeptor in Kombination mit intrazellulärem IL-2 exprimiert, mit einer NK-92-Zelle verglichen, die einen 2. Generation CAR exprimiert, der aus einer intrazellulären CD3-ζ-Domäne und einem kostimulatorischen CD28-Molekül besteht. Die Effizienz jeder NK-92-Zelllinie, die in den verschiedenen Experimenten beobachtet wurde, kann mit anderen Zelltherapien verglichen werden, um weiter zu bestimmen, ob eine andere Behandlung optimal ist oder ob kombinatorische Behandlungen eine Option sind.:Abstract IV
List of Figures VII
List of Tables VIII
Abbreviations IX
Symbols and Units XII
1. Introduction 1
1.1 The Natural Killer Cell 2
1.1.1 Maturation 2
1.1.2 Cells of the Adaptive Immune System 4
1.1.3 Function 6
1.1.4 NK Cell Activation Receptors 6
1.1.5 NK Cell Inhibition Receptors 7
1.1.6 Targeted Natural Cytotoxicity 8
1.1.7 Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity 9
1.1.8 Death-receptor-mediated Apoptosis 10
1.1.9 IFN-γ 11
1.1.10 Intracellular Signaling Cascades in ADCC-mediated VS Natural Cytotoxicity 12
1.2 Establishment of a Natural Killer Cell Line 14
1.2.1 NK-92 Cells 15
1.2.2 NK-92/5.28.z 15
1.2.3 FcγRIII/IL-2-expressing Preclinical Clone 18
1.3 Therapeutic Monoclonal Antibodies (mAbs) 18
1.4 The Tumor Cell 19
1.5 Objectives/Motivation 19
2. Materials and Methods 21
2.1 Cell Lines and Culture Conditions 22
2.2 Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) 22
2.2.1 Acquisition of Fluorescence-labeled Cells 22
2.2.2 Verification of ErbB2 Expression on Breast Cancer Cell Line 22
2.2.3 Analysis of Expression of the ErbB2 Chimeric scFv Receptor on NK-92/5.28.z Cells 23
2.2.4 Phenotypic Characterization of NK-92 cells 23
2.3 Growth Characteristics 26
2.4 Dye Exclusion for Cell Viability Determination 26
2.5 Radiation of NK-92 cells 26
2.6 Statistical Analysis 26
2.7 Potency Assay 27
2.8 Cytokine Profile in Steady State and Post-activation 28
2.9 Impact of γ-radiation on Cell Growth Kinetics 29
2.10 Impact of Radiation on Potency 29
2.11 Impact of Radiation on Cytokine Profile 29
2.12 Impact of Radiation on Outgrowth of NK-92 30
3. Results 31
3.1 Transgene Expression (Fc Receptor and CAR) on NK-92 32
3.1.1 ErbB2-CAR Expression 32
3.1.2 Fc Receptor Expression 33
3.1.3 Cell Surface Receptor Expression on NK-92 Variants 34
3.2 Impact on Growth Characteristics 35
3.3 Functional Cytotoxicity Against ErbB2-positive and Negative Cell Lines 37
3.4 Cytokine Profile in Steady State and Post-activation 38
3.5 Impact of γ-radiation on Cell Growth Kinetics 41
3.6 Impact of Radiation on Potency 43
3.7 Cytokine Profile Post-radiation 44
3.8 Impact of Radiation on Outgrowth 47
4. Discussion 49
5. Summary 62
5.1 Summary 63
5.2 Zusammenfassung 65
6. Appendix 67
6.1 Declaration of Compliance with Legal Requirements 68
6.2 Supplementary Data 69
References 76
Acknowledgements 87
Publications 88
Declaration of Authorship 8
Adaptation of a switchable CAR technology for the treatment of glioblastoma
No full textGlioblastoma (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor in adults, with a dismal prognosis and limited treatment options. The current standard of care, involving surgery, radiotherapy, and chemotherapy, often fails to prevent recurrence due to the tumor's invasive nature and immunosuppressive microenvironment. Immunotherapy has emerged as a promising avenue for GBM treatment, aiming to harness the patient's immune system to combat cancer cells. This thesis explores the potential of the UniCAR T cell platform, a switchable chimeric antigen receptor (CAR) technology, to address the challenges of antigen escape and T cell exhaustion in GBM.
The UniCAR platform offers a unique approach to CAR T cell therapy by separating the antigen recognition and T cell activation functions into two distinct components: a universal CAR T cell and a soluble targeting module (TM). This modular design allows for flexible targeting of multiple tumor antigens and precise control over T cell activation, potentially mitigating the risk of antigen escape and T cell exhaustion. The thesis focuses on developing TMs against two tumor-associated antigens (TAAs) commonly overexpressed in GBM: interleukin-13 receptor subunit alpha 2 (IL-13Rα2) and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2).
For IL-13Rα2 targeting, the thesis explores two distinct approaches: ligand-based and antibody-based TMs. The ligand-based approach utilizes the natural ligand of IL-13Rα2, interleukin-13 (IL-13), which exhibits high affinity for the receptor. However, IL-13 also interacts with the ubiquitously expressed IL-13Rα1, raising concerns about potential cross-reactivity and off-target effects. To address this, the thesis investigates various IL-13 muteins with amino acid substitutions designed to enhance specificity for IL-13Rα2 while minimizing interaction with IL-13Rα1. TM-IL13mut-V6 was selected as the lead ligand-based TM due to its optimal balance of high potency against IL13Rα2-expressing cells and absence of cross-reactivity with IL13Rα1. Additionally, the thesis explores the fusion of IL-13-based TMs with a silenced IgG1 Fc domain to extend their half-life in plasma, potentially improving therapeutic efficacy and reducing the need for continuous infusions in patients with reduced tumor burden.
The antibody-based approach involves developing novel murine antibodies against IL-13Rα2 and humanizing them to minimize immunogenicity in humans. The thesis describes the generation and characterization of several scFv-based TMs derived from these antibodies, with a focus on optimizing their affinity, potency, and biochemical properties. The lead candidate, TM-IL13Rα2-huV4, demonstrates high affinity and potency against IL-13Rα2-expressing cells, along with favorable stability and reduced immunogenicity risk.
For HER2 targeting, the thesis develops a TM based on the well-established monoclonal antibody trastuzumab, which has shown clinical success in treating HER2-positive breast cancer. The trastuzumab-derived TM exhibits high affinity and potency against HER2-expressing cells, with favorable biochemical and pharmacokinetic properties.
The thesis also investigates the pharmacodynamic properties of the lead TMs, including their internalization kinetics and therapeutic efficacy in vivo. The ligand-based TM-IL13mut-V6 demonstrates faster internalization in glioblastoma cells compared to the scFv-based TMs, potentially contributing to its rapid clearance. In vivo studies in mouse models demonstrate the ability of the TMs to engage UniCAR T cells and mediate tumor cell lysis, confirming their therapeutic potential. However, challenges such as alloreactivity and the need for improved animal models are identified, highlighting areas for further research and development.
In conclusion, this thesis provides a comprehensive exploration of the UniCAR T cell platform for glioblastoma treatment, focusing on the development and characterization of TMs against IL-13Rα2 and HER2. The findings demonstrate the feasibility of targeting these TAAs with UniCAR T cells and highlight the potential of this modular approach to overcome the challenges of antigen escape and T cell exhaustion in GBM. The thesis also identifies areas for further research, including the development of more sophisticated animal models and the optimization of TM design and delivery strategies. Overall, this research contributes to the growing body of knowledge on CAR T cell therapy for solid tumors and offers promising avenues for the development of more effective treatments for glioblastoma.Glioblastom (GBM) ist der häufigste und aggressivste primäre Hirntumor bei Erwachsenen mit einer düsteren Prognose und begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Die derzeitige Standardbehandlung, die chirurgische Entfernung, Strahlentherapie und Chemotherapie umfasst, kann ein Wiederauftreten aufgrund der Invasivität des Tumors und der immunsuppressiven Mikroumgebung oft nicht verhindern. Die Immuntherapie, die das Immunsystem des Patienten zur Bekämpfung von Krebszellen nutzt, hat sich als vielversprechender Weg für die GBM-Behandlung erwiesen. Diese Arbeit untersucht das Potenzial der UniCAR-T-Zellplattform, einer schaltbaren chimären Antigenrezeptor-(CAR)-Technologie, um die Herausforderungen des Antigenverlusts und der T-Zellerschöpfung bei GBM anzugehen.
Die UniCAR-Plattform bietet einen einzigartigen Ansatz für die CAR-T-Zelltherapie, indem sie die Funktionen der Antigenerkennung und der T-Zellaktivierung in zwei verschiedene Komponenten trennt: eine universelle CAR-T-Zelle und ein lösliches Targeting-Modul (TM). Dieses modulare Design ermöglicht eine flexible Ausrichtung auf mehrere Tumorantigene und eine präzise Kontrolle über die T-Zellaktivierung, wodurch möglicherweise das Risiko eines Antigenverlusts und einer T-Zellerschöpfung verringert wird. Die Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung von TMs gegen zwei tumorassoziierte Antigene (TAAs), die bei GBM häufig überexprimiert werden: Interleukin-13-Rezeptor-Untereinheit alpha 2 (IL-13Rα2) und humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2).
Für das IL-13Rα2-Targeting untersucht die Arbeit zwei unterschiedliche Ansätze: Liganden-basierte und Antikörper-basierte TMs. Der Liganden-basierte Ansatz nutzt den natürlichen Liganden von IL-13Rα2, Interleukin-13 (IL-13), der eine hohe Affinität für den Rezeptor aufweist. IL-13 interagiert jedoch auch mit dem ubiquitär exprimierten IL-13Rα1, was Bedenken hinsichtlich potenzieller Kreuzreaktivität und Off-Target-Effekten aufwirft. Um dies zu beheben, untersucht die Arbeit verschiedene IL-13-Muteine mit Aminosäuresubstitutionen, die darauf abzielen, die Spezifität für IL-13Rα2 zu erhöhen und gleichzeitig die Wechselwirkung mit IL-13Rα1 zu minimieren. TM-IL13mut-V6 wurde als führendes Liganden-basiertes TM ausgewählt, da es eine optimale Balance zwischen hoher Wirksamkeit gegen IL13Rα2-exprimierende Zellen und fehlender Kreuzreaktivität mit IL13Rα1 bietet. Zusätzlich untersucht die Arbeit die Fusion von IL-13-basierten TMs mit einer stummen IgG1-Fc-Domäne, um ihre Halbwertszeit im Plasma zu verlängern, was möglicherweise die therapeutische Wirksamkeit verbessert und die Notwendigkeit kontinuierlicher Infusionen bei Patienten mit reduzierter Tumorlast verringert.
Der Antikörper-basierte Ansatz beinhaltet die Entwicklung neuartiger muriner Antikörper gegen IL-13Rα2 und deren Humanisierung, um die Immunogenität beim Menschen zu minimieren. Die Arbeit beschreibt die Erzeugung und Charakterisierung mehrerer scFv-basierter TMs, die von diesen Antikörpern abgeleitet sind, mit dem Fokus auf der Optimierung ihrer Affinität, Wirksamkeit und biochemischen Eigenschaften. Der Hauptkandidat, TM-IL13Rα2-huV4, zeigt eine hohe Affinität und Wirksamkeit gegen IL-13Rα2-exprimierende Zellen, zusammen mit einer günstigen Stabilität und einem reduzierten Immunogenitätsrisiko.
Für das HER2-Targeting entwickelt die Arbeit ein TM, das auf dem etablierten monoklonalen Antikörper Trastuzumab basiert, welcher klinische Erfolge bei der Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs gezeigt hat. Das von Trastuzumab abgeleitete TM weist eine hohe Affinität und Wirksamkeit gegen HER2-exprimierende Zellen auf, zusammen mit günstigen biochemischen und pharmakokinetischen Eigenschaften.
Die Arbeit untersucht auch die pharmakodynamischen Eigenschaften der führenden TMs, einschließlich ihrer Internalisierungskinetik und therapeutischen Wirksamkeit in vivo. Das Liganden-basierte TM-IL13mut-V6 zeigt eine schnellere Internalisierung in Glioblastomzellen im Vergleich zu den scFv-basierten TMs, was möglicherweise zu seiner schnellen Clearance beiträgt. In-vivo-Studien in Mausmodellen zeigen die Fähigkeit der TMs, UniCAR-T-Zellen zu aktivieren und die Lyse von Tumorzellen zu vermitteln, was ihr therapeutisches Potenzial bestätigt. Herausforderungen wie Alloreaktivität und die Notwendigkeit verbesserter Tiermodelle werden jedoch identifiziert, was Bereiche für weitere Forschung und Entwicklung hervorhebt.
Zusammenfassend bietet diese Arbeit eine umfassende Untersuchung der UniCAR-T-Zellplattform für die Glioblastom-Behandlung, wobei der Schwerpunkt auf der Entwicklung und Charakterisierung von TMs gegen IL-13Rα2 und HER2 liegt. Die Ergebnisse zeigen die Machbarkeit des Targetings dieser TAAs mit UniCAR-T-Zellen und unterstreichen das Potenzial dieses modularen Ansatzes, die Herausforderungen des Antigenverlusts und der T-Zellerschöpfung bei GBM zu überwinden. Die Arbeit identifiziert auch Bereiche für weitere Forschung, einschließlich der Entwicklung anspruchsvollerer Tiermodelle und der Optimierung von TM-Design und Verabreichungsstrategien. Insgesamt trägt diese Forschung zum wachsenden Wissen über die CAR-T-Zelltherapie für solide Tumore bei und bietet vielversprechende Wege für die Entwicklung wirksamerer Behandlungen für Glioblastom
Adaptation of a switchable CAR technology for the treatment of glioblastoma
No full textGlioblastoma (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor in adults, with a dismal prognosis and limited treatment options. The current standard of care, involving surgery, radiotherapy, and chemotherapy, often fails to prevent recurrence due to the tumor's invasive nature and immunosuppressive microenvironment. Immunotherapy has emerged as a promising avenue for GBM treatment, aiming to harness the patient's immune system to combat cancer cells. This thesis explores the potential of the UniCAR T cell platform, a switchable chimeric antigen receptor (CAR) technology, to address the challenges of antigen escape and T cell exhaustion in GBM.
The UniCAR platform offers a unique approach to CAR T cell therapy by separating the antigen recognition and T cell activation functions into two distinct components: a universal CAR T cell and a soluble targeting module (TM). This modular design allows for flexible targeting of multiple tumor antigens and precise control over T cell activation, potentially mitigating the risk of antigen escape and T cell exhaustion. The thesis focuses on developing TMs against two tumor-associated antigens (TAAs) commonly overexpressed in GBM: interleukin-13 receptor subunit alpha 2 (IL-13Rα2) and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2).
For IL-13Rα2 targeting, the thesis explores two distinct approaches: ligand-based and antibody-based TMs. The ligand-based approach utilizes the natural ligand of IL-13Rα2, interleukin-13 (IL-13), which exhibits high affinity for the receptor. However, IL-13 also interacts with the ubiquitously expressed IL-13Rα1, raising concerns about potential cross-reactivity and off-target effects. To address this, the thesis investigates various IL-13 muteins with amino acid substitutions designed to enhance specificity for IL-13Rα2 while minimizing interaction with IL-13Rα1. TM-IL13mut-V6 was selected as the lead ligand-based TM due to its optimal balance of high potency against IL13Rα2-expressing cells and absence of cross-reactivity with IL13Rα1. Additionally, the thesis explores the fusion of IL-13-based TMs with a silenced IgG1 Fc domain to extend their half-life in plasma, potentially improving therapeutic efficacy and reducing the need for continuous infusions in patients with reduced tumor burden.
The antibody-based approach involves developing novel murine antibodies against IL-13Rα2 and humanizing them to minimize immunogenicity in humans. The thesis describes the generation and characterization of several scFv-based TMs derived from these antibodies, with a focus on optimizing their affinity, potency, and biochemical properties. The lead candidate, TM-IL13Rα2-huV4, demonstrates high affinity and potency against IL-13Rα2-expressing cells, along with favorable stability and reduced immunogenicity risk.
For HER2 targeting, the thesis develops a TM based on the well-established monoclonal antibody trastuzumab, which has shown clinical success in treating HER2-positive breast cancer. The trastuzumab-derived TM exhibits high affinity and potency against HER2-expressing cells, with favorable biochemical and pharmacokinetic properties.
The thesis also investigates the pharmacodynamic properties of the lead TMs, including their internalization kinetics and therapeutic efficacy in vivo. The ligand-based TM-IL13mut-V6 demonstrates faster internalization in glioblastoma cells compared to the scFv-based TMs, potentially contributing to its rapid clearance. In vivo studies in mouse models demonstrate the ability of the TMs to engage UniCAR T cells and mediate tumor cell lysis, confirming their therapeutic potential. However, challenges such as alloreactivity and the need for improved animal models are identified, highlighting areas for further research and development.
In conclusion, this thesis provides a comprehensive exploration of the UniCAR T cell platform for glioblastoma treatment, focusing on the development and characterization of TMs against IL-13Rα2 and HER2. The findings demonstrate the feasibility of targeting these TAAs with UniCAR T cells and highlight the potential of this modular approach to overcome the challenges of antigen escape and T cell exhaustion in GBM. The thesis also identifies areas for further research, including the development of more sophisticated animal models and the optimization of TM design and delivery strategies. Overall, this research contributes to the growing body of knowledge on CAR T cell therapy for solid tumors and offers promising avenues for the development of more effective treatments for glioblastoma.Glioblastom (GBM) ist der häufigste und aggressivste primäre Hirntumor bei Erwachsenen mit einer düsteren Prognose und begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Die derzeitige Standardbehandlung, die chirurgische Entfernung, Strahlentherapie und Chemotherapie umfasst, kann ein Wiederauftreten aufgrund der Invasivität des Tumors und der immunsuppressiven Mikroumgebung oft nicht verhindern. Die Immuntherapie, die das Immunsystem des Patienten zur Bekämpfung von Krebszellen nutzt, hat sich als vielversprechender Weg für die GBM-Behandlung erwiesen. Diese Arbeit untersucht das Potenzial der UniCAR-T-Zellplattform, einer schaltbaren chimären Antigenrezeptor-(CAR)-Technologie, um die Herausforderungen des Antigenverlusts und der T-Zellerschöpfung bei GBM anzugehen.
Die UniCAR-Plattform bietet einen einzigartigen Ansatz für die CAR-T-Zelltherapie, indem sie die Funktionen der Antigenerkennung und der T-Zellaktivierung in zwei verschiedene Komponenten trennt: eine universelle CAR-T-Zelle und ein lösliches Targeting-Modul (TM). Dieses modulare Design ermöglicht eine flexible Ausrichtung auf mehrere Tumorantigene und eine präzise Kontrolle über die T-Zellaktivierung, wodurch möglicherweise das Risiko eines Antigenverlusts und einer T-Zellerschöpfung verringert wird. Die Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung von TMs gegen zwei tumorassoziierte Antigene (TAAs), die bei GBM häufig überexprimiert werden: Interleukin-13-Rezeptor-Untereinheit alpha 2 (IL-13Rα2) und humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2).
Für das IL-13Rα2-Targeting untersucht die Arbeit zwei unterschiedliche Ansätze: Liganden-basierte und Antikörper-basierte TMs. Der Liganden-basierte Ansatz nutzt den natürlichen Liganden von IL-13Rα2, Interleukin-13 (IL-13), der eine hohe Affinität für den Rezeptor aufweist. IL-13 interagiert jedoch auch mit dem ubiquitär exprimierten IL-13Rα1, was Bedenken hinsichtlich potenzieller Kreuzreaktivität und Off-Target-Effekten aufwirft. Um dies zu beheben, untersucht die Arbeit verschiedene IL-13-Muteine mit Aminosäuresubstitutionen, die darauf abzielen, die Spezifität für IL-13Rα2 zu erhöhen und gleichzeitig die Wechselwirkung mit IL-13Rα1 zu minimieren. TM-IL13mut-V6 wurde als führendes Liganden-basiertes TM ausgewählt, da es eine optimale Balance zwischen hoher Wirksamkeit gegen IL13Rα2-exprimierende Zellen und fehlender Kreuzreaktivität mit IL13Rα1 bietet. Zusätzlich untersucht die Arbeit die Fusion von IL-13-basierten TMs mit einer stummen IgG1-Fc-Domäne, um ihre Halbwertszeit im Plasma zu verlängern, was möglicherweise die therapeutische Wirksamkeit verbessert und die Notwendigkeit kontinuierlicher Infusionen bei Patienten mit reduzierter Tumorlast verringert.
Der Antikörper-basierte Ansatz beinhaltet die Entwicklung neuartiger muriner Antikörper gegen IL-13Rα2 und deren Humanisierung, um die Immunogenität beim Menschen zu minimieren. Die Arbeit beschreibt die Erzeugung und Charakterisierung mehrerer scFv-basierter TMs, die von diesen Antikörpern abgeleitet sind, mit dem Fokus auf der Optimierung ihrer Affinität, Wirksamkeit und biochemischen Eigenschaften. Der Hauptkandidat, TM-IL13Rα2-huV4, zeigt eine hohe Affinität und Wirksamkeit gegen IL-13Rα2-exprimierende Zellen, zusammen mit einer günstigen Stabilität und einem reduzierten Immunogenitätsrisiko.
Für das HER2-Targeting entwickelt die Arbeit ein TM, das auf dem etablierten monoklonalen Antikörper Trastuzumab basiert, welcher klinische Erfolge bei der Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs gezeigt hat. Das von Trastuzumab abgeleitete TM weist eine hohe Affinität und Wirksamkeit gegen HER2-exprimierende Zellen auf, zusammen mit günstigen biochemischen und pharmakokinetischen Eigenschaften.
Die Arbeit untersucht auch die pharmakodynamischen Eigenschaften der führenden TMs, einschließlich ihrer Internalisierungskinetik und therapeutischen Wirksamkeit in vivo. Das Liganden-basierte TM-IL13mut-V6 zeigt eine schnellere Internalisierung in Glioblastomzellen im Vergleich zu den scFv-basierten TMs, was möglicherweise zu seiner schnellen Clearance beiträgt. In-vivo-Studien in Mausmodellen zeigen die Fähigkeit der TMs, UniCAR-T-Zellen zu aktivieren und die Lyse von Tumorzellen zu vermitteln, was ihr therapeutisches Potenzial bestätigt. Herausforderungen wie Alloreaktivität und die Notwendigkeit verbesserter Tiermodelle werden jedoch identifiziert, was Bereiche für weitere Forschung und Entwicklung hervorhebt.
Zusammenfassend bietet diese Arbeit eine umfassende Untersuchung der UniCAR-T-Zellplattform für die Glioblastom-Behandlung, wobei der Schwerpunkt auf der Entwicklung und Charakterisierung von TMs gegen IL-13Rα2 und HER2 liegt. Die Ergebnisse zeigen die Machbarkeit des Targetings dieser TAAs mit UniCAR-T-Zellen und unterstreichen das Potenzial dieses modularen Ansatzes, die Herausforderungen des Antigenverlusts und der T-Zellerschöpfung bei GBM zu überwinden. Die Arbeit identifiziert auch Bereiche für weitere Forschung, einschließlich der Entwicklung anspruchsvollerer Tiermodelle und der Optimierung von TM-Design und Verabreichungsstrategien. Insgesamt trägt diese Forschung zum wachsenden Wissen über die CAR-T-Zelltherapie für solide Tumore bei und bietet vielversprechende Wege für die Entwicklung wirksamerer Behandlungen für Glioblastom
Serum immune checkpoint profiling identifies soluble CD40 as a biomarker for pancreatic cancer
No full textAbstract Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) responds poorly to systemic treatment, including new immunotherapeutic approaches. Biomarkers are urgently needed for early disease detection, patient stratification for treatment, and response prediction. The role of soluble CD40 (sCD40) is unknown in PDAC. In this study, we performed a quantitative multiplex analysis of 17 immune checkpoint proteins in serum samples from patients with various stages of PDAC in a discovery study ( n = 107) and analyzed sCD40 by ELISA in a validation study ( n = 317). Youden’s J statistic was used for diagnostic cut-off optimization. A Cox proportional hazards regression model was applied in an empiric approach for prognostic threshold optimization. Kaplan–Meier estimator and multivariable Cox regression analyses were used for survival analysis. sCD40 was significantly increased in the serum of patients with PDAC compared to healthy cohorts and patients with IPMN. In the validation cohort, the area under the receiver operating characteristic (ROC) c-statistic was 0.8, and combining sCD40 with CA19-9 yielded a c-statistic of 0.95. sCD40 levels were independent of the tumor stage. However, patients who received neoadjuvant chemotherapy had significantly lower sCD40 levels than those who underwent upfront surgery. Patients with a sCD40 level above the empirical threshold of 0.83 ng/ml had a significantly reduced overall survival with a hazard ratio of 1.4. This observation was pronounced in patients after neoadjuvant chemotherapy. Collectively, soluble CD40 may be considered as both a diagnostic and prognostic non-invasive biomarker in PDAC.Monika Kutzner Stiftung; German Cancer Consortium (DKTK); Medical Faculty Carl Gustav Carus TU DresdenDeutsche Forschungsgemeinschaft https://doi.org/10.13039/501100001659Jung Stiftung; Monika Kutzner Stiftung; Else Kröner Foundation; Medical Faculty Carl Gustav Carus TU Dresde
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