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Miniaturisierung von Proteomics-Probenvorbereitung mittels digitaler Mikrofluidik
Full text linkApproaches for mass spectrometry-based proteomics have experienced significant sensitivity improvements in recent years, making the analysis of limited sample amounts feasible. However, due to factors such as manual pipetting errors and the large volumes of reactants used, conventional proteomics protocols are not applicable for low-input proteomic sample processing. In nanoproteomics, sample preparation methods are tailored to the analysis of minute amounts of sample or even single cells. In this work, digital microfluidics as a liquid handling technology was introduced, adapted, and optimized for miniaturized proteomics sample preparation. This comprised four experimental sub-projects focusing on the development of suitable sample preparation steps and technical adaptations for digital microfluidics. The primary objective was to achieve both qualitative and quantitative proteome analyses of very small sample quantities
Development and improved resolution of a Cassinian ion trap by means of simulation and experimental results
Full text linkIn modern mass spectrometry ion traps are very popular. Due to their construction and the use of high performance vacuum equipment, ion traps like the Orbitrap or the FT-ICR-experiment yield us very highly resolved mass spectra. Besides these popular ion traps, more traps can be realized using the same mathematical expression. One of them is the Cassinian ion trap.
The aim of this work is to present a way of taking one of the only existing and working Cas-sinian ion traps and increasing its resolving power. To achieve this goal the capabilities and characteristics of the existing design need to be evaluated. The first part of this work presents the results of this characterization by determining the ideal setup and by giving examples for diffe-rent experimental analytical problems.
After characterization the limits of this first design were quite obvious. Apparently a redesign of the Cassinian ion trap's geometry was necessary. For this purpose computer models using SimIon, COMSOL and Inventor were created. A way was developed to calculate the mass spec¬trum of an ionic species inside the ion trap. By using the Shockley-Ramo theorem and the Green’s reciprocity theorem we computed an algorithm to calculate the induced signal inside the measuring electrodes of the ion trap. Utilizing this algorithm the resolving power of any trap geometry can be calculated. Weighting the quality of the new trap designs by their theoretical resolving power, more efficient versions of the Cassinian trap were determined.
Subsequently, the most promising design was manufactured. Finally, this work presents the first measurements on the new so called High-Field-Cassinian ion trap and its characteristics. The resolving power was increased by 29.1% (at m/z 443) with this new setup.
This presented way of redesigning and optimizing a mass spectrometer can now be adopted to improve any given mass spectrometer in the future
Entwicklung bioanalytischer Methoden zur quantitativen und qualitativen Analyse von markierten Peptiden und Proteinen durch Kopplung von Chromatographie und Massenspektrometrie
Full text linkThis PhD thesis was a Cotutelle between the Université de Pau et des Pays de l’Adour (UPPA) in Pau, France and the Christian-Albrechts University (CAU) in Kiel, Germany. In the course of this international collaboration, bio-analytical methods for the quantitative and qualitative analysis of labelled peptides and proteins were developed, which were based on the hyphenation of chromatography with mass spectrometry.
Peptides and protein digests were lanthanide labelled using DOTA-based compounds according to an optimised protocol. Separation on the peptide level was performed using IP-RP-nanoHPLC. Complementary data sets were acquired using MALDI-MS for identification and ICP-MS for quantification. In this context, an online precleaning step was developed and implemented in the nanoHPLC separation routine, which allowed for effective removal of excess reagents. This lead to lowered metal backgrounds during ICP-MS measurements and thus better data interpretability, while guarding peptide recovery at a maximum level.
An alternative offline purification using solid phase extraction (SPE) resulted in important peptide losses and can be considered unsuitable for quantitative analysis. Additives to the nanoHPLC eluents, such as HFBA and EDTA were tested and not deemed beneficial for the analysis of normal peptide samples. HFBA can be reconsidered for special application on very hydrophilic peptide species.
A set of labelled peptides was developed, which due to application of known quantities could be employed for quick and simple quantification of a low complexity digest sample. In addition this peptide set allowed for the reliable superposition of chromatograms, enabling sample comparability especially for complementary ICP-MS and MALDI-MS data.
Experiments for application of fsLA-ICP-MS on MALDI-MS target plates were conducted and showed very promising results. For this purpose, samples that were already identified using MALDI-MS were supposed to be remeasured using fsLA-ICP-MS. First quantification attempts on the modified steel target plate were successful and in the range of expectance. Adjusted parameters for MALDI-MS allowed for proper peptide identifications.Diese Dissertation entstand im Rahmen einer Cotutelle zwischen der Université de Pau et des Pays de l’Adour (UPPA) in Pau, Frankreich und der Christian-Albrechts Universität zu Kiel (CAU), Deutschland. Während dieser internationalen Zusammenarbeit wurden bioanalytische Methoden für die quantitative wie qualitative Analyse markierter Peptide und Proteine erarbeitet. Die Arbeiten basierten auf der Kopplung von Chromatographie und Massenspektrometrie.
Peptide und Proteinverdaue wurden nach einem optimierten Protokoll mit DOTA-basierten Verbindungen lanthanid-markiert. Die Separation auf Peptidebene wurde mittels IP-RP-nanoHPLC durchgeführt. Komplementäre Datensätze wurden mittels MALDI-MS zur Peptidindentifizierung und mittels ICP-MS zur Quantifizierung erstellt. In diesem Rahmen wurde ein online Aufreinigungsschritt zur effektiven Entfernung von Reagenzüberschüssen entwickelt und in die nanoHPLC Trennungsmethode implementiert. Dies führte zu niedrigeren Metallhintergrundwertem in nanoHPLC-ICP-MS Messungen und einer besseren Interpretierbarkeit der Daten, gleichzeitig konnten die Peptidausbeuten auf höchstem Niveau erhalten bleiben. Alternative offline Reinigung mittels Festphasenextraktion (SPE) verursachte beträchtliche Verluste in den Peptidausbeuten und konnte für quantitative Analysen als ungeeignet erachtet werden. Die Zumischung verschiedener Substanzen, wie HFBA und EDTA zu den Eluenten der nanoHPLC wurde untersucht und für die Analyse normaler Peptidproben als wenig nutzbringend befunden. HFBA kann dennoch eventuell für Spezialanwendungen auf besonders hydrophile Peptide in Betracht gezogen werden.
Ein Satz markierter Peptide wurde zusammengestellt, welcher durch Verwendung bekannter Mengen für eine schnelle und einfache Quantifizierung einer wenig komplexen Probe eingesetzt werden konnte. Zudem konnten diese Peptide dazu verwendet werden, eine zuverlässige Überlagerung von Chromatogrammen zu erwirken und damit die Probenvergleichbarkeit speziell zwischen ICP-MS und MALDI-MS sicher zu stellen.
Versuche zur Anwendung von fsLA-ICP-MS auf MALDI-Stahlplatten wurden durchgeführt und zeigten vielversprechende Ergebnisse. Hierzu sollten bereits mit MALDI-MS identifizierte Proben, erneut mittels fsLA-ICP-MS gemessen werden. Erste Quantifizierungsversuche auf modifizierten MALDI-Platten waren erfolgreich. Angepasste MALDI-MS Parameter ermöglichten eine eindeutige Peptididentifikation
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Methodische Ansätze zur Analyse posttranslationaler Modifikationen mittels Top-Down und Bottom-Up Proteomics
Full text linkDie vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Methode zur Analyse glykosylierter Proteine mittels Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie sowie die methodischen Ansätze zur Identifizierung unbekannter antimikrobiell wirksamer Faktoren aus Extrakten von Hautproben. Im ersten Abschnitt wurde sich die Affinität von Lektinen für Glykanstrukturen zunutze gemacht, um selbige durch Affinitätschromatographie abzutrennen und die in der Probe enthaltenen Peptide massenspektrometrisch zu analysieren. Für die Analytik der antimikrobiellen Peptide wurden verschiedene enzymatische Ansätze verfolgt, welche die zweifelsfreie Identifizierung der Primärstruktur durch überlappende Sequenzen ermöglichte
Einfluss von der membranproximalen Domäne und Teilen der stalk-Region auf die Metalloprotease ADAM17
Full text linkDie Ektodomänen-Proteolyse, kurz shedding, ist eine posttranslationale Modifikation und ermöglicht die irreversible Überführung von membrangebundenen Proteinen in ihre lösliche Form. A-Disintegrin-And-Metalloproteinase-17, kurz ADAM17, ist eine sheddase mit über 70 bekannten Substraten. Durch ihre Einbindung in Wachstums- und Entzündungsprozesse, ist das Verständnis von Funktions- und Regulationsmechanismen ADAM17s von großem wissenschaftlichen Interesse.
Aus vorangegangenen Arbeiten war bekannt, dass die membranproximale Domäne (MPD) sowie eine hoch konservierte, ADAM17 spezifische Sequenz in der stalk-Region, genannt CANDIS (Conserved-ADAM-SeventeeN-Dynamic-Interaction-Sequence), an Substraterkennung, Multimerisierung sowie Regulation der shedding-Aktivität von ADAM17 beteiligt sind.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmalig anhand von Volllängen-ADAM17-Konstrukten gezeigt werden, dass die MPD ausschlaggebend für die Multimerisierung von ADAM17 ist. Der CANDIS konnte ein geringerer Effekt zugeschrieben werden. Ebenfalls wurde die Substratbindung des IL6Rs an ADAM17 mit Hilfe von Volllängen-ADAM17-Konstrukten untersucht. Gegenüber der Multimerisierung zeigte sich hier besonders für die CANDIS eine ausschlaggebende Funktion. Letztlich wurde mit stabil ADAM17-transfizierten Zellen der Einfluss von MPD und CANDIS auf das TNFα- und IL1RII-shedding untersucht. Dabei konnte ein Einfluss der MPD und der CANDIS auf das shedding dieser Typ-I- und Typ-II-Transmembranproteine bestätigt werden.
Neben den funktionellen Analysen der MPD und der CANDIS wurde erstmalig eine Interaktion des Lektins Galektin9 mit dem Chaperon Glukose-Reguliertes-Protein-78 (GRP78) gezeigt. Des Weiteren konnten erste Hinweise auf eine Interaktion des GRP78 mit der Protein-Disulfid-Isomerase-A6 (PDIA6) erbracht werden. Letztere ist als Inaktivator des zellmembranständigen ADAM17s bekannt. So geben die Erkenntnisse dieser Arbeit erste Hinweise auf einen möglichen Transport der PDIA6 an die Zelloberfläche, wo diese mit ADAM17 interagieren kann
Development and Application of Mass Spectrometry-based Methods for the Analysis of Protease-catalyzed Reactions
Full text linkProteasen übernehmen als hydrolytische Enzyme zentrale Funktionen in den verschiedensten physiologischen sowie pathologischen Prozessen und sind deshalb von sehr großem Interesse für die Entwicklung neuer Krankheitstherapien. Zur Analyse proteasekatalysierter Reaktionen gewann die Massenspektrometrie in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wurden auf dieser Technologie basierende Methoden entwickelt und auf drei verschiedene Fragestellungen angewendet: (i) Bestimmung der Spaltspezifität von ADAM10 und ADAM17, (ii) Zeitaufgelöste Analyse proteasekatalysierter Reaktionen mittels LC-MS und (iii) Identifizierung von Meprin-alpha/-beta Spaltstellen in Interleukin-6.Proteases are key mediators in a variety of physiological and pathological processes. For this reason the hydrolytic enzymes present as an interesting target for the development of novel drugs. Mass spectrometry-based methods became increasingly important for the analysis of protease-catalyzed reactions within the last years. The present work focuses on the development and application of mass spectrometry-based strategies with regard to three different projects: (i) deciphering the cleavage site specificities of ADAM10 and ADAM17, (ii) time-dependent monitoring of protease-catalyzed reactions by LC-MS and (iii) identification of meprin-alpha/-beta cleavage sites in interleukin-6
Struktur-Funktions-Beziehung der ADAM17 Prodomäne
Full text linkFür die Mutante ADAM17 Prodomäne konnte ein erfolgreiches Expressionssystem und ein adäquater Reinigungsprozess etabliert werden. Verschiedenste strukturelle Untersuchungen wurden durchgeführt. Außerdem konnte eine deutlich inhibierende Wirkung auf ADAM17 bereits in geringen Konzentrationen nachgewiesen werden. Lediglich die fehlende Langzeitstabilität steht zurzeit noch weiteren strukturellen und funktionellen Untersuchungen im Wege.
In Zusammenschau mit dem Erfolg dieser Arbeit und der parallel vorliegenden, fortgeschrittenen Arbeit zur Prodomäne von ADAM10 lässt sich vermutlich in Zukunft eine Langzeitstabilität des Proteins herstellen. Dies würde weitere Untersuchungen zur Struktur (z.B. NMR-Spektroskopie) und zur Funktion der ADAM17 Prodomäne nicht nur in vitro, sondern darauf basierend schließlich auch in cellulo und in vivo ermöglichen, welche den Umfang der vorliegenden Arbeit jedoch deutlich überschreiten.
Das in dieser Arbeit erfolgreich etablierte Expressions- und Reinigungsverfahren der Mutante ADAM17 Prodomäne, die hier beschriebenen und weitere strukturelle Untersuchungen, die in dieser Arbeit in vitro bereits nachgewiesene und – nach Lösung des Langzeitstabilitätsproblems – in cellulo und letztlich in vivo zu überprüfende inhibierende Wirkung auf ADAM17 könnten, in Anbetracht der Substratvielfalt und der Rolle von ADAM17 in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, in Zukunft sogar Grundlage für eine (prä-)klinische Bedeutung der ADAM17 Prodomäne sein
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
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