1,720,968 research outputs found
Broadband CARS in the fingerprint region at high speed through white-light generation in bulk media
No full textWe demonstrate high-speed broadband CARS microscopy in the fingerprint region generating supercontinuum in a YAG crystal with 2-MHz laser pulses. The system delivers high-quality images of synthetic and biological samples through a novel post-processing pipelin
Multimodal nonlinear optical microscope
No full textLAUREA MAGISTRALELa microscopia ottica non lineare (NLOM) comprende una classe di tecniche di imaging non invasive, senza marker esterni e non distruttive che si stanno sviluppando rapidamente negli ultimi decenni. Rispetto alle tecniche di microscopia lineare, NLOM offre grandi vantaggi grazie all'uso di radiazione a bassa energia (spettro NIR) rispetto allo standard (VIS-UV), come una migliore profondità di penetrazione, ridotto danno da radiazione e la capacità di sezionamento ottico intrinseca. Offre una migliore risoluzione rispetto a tecniche come la risonanza magnetica (MRI) e non richiede sostanze esterne che vengono utilizzate, ad esempio, nella microscopia a fluorescenza. Le tecniche di Raman Scattering coerente (CRS) (che rappresentano una classe di effetti ottici non lineari di terzo ordine) danno la possibilità di avere specificità chimica quando si analizza un campione biologico, infatti, comprende una classe di tecniche in grado di identificare i componenti chimici. Queste informazioni possono essere trovate nello spettro vibrazionale delle molecole. Per utilizare tecniche CRS si ha bisogno di due o più laser e, accordando la differenza di frequenze dei laser per uguagliare il modo vibrazionale di interesse è possibile eseguire la scansione di questo spettro. Altre tecniche di imaging come la microscopia a generazione di seconda armonica (SHG) forniscono informazioni sui componenti non centrosimmetrici, come le strutture fibrillari e collagene, offrendo altre informazioni sul campione biologico. Per questi motivi, NLOM rappresenta il futuro in termini di uno strumento medico per la diagnosi e gli studi biologici in generale.
Questa tesi mira a introdurre un microscopio NLO multimodale in grado di acquisire immagini con diverse tecniche quali Coherent Anti-Stokes Raman Scatting (CARS), Stimulated Raman Scattering (SRS), Two Photons Eccitatation Fluorescence (TPEF), Second Harmonic Generation (SHG) e la modalità in trasmissione per fornire un ampio spettro di informazioni sui campioni biologici.
L'obiettivo finale del progetto sarà quello di produrre immagini e dati di alta qualità, che consentiranno un'ulteriore analisi di campioni biologici di interesse con lo scopo finale di raccogliere anche informazioni quantitative (che non sono state raccolte in questa tesi).Nonlinear Optical (NLO) Microscopy (NLOM) comprehends a class of non-invasive, label-free, and non-destructive imaging techniques which are developing fast in the last decades. Compared to linear microscopy techniques NLOM offers great advantages due to the use of lower energy light (NIR spectrum) with respect to the standard (VIS-UV), like better penetration depth and reduced photo-damage, it also have inherent optical sectioning capability. It offers better resolution with respect to techniques such as Magnetic Resonance Imaging (MRI) and it doesn't require external substances which are used, for example, in fluorescence microscopy. Coherent Raman Scattering (CRS) techniques (that represent a class of third-order nonlinear optical effects) give the possibility to have chemical specificity when analyzing a biological sample, in fact, it comprehends a class of techniques that can identify chemical components. This information can be found in the vibrational spectrum of the molecules. CRS needs two or more lasers to be performed, and by tuning the laser frequencies difference to match the vibrational modes of interest it is possible to scan this vibrational spectrum. Other imaging techniques such as Second Harmonic Generation (SHG) Microscopy give information about the non-centrosymmetric components, such as collagen and fibrillar structures, offering other information about the biological sample. For these reasons, NLOM represents the future in terms of a medical tool for diagnosis and biological studies in general.
This thesis aims to introduce a multi-modal NLO Microscope that can perform imaging with different techniques such as Coherent Anti-Stokes Raman Scatting (CARS), Stimulated Raman Scattering (SRS), Two Photons Excitation Fluorescence (TPEF), Second Harmonic Generation (SHG), and Transmission mode to give an ample spectrum of information about biological samples.
The final aim of the project will be to produce images and data of high quality, that will allow further analysis of biological samples of interest with the final aim to collect quantitative information (which were not collected in this thesis)
A multimodal nonlinear optical microscope for biological applications
Get PDFLAUREA MAGISTRALELa necessità di strumenti diagnostici sempre più affidabili e efficienti ha innescato una rinascita nello sviluppo della strumentazione per microscopia ottica. I microscopi convenzionali, basati su tecniche ottiche lineari, presentano una serie disvantaggi: alta energia e bassa profondità di penetrazione della luce UV e VIS utilizzate e imaging a bassa risoluzione a causa dei processi lineari coinvolti.
Queste limitazioni possono essere superate con sistemi di imaging basati su processi ottici non lineari, che impiegano la luce nella gamma spettrale NIR.
Questo lavoro di tesi mira a introdurre un microscopio ottico home-made, multimodale e non lineare, che consente di eseguire microscopia a dispersione Raman anti-Stokes Coerente e microscopia a fluorescenza da eccitazione a due fotoni.
Dato l'obiettivo finale di impiegare questo strumento nel campo dell'indagine biologica, un requisito necessario è quello di essere in grado di visualizzare ampie aree di campione. Nella versione precedente del sistema presentato, era disponibile la sola modalità di imaging basata sulla scansione laser, la quale è caratterizzata da campo visivo (250x250 μm2) limitato essenzialmente dall'obiettivo. Per questo motivo, durante questo lavoro di tesi, si è prestata particolare attenzione all'implementazione dell'hardware, ovvero del supporto motorizzato XY su cui viene disposto il campione, e allo sviluppo del relativo software al fine di aver a disposizione anche una modalità di imaging a laser fisso. Inoltre, quest'ultima modalità consente di testare rapidamente la reale capacità di imaging di nuove tipologie di fenomeno sfruttate. Infatti, nella modalità di imaging basata sulla scansione laser, che impiega specchi galvanometrici, è necessario un perfetto allineamento di tutte le ottiche su tutte le possibili posizioni del fascio per evitare la vignettatura. Invece, grazie alla nuova modalità implementata, il sistema ottico richiede di essere allineato solo ad una posizione fissa del fascio laser.
Saranno quindi presentati risultati sperimentali su campioni di prova (poli-metilmetacrilato, polistirene e sfere fluorescenti) e campioni biologici, che mostrano l'enorme potenziale di questo tipo di sistema.The need for better diagnostic tools has triggered a renaissance in optical microscopy instrumentation development. Conventional light microscopes, based on linear techniques, have a series of drawbacks: high energy and low penetration depth of UV and VIS light used and low resolution imaging due to the linear processes involved.
These limitations can be overcome building imaging systems based on nonlinear optical processes, that employ light in the NIR spectral range.
This thesis work aims at introducing a home-made Multimodal Nonlinear Optical Microscope, which allows one to perform Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopy and Two-Photon Excitation Fluorescence (TPEF) microscopy.
Given the final goal of employing this setup in the field of biological investigation, a very important requirement is to be able to visualize large sample areas. In the previous version of the presented system, a laser-scanning based imaging modality was available, with a Field Of View (250x250 μm2) limited essentially by the Objective. For this reason, in this thesis work particular attention is given to the implementation of the hardware, i.e. a XY motorized sample stage, and to the development of the software in order to perform also sample-scanning imaging modality. Moreover, the latter enables to test quickly the real imaging capability of the new kind of phenomenon exploited. Indeed, in the laser-scanning based imaging modality, which employs galvanometric mirrors, a perfect alignment of all the optics over all the possible beam position is required to avoid vignetting. Instead, with a XY motorized sample stage the optical system needs to be aligned only to a fixed laser beam position.
Experimental results on test samples (Poly-methyl methacrylate, Polystyrene and fluorescent beads) and biological samples, obtained with sample-scanning based imaging, will be then presented, showing the huge potential of this kind of system
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Study of cell photodamage induced by femtosecond laser pulse irradiation
No full textLAUREA MAGISTRALEL'avvento dell'ottica non lineare e le sue applicazioni nella microscopia hanno aperto nuove prospettive nei campi della biologia, medicina, chimica e fisica. Le tecniche di Nonlinear Optical Microscopy (NLOM) hanno mostrato particolare promessa nelle applicazioni biologiche e mediche, poichè consentono ai ricercatori di ottenere diversi tipi di informazione da campioni biologici.
Per ottenere un rapporto segnale-rumore (SNR) alto, che è necessario per ottenere immagini ad alta risoluzione e velocemente, è in genere necessario aumentare la potenza del laser di pompa. Queste tecniche forniscono grandi possibilità per le applicazioni in-vivo, ma per poter fare progressi in questa direzione è imperativo arrivare a comprendere a fondo i possibili effetti negativi che l'esposizione a un laser a impulsi, specialmente alle alte intensità richieste dalle applicazioni non lineari, può avere sul materiale biologico. Questi effetti sono stati relativamente trascurati in passato perchè erano di minore rilevanza nelle applicazioni di microscopia tradizionale, in cui venivano usate intensità più basse e impulsi più lunghi.
Lo scopo di questa tesi di ricerca è presentare i risultati del nostro studio sul danneggiamento di cellule HeLa indotto dall'esposizione ad impulsi laser a femtosecondi. Abbiamo studiato due tipi di danneggiamento: la morte cellulare, sia immediata che ritardata, e l'alterazione del ciclo riproduttivo. Esistono diversi meccanismi attraverso i quali il fotodanneggiamento cellulare può essere inflitto; noi abbiamo riservato particolare attenzione al danneggiamento fototermico.
Questo progetto di tesi fa parte del lavoro del gruppo di ricerca VIBRA, che mira a sviluppare tecniche broadband ad alta velocità di Raman Scattering Coerente.The advent of nonlinear optics and its application in microscopy has opened new perspectives in the fields of biology, medicine, chemistry and physics. Nonlinear optical microscopy (NLOM) techniques have shown particular promise in medical and biological applications, because they enable researchers to obtain different types of information from biological samples.
To achieve the high signal-to noise ratio (SNR) required for high-speed and high-resolution imaging, it is usually necessary to increase the power of the pumping laser. A lot of the potential of these techniques lies in the possibility of in-vivo applications, but to follow this road it's imperative to develop a comprehensive understanding of the possible negative effects that laser exposure, especially at the high intensities required for nonlinear applications, can have on biological samples. These effects were often neglected in the past because they weren't as relevant in traditional microscopy techniques, which often employed lower intensities and longer laser pulses. However, they are certainly relevant now.
The aim of this research thesis is to present our findings on the damage of HeLa cells induced by the exposure - either scanned or fixed - to femtosecond laser pulses. Two types of cell damage were studied: cell death, both immediate and delayed, and impaired cell reproduction. There are different mechanisms through which cell photodamage can occur; we reserved particular attention to the topic of photothermal damage.
This thesis project is part of the work of the VIBRA research group, which aims to to develop broadband high-speed Coherent Raman Scattering (CR) techniques
Multimodal nonlinear optical microscopy for biological applications
No full textDOTTORATOFin dalla sua invenzione, gli scienziati hanno utilizzato il microscopio per indagare le meraviglie della natura e della biologia, rivelando dettagli che altrimenti sarebbero invisibili ad occhio nudo. I microscopi sono diventati strumenti sempre più sofisticati e complessi grazie ai progressi dell'ottica e della fotonica, e l'introduzione dell'illuminazione laser ha cambiato radicalmente il concetto di microscopia, spostandolo dalla semplice osservazione morfologica al riconoscimento delle strutture chimiche. Il potenziale eccezionale della microscopia ottica non lineare come tecnologia rapida, senza bisogno di marcatori, altamente specifica e ad alta risoluzione, così come i suoi benefici rispetto i metodi standard, sono stati ampiamente dimostrati. Inoltre, le varie modalità non lineari di microscopia possono essere combinate in un singolo microscopio per sfruttare a pieno la capacità delle informazioni che le immagini multimodali possono dare. In questa tesi, dopo il capitolo introduttivo e il capitolo sui fondamenti teorici, vengono presentati tre lavori sperimentali che ho condotto durante il mio dottorato. Questi tre lavori esplorano diversi aspetti della microscopia ottica non lineare, prestando particolare attenzione alle applicazioni biologiche. A ciascuno di essi è dedicato un capitolo. In primo luogo, ho concentrato la mia attività di ricerca sui meccanismi di fotodanneggiamento: dato l'uso crescente dei laser pulsati nelle applicazioni di biofotonica, è cruciale assicurarsi che il campione non venga danneggiato dal laser mentre viene osservato. Quindi, ho studiato la risposta delle cellule tumorali alla luce laser ultracorta nel vicino infrarosso. Ho misurato il tasso di sopravvivenza delle cellule HeLa in funzione della potenza del laser, della velocità di scansione e del tempo di esposizione, irradiandole con impulsi di 130-fs a 1040 nm di lunghezza d'onda e 80 MHz di frequenza di ripetizione in due configurazioni di illuminazione distinte. Per fornire informazioni rilevanti sulle circostanze di lavoro sicure a molti ricercatori che pianificano esperimenti che richiedono l'illuminazione laser, i risultati degli esperimenti sono stati esaminati utilizzando un metodo data-driven e quindi confermati con considerazioni termodinamiche. Poi, ho sviluppato e ottimizzato un microscopio ottico multimodale non lineare in grado di acquisire immagini in cinque diverse modalità: bright-field, fluorescenza a due fotoni, generazione di seconda armonica, coherent anti-Stokes Raman scattering e stimulated Raman scattering. Utilizzando questa tecnologia, ho condotto uno studio su campioni di sezioni di colonna vertebrale murina forniti da Humanitas-Clinical and Research Centre, per indagare il ruolo dell'enzima dipeptidil peptidase 3 (DPP3) nelle patologie ossee e nel mantenimento dell'omeostasi ossea. Facendo uso del nostro microscopio multimodale, dopo l'evidenziazione di discrepanze fra campioni sani e campioni con soppressione di DPP3, sono stati rivelati cambiamenti biologici rilevanti che non erano emersi facendo uso dei metodi standard. Grazie alle loro qualità di non necessitare di marcatori, di essere chimicamente selettive e non invasive, le tecniche di microscopia ottica non lineare hanno dimostrato di essere valide e di successo nello studio delle malattie ossee, nonché uno strumento prezioso per la ricerca biologica. Infine, ho approfondito il problema delle aberrazioni applicando l'ottica adattiva sensorless alla microscopia non lineare. Le variazioni dell'indice di rifrazione del campione sotto osservazione introducono aberrazioni ottiche che degradano la qualità dell'immagine prodotta. È essenziale che il centro di massa della point spread function del sistema rimanga invariato durante la correzione, e perché ciò avvenga, la base utilizzata per la correzione deve avere la proprietà di essere gradiente ortogonale. Mentre è stato dimostrato che la base dei polinomi di Lukosz possiede questa caratteristica per i processi lineari, non è stata dimostrata alcuna base conosciuta per i processi multiphotonici. Per risolvere questo problema, ho proposto un approccio sperimentale per la determinazione delle basi di aberrazione shift-less per le applicazioni di microscopia non lineare, convalidandolo facendo immagini in vivo di cervello di topo.Since its conception, scientists have utilized the microscope to investigate the marvels of nature and biology, revealing details that would otherwise be invisible to the naked eye. Microscopes have become increasingly sophisticated and complex instruments as a result of advances in optics and photonics, and the introduction of laser illumination has fundamentally changed the concept of microscopy, shifting it from simple morphological observation to the recognition of chemical structures. The exceptional potential of nonlinear optical microscopy as a quick, label-free, highly specific, and high-resolution technology, as well as its benefits over standard methods, has been shown. In addition, various nonlinear microscopy modes may be combined in a single microscope to fully use the information capacity that multimodal pictures can give. In this thesis, after the introductory chapter and the chapter on theoretical foundations, three experimental works that I conducted during my Ph.D. are presented. These three works explore different facets of the field of nonlinear optical microscopy, giving attention to biological applications. A chapter is dedicated to each of them. First of all, I focused my research on photodamage mechanisms: given the rising usage of pulsed lasers in biophotonics applications, it is critical to ensure that the sample is not damaged by the laser while being observed. So, I studied the response of tumor cells to near-infrared ultrashort pulsed laser light. I measured the survival rate of HeLa cells as a function of laser power, scanning speed, and exposure period, irradiating them with 130-fs pulses at 1040 nm wavelength and 80 MHz repetition rate in two distinct illumination settings. To give relevant insights into safe working circumstances to many researchers planning experiments requiring laser illumination, the outcomes of the experiments were examined using a data-driven method and then confirmed with thermodynamic considerations. Then, I developed and optimized a multimodal nonlinear optical microscope able to acquire images in five different modalities: bright-field, two-photon excitation fluorescence, second harmonic generation, coherent anti-Stokes Raman scattering and stimulated Raman scattering. Using this technology, I conducted a study on murine spine section samples provided by Humanitas-Clinical and Research Centre, to investigate the role of the enzyme dipeptidyl peptidase 3 (DPP3) in bone pathology as well as the maintenance of bone homeostasis. Relevant biological changes were revealed using our multimodal microscope after highlighting discrepancies between healthy wild-type samples and DPP3 knock-out samples that had not been disclosed using standard approaches. Because of their label-free, chemically selective, and non-invasive qualities, nonlinear optical microscopy techniques have proven to be legitimate and successful in the investigation of bone diseases, as well as a valuable tool for biological research. Finally, I delved into the problem of aberrations applying sensorless adaptive optics to nonlinear microscopy. Variations in the refractive index of the sample under observation introduce optical aberrations, which degrade the quality of the image produced. It is essential that the center of mass of the system point diffusion function remains unchanged during correction, and for this to happen, the base used for correction must have the orthogonal gradient property. While it has been shown that the Lukosz Polynomials base possesses this characteristic for linear processes, no known basis has been shown to be so for multiphotonic processes. To solve this issue, I proposed an experimental approach for determining shift-less aberration bases for nonlinear microscopy applications, validating it by making in vivo images of mouse brain.DIPARTIMENTO DI FISICA34CERULLO, GIULIOFINAZZI, MARC
Biological damage induced in living cells by focused ultrashort laser pulses
No full textLAUREA MAGISTRALEL'avvento dell'ottica non lineare e la sua applicazione in microscopia ha aperto nuove strade nei campi della biologia, medicina, chimica e fisica. Tutto ciò è reso possibile dall'utilizzo di sorgenti laser impulsate. Grande interesse desta anche la possibilità di fare misure e imaging su cellule e tessuti biologici in vivo, e per questo motivo la velocità diventa un fattore determinante. Per rendere fruibile tale tecnologia e produrre immagini a video rate è necessario avere un rapporto segnale/rumore (SNR) molto alto. Questa condizione è ottenibile aumentando la potenza del laser di pompa, ma bisogna prestare molta attenzione a non danneggiare il campione che si sta esaminando. Quando si utilizzano campioni biologici, è possibile fare microscopia Raman coerente (Stimulated Raman Scattering, SRS, e Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, CARS) utilizzando impulsi laser nell'infrarosso che non vengono assorbite dalle cellule.
L'assorbimento lineare non è l'unico fattore di danneggiamento in cui si può incorrere utilizzando sorgenti laser impulsate, e nella ricerca del miglior SNR possibile, si rischia di generare altri fenomeni, quali assorbimento multifotonico ed effetti termici e chimici. che possono compromettere il risultato della misura.
In questo progetto di tesi è stato condotto uno studio del danneggiamento indotto su campioni cellulari esposti ad una sorgente laser impulsata infrarossa. Come punto di partenza si è scelto di utilizzare una sorgente di lunghezza d'onda 1040nm perchè questo progetto rientra nel lavoro di un gruppo di ricerca in cui si sta lavorando per realizzare microscopia Raman SRS utilizzando un laser di pompa a 1000nm di lunghezza d'onda e un laser a banda larga nell'infrarosso per il laser Stokes. Come linea cellulare sono state utilizzate cellule HeLa e le misure sono state svolte variando in modo sistematico la potenza del laser, la larghezza dell'impulso e la velocità di scansione.
Siamo stati così in grado di definire la soglia di danneggiamento in uno spazio a tre variabili stimando che con queste lunghezze d'onda il danneggiamento avvenga per processi multifotonici.The advent of nonlinear optics and its application in microscopy has opened new perspectives in the fields of biology, medicine, chemistry and physics. For example, this technique enables us to see cell details never seen before, or Raman technique, spontaneous and coherent, allows us to distinguish chemical components of matter from its spectrum. All these achievements are possible thanks to pulsed laser sources. Particularly interesting is the possibility of doing in vivo measurements and imaging on biological cells and in this case speed is the key factor. It is necessary to have a very high signal-to-noise ratio (SNR) in order to make this technology accesible produce images at video rate. A high signal-to-noise ratio can be obtained by increasing the power of the pumping laser, but care must be taken not to damage the sample being examined. With biological samples, coherent Raman microscopy (Stimulated Raman Scattering, SRS, and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, CARS) can be performed using IR laser pulses that are not absorbed by the cells.
Linear absorption is not the only damaging factor in which one can incur using pulsed laser sources, and while looking for best possible signal-to-noise ratio, other phenomena can be generated, i.e. multiphoton absorption and thermal and chemical effects, that damage the sample and compromise the result of measurements.
During this thesis project a study was carried out about the damage induced by an infrared pulsed laser source on cellular samples. As starting point, we decided to use a laser source at 1040nm because this project is part of the work of a research group, in which the aim is to realize Raman SRS microscopy using a pump laser at wavelength and a broadband laser in the infrared for the Stokes laser. Among the various cell lines, we choose HeLa cells and the measurements were carried out by systematically varying the laser power, the pulse width and the scanning speed. In this way, we succeded in defining the damage threshold in a 3-variables space and in assessing that damage is mainly caused by multiphotonic processes
Variations on the Author
Get PDF“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Get PDFWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
- …
