1,721,041 research outputs found
Genomewide functional analysis of p53-binding sites via ChIP-seq
No full textDer Transkriptionsfaktor p53 ist einer der wichtigsten humanen Tumorsuppresso- ren und reguliert die Expression von Genen insbesondere im Bereich von Apoptose, DNA-Reparatur, sowie Zellzyklusarrest. Häufig wird p53 daher auch als ”Wächter des Genoms“ bezeichnet. Die zentrale Rolle von p53 in der Verhinderung der Tumorentstehung wird daran deutlich, dass es in etwa der Hälfte aller menschlichen Tumoren mutiert vorliegt. Besonders häufig finden sich diese Mutationen im Bereich der zentralen DNA-Bindungsdomäne. In erster Linie führt die Aktivierung von p53 durch zellulären Stress, wie etwa Hypoxie, DNA-Schädigung oder Onkogenaktivierung, abhängig von Ausmaß und Dauer der Schädigung oder des Reizes zu Zellzyklusarrest und DNA-Reparatur oder aber zum Tod der Zelle durch Apoptose. Wie p53 jedoch im Einzelnen diese Entscheidung trifft und unterschiedliche Gruppen von Zielgenen aktiviert, ist unklar. Die Daten der vorliegenden Arbeit belegen, dass der DNA-Bindungskooperativität von p53 bei diesen Prozessen eine entscheidende Rolle zukommt.
In dieser Arbeit wurde mithilfe der ChIPseq-Methodik die DNA-Bindung von p53 genomweit untersucht. Erstmalig wurden neben p53-Wildtyp weitere p53-Mutanten unterschiedlicher DNA-Bindungskooperativität hinsichtlich der Eigenschaften ihrer Bindungsstellen und der Zielgenselektion miteinander verglichen. Dabei lag ein besonderes Augenmerk der funktionellen Analyse auf apoptotischen Zielgenen, sowie Genen aus den Bereichen Zellzyklusarrest und DNA-Reparatur. Die Daten dieser Arbeit belegen, dass für die Bindung und Aktivierung apoptotischer Zielgene eine vergleichsweise hohe DNA-Bindungskooperativität notwendig ist, während Gene aus den Bereichen Zellzyklusarrest und DNA-Reparatur häufig auch von deutlich schwächer kooperativem p53 gebunden und aktiviert werden. Eine eingesetzte p53-Mutante mit sehr stark eingeschränkter Kooperativität zeigte im Wesentlichen keine Bindung und
Zielgenaktivierung. In Zeiten der ”targeted therapy“ ist ein Protein, das bei fast allen Krebspatienten in
seiner Funktion beeinträchtigt ist, ein vielversprechender Kandidat zukünftiger Krebstherapien. Berücksichtigt man die Häufigkeit der kooperativitätsbeeinträchtigenden Mutationen der p53-DNA-Bindungsdomäne, ist die Wiederherstellung der Kooperativität von p53 ein lohnender Ansatzpunkt. Die vorliegende Arbeit kann somit zu einem besseren Verständnis der Bedeutung und Auswirkung der DNA-Bindungkooperativität von p53 und deren therapeutischen Anwendung beitragen.The transcription factor p53 is one of the most important human tumor suppressors and regulates expression of genes especially in the fields of apoptosis, DNA-repair and cell cycle arrest. Therefore it is regularly described as ”guardian of the genome“. Its central role in suppression of tumor development becomes apparent considering the fact that it is mutated in about half of all human tumors. Very often those mutations lie in the region of the central DNA binding domain. First of all activation of p53 by cellular stress, e.g. hypoxia, DNA-damage or activation of oncogenes, leads (depending on the extent and duration of damage or stimulus) to either cell cycle arrest and DNA-repair or the destruction of the cell by apoptosis. How p53 makes this decision in detail and activates different sets of target genes, is unclear though. The data of this thesis prove that DNA binding cooperativity plays a vital role in these processes.
In this thesis genomwide DNA-binding of p53 was examined via the ChIPseq method. For the first time p53-wildtype and p53-mutants with variable DNA-binding cooperativity were compared concerning the properties of their binding sites and target gene selection. For the functional analysis a particular focus was on apoptotic genes and genes from the fields of cell cycle arrest and DNA-repair. The data in this thesis prove that a rather high DNA-binding cooperativity is necessary for binding and activation of apoptotic target genes, whereas cell cycle arrest- and DNA-repair genes are often bound and activated even by less cooperative p53. One p53-mutant with excessively impaired DNA-binding cooperativity did not show significant binding and activation of gene expression.
In times of ”targeted therapy“ a protein that is impaired in its function in about half of all cancer patients is a promising candidate for future cancer therapies. Considering the frequency of mutations in the DNA-binding domain of p53, restoration of p53- cooperativity is a promising target. This thesis can therefore make a contribution to understanding the importance and consequences of DNA-binding cooperativity and to their therapeutical application
Decoding the TP53 mutome: CRISPR perspectives on functional diversity and therapeutic interventions
No full textThe key transcription factor p53 plays a crucial role in executing diverse tumor suppressive functions in human cells, as evidenced by the high prevalence of mutations in its encoding gene, TP53, across various cancer entities. Remarkably, TP53 mutations predominantly manifest as missense mutations, exhibiting an unparalleled diversity with over 2,000 distinct mutations identified in cancer patients. Notably, about 70% of these mutations remain poorly characterized, highlighting the need for comprehensive understanding to incorporate p53 status into clinical evaluation.
This dissertation focuses on the detailed characterization of more than 94% of reported cancer-associated mutations within the TP53 gene. Employing CRISPR-mediated mutagenesis at the endogenous TP53 locus in cancer cells, we conducted investigations in a highly physiological context. Our research elucidates the functional implications of numerous mutations, previously of uncertain significance, unveiling factors such as moderate thermodynamic destabilization, loss of specific functions, and splicing defects. This knowledge was further implemented into an interactive database, encompassing all
existing analyses on TP53 mutations. This resource facilitates data recapitulation, diverse visualizations, and predictive insights into the tumorigenic potential and therapy response of variants. Exploring clinical targeting of p53, we utilized Designed Ankyrin Repeat Proteins to restore p53 transcriptional activity, exemplified in Human Papilloma Virus-infected cancer cell lines. To incorporate the importance of the tumor microenvironment, we established a highly physiological genetically engineered mouse model for small-cell lung cancer. Therefore, we leveraged adenoviruses for CRISPR-mediated knockout of Trp53 and other cancer-associated genes, resulting in a rapid, flexible, and efficient method for generating cancer mouse models. Moreover, incorporating in vivo labeling with Gaussia princeps luciferase enabled longitudinal and animal-friendly monitoring of tumor development.
In conclusion, this dissertation presents a comprehensive annotation of the TP53 mutome, offering valuable insights into its diverse landscape and clinical implications,
including genetic risk assessment and therapeutic strategies. Additionally, it introduces an advanced method for generating genetically induced cancer mouse models, paving the way for further investigations into the influence of the TP53 mutome on the tumor microenvironment.Der zentrale Transkriptionsfaktor p53 spielt eine entscheidende Rolle bei der Ausübung
verschiedener tumorsuppressiver Funktionen in menschlichen Zellen, was durch die
hohe Prävalenz von Mutationen in seinem kodierenden Gen, TP53, bei verschiedenen
Krebsarten belegt wird. Bemerkenswerterweise manifestieren sich Veränderungen in
TP53 überwiegend als missense Mutationen und weisen mit über 2.000 verschiedenen,
in Krebspatienten beschriebenen Mutationen, eine unvergleichliche Vielfalt auf. Etwa
70 % dieser Mutationen sind nach wie vor unzureichend charakterisiert, was die
Notwendigkeit eines umfassenden Verständnisses für das TP53 Mutom unterstreicht,
um den p53-Status in die klinische Bewertung einbeziehen zu können.
Diese Dissertation fokussiert sich auf die Charakterisierung von mehr als 94 % der
bekannten krebsassoziierten Mutationen innerhalb des TP53 Gens. Mit Hilfe der
CRISPR-vermittelten Mutagenese des endogenen TP53-Lokus in Krebszellen wurden
Untersuchungen in einem physiologischen Kontext durchgeführt. Dadurch konnten die
funktionellen Auswirkungen zahlreicher Mutationen annotiert werden, deren Bedeutung
zuvor unklar war. Weiterhin konnte der Mechanismus des Funktionsverlustes durch
Faktoren wie eine moderate thermodynamische Destabilisierung, den Verlust
spezifischer Funktionen und Spleißdefekte aufgeklärt werden. Dieses Wissen wurde in
eine interaktive Datenbank implementiert, die alle bisher existierenden Analysen zu
TP53-Mutationen umfasst und so die Rekapitulation von Daten, vielfältige
Visualisierungen und die Vorhersage über die Tumorigenität und das
Therapieansprechen erleichtert. Bei der Erforschung von Therapieoptionen bei p53-
Veränderungen haben wir Designed Ankyrin Repeat Proteine am Beispiel von mit dem
Humanen Papillomavirus infizierten Krebszelllinien eingesetzt, um die
Transkriptionsaktivität von p53 wiederherzustellen.
Um die Bedeutung der Tumormikroumgebung zu berücksichtigen, haben wir ein
physiologisches, genetisch verändertes Mausmodell für kleinzelligen Lungenkrebs
generiert. Dazu haben wir Adenoviren zum CRISPR-vermittelten Knockout von Trp53
und anderen krebsassoziierten Genen genutzt, und damit eine schnelle, flexible und
effiziente Methode zur Erzeugung von Krebsmausmodellen entwickelt. Weiterhin
ermöglichte die in vivo Markierung mit Gaussia princeps Luciferase eine longitudinale
und tierfreundliche Überwachung der Tumorentwicklung.
Zusammenfassend wird in dieser Dissertation eine umfassende Annotation des TP53-
Mutoms gezeigt, welche wertvolle Einblicke in die Vielfältigkeit und mögliche klinische
Anwendung bietet. Darüber hinaus wird eine fortschrittliche Methode zur Erzeugung
genetisch veränderter Krebsmausmodelle vorgestellt, die den Weg für weitere
Untersuchungen zum Einfluss des TP53-Mutoms auf die Tumormikroumgebung ebnet
Präklinische Mausmodelle zur Untersuchung tumorrelevanter Faktoren der p53 Protein Familie
No full textCancer development is a multistep process which leads to tumors composed of diverse cell populations originating from one cell which underwent differential genetic changes over time. Within one tumor, such heterogeneity provides distinct subpopulations with selection advantages promoting metastasis as well as therapy resistance. In the course of targeted cancer therapies tumor composition is meanwhile monitored via circulating tumor DNA from blood samples during treatment and accordingly allows adjustment of therapy. In experimental models of solid tumor xenografts in mice, however, this method is not applicable as required blood volumes exceed blood volume of animals, hence limiting investigation of tumorrelevant genes in preclinical mouse models.
Here, a method was developed which facilitates simultaneous monitoring of growth dynamics of two distinct tumor cell populations within one tumor xenograft. Therefore, cells were labelled by stable expression of either Gaussia luciferase (GLuc) or Cypridina luciferase (CLuc) prior to injection. Both luciferases are secreted into the blood stream of transplanted mice. This allows asessment of tumor composition by enzyme activity of both luciferases requiring only very low blood volumes. Moreover, to facilitate investigation of the impact of targeted genetic manipulations luciferases were linked with (non)-targeting shRNAs. To establish this method, shRNAs were used targeting the p53 familiy members p53 and p73. Whereas p53 is acknowledged as the most important tumor suppressor, p73 can occur in two N-terminally different isoforms with opposing attributes: the tumorsuppressive full length isoform TAp73 and the N-terminally truncated tumorpromoting isoform Np73. The dominant negative function of Np73 includes its ability to form hetero-oligomers with its family members p53 and TAp73, thereby interfering with their transcriptional activity. Linking the luciferases to (non)-targeting shRNAs, the differential growth properties of transplanted cells in presence and absence of p53 (or p73) can be monitored simultaneously. The here established method was successfully validated in a model of experimental metastasis as well as under therapeutic conditions.
Moreover, it could be demonstrated that the growth behaviour of p73-high-expressing cells Hs 766T is highly dependent on the relative abundance of both N-terminal isoforms. The shRNA-mediated reduction of both isoforms strongly reduces tumorigenicity of these cells. In accordance with previous publications, the reintroduction of Np73 rescued this growth defect, whereas ectopic expression of TAp73 further attenuates proliferation.
In order to further investigate Np73´s role in tumor development, an inducible Np73 transgenic mouse model was characterized. Whereas mere overexpression of Np73 exhibited no tumorrelevant properties, the combination with heterozygous knockout of p53 entailed earlier and accelerated tumor development particularly of lung tumors and lymphoma. The loss of the second p53 allele in lung tumors suggests that the dominant negative effect of Np73 rather impacts TAp73 than p53. Accordingly, the observed fertility and embryonic developmental defects in this transgenic model rather pointed towards a TAp73-dependent effect of Np73 as, in contrast to p53-deficient mice, severe and partially comparable defects have been described in TAp73- and complete p73-deficient mice.
Finally, transcriptomewide analysis of Np73-overexpressing murine embryonic fibroblasts revealed positive regulation of metastasis-promoting factors like ITGB4, JAG1 and 2. This tumorpromoting property of Np73 goes in line with accelerated dissemination of lymphoma into lungs of Np73;p53+/- mice.
Taken together, these results clearly demonstrate growth- as well as metastasis-promoting traits of Np73. However, the specific virtue of Np73 are largely cell context-dependent.Die Tumorentwicklung ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem sich aus einer einzigen Ursprungszelle durch Akkumulierung diverser Mutationen Tumoren entwickeln, die aus mehreren Populationen unterschiedlichen genetischen Status bestehen. Diese Heterogenität führt zu Selektionsvorteilen einzelner Subpopulationen innerhalb eines Tumors, die unter anderem Metastasierung sowie Therapieresistenz begünstigen. Zur Verbesserung der gezielten Krebstherapie von Patienten kann mittlerweile während des Therapieverlaufs die Zusammensetzung der Tumoren durch im Blut zirkulierende Tumor DNA verfolgt und die Therapie demensprechend angepasst werden. In experimentellen Ansätzen, wie Transplantationsmodellen solider Tumoren in Mäusen, kann diese Methode allerdings nicht angewandt werden, da das Blutvolumen der Versuchstiere zu klein ist. Dies limitiert die Untersuchung tumorrelevanter Faktoren in präklinischen Studien im Mausmodell.
In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe die Wachstumsdynamiken zweier unterschiedlicher Zellpopulationen in einem einzigen Tumorzellimplantat simultan verfolgt werden können. Hierzu wurde vor der Transplantation jeweils eine Zellpopulation durch stabile Expression von Gaussia Luziferase (GLuc) oder Cypridina Luziferase (CLuc) markiert. Beide Luziferasen werden aus den Zellen sezerniert und ins Blut der Versuchstiere abgegeben. Kleinste Blutproben sind bereits ausreichend, um die Tumorkomposition mittels Messung der Enzymaktivität beider Luziferasen zu bestimmen. Um die Auswirkungen gezielter genetischer Manipulationen untersuchen zu können wurden die Luziferasen zusätzlich an (un)spezifische shRNAs gekoppelt. Zur Etablierung wurden shRNAs verwendet, die sich gegen die p53 Familienmitglieder p53 und p73 richten. Während p53 als der wichtigste Tumorsuppressor bekannt ist, gibt es von p73 zwei N-terminal unterschiedliche Isoformen, die entgegesetzte Funktionen besitzen: das ebenfalls tumorsuppressive TAp73 und das tumorfördernde Np73. Die dominant negative Wirkung von Np73 liegt unter anderem in der Komplexierung seiner Familienmitglieder p53 und TAp73, wodurch diese die Fähigkeit verlieren an ihre Zielgene zu binden. Durch Kopplung der Luziferasen an unspezifische bzw. experimentelle shRNAs konnte die unterschiedliche Wachstumsdynamik transplantierter Zellen in An- bzw. Abwesenheit von p53 (oder p73) simultan verfolgt werden. Die in dieser Arbeit etablierte Methode wurde sowohl in einem Modell der experimentellen Metastasierung als auch unter therapeutischen Bedingungen erfolgreich validiert.
Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass das Wachstumsverhalten p73-hochexprimierender Hs 766T Zellen abhängig vom relativen Verhältnis beider N-terminaler Isoformen zueinander ist. Eine shRNA-vermittelte Reduktion beider Isoformen hemmt die Tumorigenität dieser Zellen. In Übereinstimmung mit dem aktuellen Wissensstand wurde dieser Effekt durch ektopische Expression von Np73 wieder aufgehoben, wohingegen die Wiedereinführung von TAp73 die Proliferation noch weiter reduzierte.
Um die Rolle von Np73 während der Tumorentwicklung genauer zu untersuchen, wurde zudem ein induzierbares Np73-transgenes Mausmodell charakterisiert. Obwohl die alleinige Überexpression von Np73 keinen tumorigenen Effekt aufwies, führte die Kombination mit heterozygotem Verlust von p53 zu einer früheren und verstärkten Tumorentstehung, insbesondere von Lungentumoren und Lymphomen. Der Verlust des zweiten p53 Allels in den Lungentumoren lässt eher auf eine dominant negative Wirkung von Np73 auf TAp73 als auf p53 schließen. Auch die beobachteten Fertilitäts- und embryonalen Entwicklungsdefekte dieser transgenen Mäuse weisen vielmehr auf einen TAp73-abhängigen Effekt von Np73 hin, da im Gegensatz zu p53-defizienten Mäusen bereits ähnliche Defizite in TAp73- und gesamt-p73-defizienten Mäusen beschrieben wurden.
Letztlich wurde durch die transkriptomweite Analyse Np73-überexprimierender muriner embryonaler Fibroblasten eine positive Regulation metastasierungsrelevanter Faktoren (ITGB4, JAG1, JAG2) festgestellt. Diese onkogene Eigenschaft von Np73 geht einher mit der Beobachtung dass Lymphome aus Np73;p53+/- Mäusen verstärkt in die Lungen disseminierten.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Np73 sowohl wachstums- als auch metastasierungsfördernde Eigenschaften besitzt, die genauen Wirkungsmechanismen allerdings abhängig vom Zellkontext sind
Mutagenesis of the endogenous TP53-locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair & Base Editing in lung cancer cells
No full textDas Bronchialkarzinom ist eine der häufigsten Tumorarten und der führende Grund Krebs-assoziierter Sterbefälle weltweit. In bis zu 70 % aller Bronchialkarzinome liegt das Tumorsuppressorgen TP53 mutiert vor. Ein besseres Verständnis des Genprodukts p53 und dessen Mutanten ist somit ein essenzieller Schritt zur Verbesserung der Prognose von Patienten und dadurch Teil intensiver Forschung.
Dafür wurde im Rahmen dieser Arbeit über mehrere Schritte ein Zellklon der Bronchialkarzinom-Zelllinie NCI-H460 (H460) generiert, an dem zukünftig eine effiziente Mutagenese des endogenen TP53-Lokus durch CRISPR/Cas9 und homologe Rekombination (homology directed repair, HDR) durchgeführt werden kann. Zunächst wurde mit dieser Methodik eine zusätzliche Sequenz, eine sogenannte LSL (LoxP-Stop-LoxP) - Kassette, in ein TP53-Allel eingebaut. Die anderen beiden TP53-Allele wurden ausgeschaltet, sodass eine monoallelische TP53-Expression erreicht wurde. Das Allel mit der LSL-Kassette konnte anschließend effizient editiert werden und das Verhalten einzelner TP53-Mutanten sowie eine saturierte Mutagenese des hotspot-Codons R175 wurden observiert. Hierfür wurde die zelluläre Fitness der Mutanten unter Behandlung mit dem Mdm2-Inhibitor Nutlin-3a, der physiologisch die p53-Antwort aktiviert, observiert. Mithilfe dieses Zellklons kann so in zukünftigen Experimenten erstmals das Verhalten jeder einzelnen klinisch auftretenden Mutation von p53 auf physiologischem Expressionslevel und innerhalb einer physiologischen Genstruktur analysiert werden. Durch diese vollständige Charakterisierung können schlussendlich Therapieschemata optimiert werden, um jedem Patienten unter Berücksichtigung der individuell auftretenden TP53-Mutation eine geeignete Therapie zu ermöglichen.
Des Weiteren wurde eine Mutagenese von TP53 durch die Verwendung eines Base Editors durchgeführt. Dieser besteht aus einer Cas9-Nickase, die mit einer APOBEC3A-Desaminase verknüpft ist. Damit konnten gezielt und mit einer Effizienz von über 90 % Cytosin-zu-Thymin Transitionen erreicht werden. In dieser Arbeit wurde zunächst das hotspot-Codon R273 von TP53 in H460- und HCT116-Zellen, einer Kolonkarzinom-Zelllinie, erfolgreich editiert. Zusätzlich wurde in HCT116-Zellen eine Mutagenese von Exon 8 von TP53 durchgeführt, bei der jede verfügbare PAM-Sequenz in diesem Bereich durch eine entsprechende sgRNA als Ziel erfasst wurde. Insgesamt konnte mit dem Base Editor eine gezielte Genomeditierung mit hoher Effizienz beobachtet werden.Lung cancer is one of the most common cancer types and the leading cause of cancer-related mortality worldwide. In approximately 70 % of all lung cancer cases, the tumor suppressor gene TP53 is mutated. Therefore, a better understanding of p53 mutants is an essential step towards the improvement of patient prognosis. That is one reason why p53 is intensively studied.
In this project, a cell clone of the lung cancer cell line NCI-H460 (H460) was established in a series of steps. This allowed an efficient mutagenesis of the endogenous TP53 locus of this cell clone via CRISPR/Cas9 and homology directed repair (HDR). Initially, a specific DNA-sequence, called LSL (LoxP-Stop-LoxP) - cassette, was introduced into one TP53 allele. The other two TP53-alleles present in this cell line were knocked out permanently, resulting in monoallelic TP53 expression. Thereafter, efficient editing of the endogenous TP53 locus was possible, so a generation of single TP53 mutants and a saturated mutagenesis of the hotspot codon R175 were implemented in this project. Cellular fitness of those generated mutants was then observed under treatment with the Mdm2-inhibitor Nutlin-3a, which specifically activates the p53 pathway under physiological circumstances. This cell clone is now suitable for introducing most clinically relevant TP53 mutations and analyzing their impact at a physiological expression level and within its native gene structure. This characterization can be used to optimize therapeutic schemes by individually adjusting the treatment according to the p53 mutant present in a patient’s tumor.
Furthermore, a mutagenesis of TP53 was performed by using a base editor which consists of a Cas9 nickase connected to an APOBEC3A deaminase. This construct was able to induce cystosine-to-thymine transitions with efficiencies over 90 %. In this project, the hotspot codon R273 of TP53 was successfully edited in H460- and colorectal HCT116 cells. Additionally, a mutagenesis of exon 8 of TP53 was performed in HCT116 cells by exploiting every PAM sequence present and targeting it with an appropriate sgRNA. In general, the base editor showed high efficiency combined with very high specificity
Targeting the interaction between p53 und p73 in cancer
No full textTP53 ist das in humanen Malignomen am häufigsten mutierte Tumorsuppressorgen (Kandoth et al.
2013). Mutationen des TP53-Gens führen meistens zur Expression von mutierten p53-Proteinen voller
Länge, die neben einem Funktionsverlust durch onkogenes Potential charakterisiert sind (Oren &
Rotter 2010). Dieses Potential wird unter anderem durch die Interaktion von MUTp53 mit dem
Tumorsuppressor TAp73 vermittelt (Como et al. 1999). In Übereinstimmung mit der etablierten
Datenlage wurde hier demonstriert, dass mutierte p53-Proteine das Transkriptionspotential von
WTp53 und TAp73 hemmen. Durch die Substanz RETRA wird die Interaktion von TAp73 mit
MUTp53 aufgehoben und TAp73 transkriptionell reaktiviert (Kravchenko et al. 2008). Bestätigend
wurde in dieser Arbeit das durch strukturstabile und strukturinstabile p53-Mutanten gehemmte
Transkriptionspotential von TAp73 durch RETRA wiederhergestellt. Darüber hinaus erhöhte RETRA
das Transkriptionspotential von TAp73. Ob hierbei ein spezifischer Effekt von RETRA auf die
Struktur des C-Terminus oder die transkriptionsinhibitorische Domäne von TAp73 ursächlich ist,
bleibt zu klären.
In der Behandlung einer heterogenen Auswahl von Tumorzelllinien mit RETRA wurden zum Teil
ausgeprägte zytotoxische Effekte beobachtet. Die retrospektive Mutations- und Korrelationsanalyse
der Ergebnisse ergab zunächst, dass die gemessene Zytotoxizität unabhängig von p53-Mutationsstatus
und verschiedenen strukturbiologischen Eigenschaften von p53 war, die die Interaktion mit TAp73
beeinflussen. Die Auswirkungen von RETRA in den behandelten Tumorzelllinien waren dabei auch
nicht von der mRNA-Expression der p73-Isoformen TAp73 und dNp73 abhängig. Dieses Ergebnis ist
jedoch wegen der heterogenen Zusammensetzung des behandelten Zelllinienpanels und der begrenzten
Aussagekraft der p73-Isoformenquantifizierung auf mRNA-Ebene kritisch zu bewerten. Die RETRABehandlung von Tumorzelllinien in Kombination mit dem Topoisomerase-II-Hemmer Etoposid
verursachte in Tumorzelllinien unabhängig des p53-Mutationsstatus ausgeprägte additive zytotoxische
Effekte. In MUTp53- und p53-negativen Zelllinien wurde zusätzlich ein deutlicher Wirksynergismus
von RETRA und Etoposid gemessen. Das Fehlen eines zytotoxischen Stimulus hat somit
möglicherweise zu einem unsystematischen Fehler in der Korrelationsanalyse geführt.
Die erhobenen Ergebnisse bestätigen in ihrer Zusammenschau, dass RETRA das
Transkriptionspotential von TAp73 wiederherstellen und seine tumorsuppressive Funktion aktivieren
kann. Die gemessenen chemosensibilisierenden Eigenschaften qualifizieren RETRA als möglichen
Kombinationspartner in der Therapie von malignen Tumoren mit konventionellen Chemotherapeutika.
Es sind jedoch weitere Untersuchungen in vitro und in vivo nötig, um die Wirkungsweise von RETRA
zu bestätigen. Der Einsatz von RETRA könnte dazu beitragen, therapeutisch nötige Dosierungen
verwendeter Zytostatika zu reduzieren, um unerwünschte Arzneinebenwirkungen zu minimieren bzw.
die Therapieintensität zu erhöhen. Da TAp73 in humanen Malignomen sehr selten mutiert ist, könnte
RETRA zudem zur Überwindung MUTp53-bedingter Resistenz von Malignomen auf Radio- und
Chemotherapie beitragen.TP53 is the most frequently mutated tumor suppressor gene in human cancer (Kandoth et al. 2013).
TP53 mutations cause the expression of full length p53 proteins that are characterized not only by a
loss of function but which also exert additional oncogenic features (Oren & Rotter 2010). They are
caused in part by the inhibitory interaction of MUTp53 with the tumor suppressor TAp73 (Como et al.
1999). In accordance with established data, here it was demonstrated that mutated p53 proteins inhibit
the transcriptional potential of WTp53 and TAp73. The small molecule RETRA disrupts the MUTp53-
TAp73 interaction and thereby reactivates transcriptional functions of TAp73 (Kravchenko et al.
2008). In agreement, the transcriptional potential of TAp73 inhibited by mutated structurally stable
and unstable p53 proteins was restored by RETRA. Moreover, RETRA increased the transcriptional
potential of TAp73 itself. Whether this was the result of a specific RETRA-mediated effect on the
structure of the TAp73 C-terminus or transcription inhibitory domain remains to be elucidated.
During treatment of a heterogenous panel of tumor cell lines with RETRA varying cytotoxic effects
were observed. Retrospectively, analyses of the treated cell lines revealed that the cytotoxicity caused
by RETRA was independent of the p53 mutational status and structural features of p53 that influence
the MUTp53/TAp73 interaction. There was no correlation with the mRNA expression of TAp73 and
dNp73 in the treated cell lines. Yet, this has to be appraised with caution since the treated cell line
panel was highly heterogeneous and quantifying the expression of the p73 isoforms at the mRNA level
is of limited predictive value in respect to their functional status. The combined treatment of tumor cell
lines with RETRA and etoposide, an inhibitor of topoisomerase II, caused additive cytotoxic effects
independent of their p53 mutational status. In addition, in MUTp53-expressing or p53 negative cell
lines synergistic effects of RETRA and etoposide were observed. Retrospectively, the lack of a
cytotoxic stimulus might have caused a random error during the conducted correlation analysis.
The presented data confirm the hypothesis that RETRA can reactivate the transcriptional and tumor
suppressive activity of TAp73. Additional research in vitro and in vivo is needed to confirm RETRA’s
suspected mechanism of action. This could put forward the idea of combining chemosensitizing
features of RETRA with conventional chemotherapeutics in the treatment of malignant tumors. This
would also provide a possibility to reduce established doses of chemotherapeutics to minimize side
effects or to intensify cancer treatment. Additionally, because TAp73 is only rarely mutated in human
cancer RETRA may contribute to overcome radio- and chemoresistance mediated by p53 mutations
Die vielfältige Rolle von mutiertem p53 bei der Veränderung des Transkriptoms und Sekretoms von Tumoren
No full textThe tumor suppressor gene TP53 is frequently inactivated by missense mutations in human cancers. These genetic alterations give rise to the expression of mutant variants of the encoded p53 protein (mutp53) that have lost their tumor-suppressive functions. Moreover, many mutp53 proteins acquire novel neomorphic properties that can significantly modulate cancer cell behavior, promoting aggressiveness, metastasis, and therapy resistance. Mutp53 primarily promotes tumor growth by interacting with various cellular proteins, especially transcription factors, leading to significant changes in transcriptional regulation. Remarkably, these pro-tumorigenic molecular alterations are not limited to intracellular processes but may also extend to the extracellular environment through mutp53-mediated changes in the composition of the tumor cell secretome. Consequently, this can profoundly influence the tumor microenvironment, creating a supportive milieu that favors tumor progression. The exceptionally high prevalence of TP53 mutations in human tumors and the diverse pro-tumorigenic activities of mutp53 render it an attractive target for cancer therapy. However, despite extensive research, no drug designed to specifically target tumors with TP53 mutations has been approved for clinical use, underscoring the ongoing need for further research into the underlying mechanisms.
In this study, various cancer models were established and characterized to enhance our understanding of mutp53's role in shaping the tumor microenvironment. Different human and murine cancer cell lines that harbor TP53 mutations were successfully deleted of mutp53 using the CRISPR/Cas9 technology. In addition, a conditional mutp53 knockout cell line was generated, enabling the acute deletion of mutp53. This approach facilitated the study of mutp53's oncogenic functions in a cell line highly dependent on mutp53. Furthermore, primary cell cultures were derived from paired cohorts of mice with mutp53-driven and mutp53-deficient small cell and non-small cell lung cancer tumors, induced by a combination of germline and somatic, CRISPR/Cas9-mediated, in vivo gene editing. Phenotypic analyses of small cell lung cancer derived cell cultures unveiled that mutp53 plays a role in enforcing the neuroendocrine phenotype, holding significant therapeutic implications. Moreover, transcriptomic profiling of all the generated mutp53-deleted tumor cell cultures, along with their parental mutp53-expressing counterparts, revealed several secreted factors and signaling pathways differentially regulated by mutp53. Notably, mutp53 consistently suppressed proinflammatory signaling pathways across various cancer models. Intriguingly, targeted proteomic analysis of the tumor cell secretome indicated that mutp53 stimulates global protein secretion and induces the context-specific secretion of several key components of the NF-κB signaling pathway, with NF-κB coactivator MTDH being most prominent.
In summary, the generation and combined transcriptomic and proteomic analysis of isogenic cell-based cancer models have provided insights into mutp53-regulated factors and signaling pathways that participate in the reciprocal communication between cancer cells and their surroundings. This work highlights the multifaceted potential of mutp53 in remodeling the tumor microenvironment.Das Tumorsuppressorgen TP53 wird in menschlichen Krebserkrankungen häufig durch Missense-Mutationen inaktiviert. Diese genetischen Veränderungen führen zur Expression von mutierten Varianten des kodierten p53 Proteins (mutp53), die ihre tumorsuppressiven Funktionen verloren haben. Zusätzlich erwerben viele mutp53 Proteine neue, neomorphe Eigenschaften, die das Verhalten von Tumorzellen erheblich beeinflussen und Aggressivität, Metastasierung sowie Therapieresistenz fördern können. Mutp53 trägt vor allem zum Tumorwachstum bei, indem es mit verschiedenen zellulären Proteinen interagiert, insbesondere mit Transkriptionsfaktoren, was zu erheblichen Veränderungen in der Transkriptionsregulation führt. Interessanterweise sind diese protumorigenen molekularen Veränderungen nicht nur auf intrazelluläre Prozesse beschränkt, sondern können sich auch auf die extrazelluläre Umgebung ausweiten, da mutp53 auch die Zusammensetzung des Tumorzellsekretoms beeinflussen kann. Folglich kann dies die Mikroumgebung des Tumors tiefgreifend beeinflussen und ein Milieu schaffen, welches die Tumorprogression begünstigt. Aufgrund der außerordentlich hohen Prävalenz von TP53-Mutationen in menschlichen Tumoren sowie den vielfältigen protumorigen Eigenschaften von mutp53, ist mutp53 ein attraktives Ziel in der Krebstherapie. Trotz umfangreicher Forschungsarbeiten ist jedoch bisher kein Medikament zur gezielten Bekämpfung von Tumoren mit TP53-Mutationen für die klinische Anwendung zugelassen, was den Bedarf an weiterer Erforschung der zugrunde liegenden Mechanismen unterstreicht.
In dieser Studie wurden verschiedene Tumormodelle etabliert und charakterisiert, um den Einfluss von mutp53 auf die Tumormikroumgebung untersuchen zu können. Die Anwendung der CRISPR/Cas9-Technologie ermöglichte das gezielte Entfernen von mutp53 in verschiedenen humanen und murinen Tumorzelllinien mit TP53-Mutationen. Um die onkogenen Aktivitäten von mutp53 auch in einer Tumorzelllinie, die stark von mutp53 abhängig ist, untersuchen zu können, wurde eine Zelllinie erzeugt, in der mutp53 induzierbar deletiert werden kann. Des Weiteren wurden Primärzellkulturen aus gepaarten Mauskohorten mit mutp53-exprimierenden und mutp53-defizienten kleinzelligen und nicht-kleinzelligen Lungentumoren gewonnen. Diese Tumore wurden durch eine Kombination von Keimbahn- und CRISPR/Cas9-vermittelter somatischer Geneditierung im lebenden Organismus induziert. Die phänotypische Analyse der kleinzelligen Lungentumor-Zellkulturen zeigte, dass mutp53 eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des neuroendokrinen Phänotyps spielt, was erhebliche therapeutische Auswirkungen hat. Darüber hinaus ergab die transkriptomische Untersuchung aller generierten mutp53-deletierten Tumorzellkulturen zusammen mit ihren mutp53-exprimierenden Ausgangszellen, dass mutp53 mehrere sekretierte Faktoren und Signalwege differentiell reguliert. Bemerkenswert ist, dass mutp53 konsistent proinflammatorische Signalwege in verschiedenen Tumormodellen unterdrückte. Interessanterweise deutete die gezielte proteomische Analyse des Tumorzellsekretoms darauf hin, dass mutp53 die globale Proteinsekretion stimuliert und die kontextspezifische Sekretion mehrerer wichtiger Komponenten des NF-κB-Signalwegs induziert, wobei der NF-κB-Coaktivator MTDH am stärksten hervorstach.
Zusammenfassend konnten durch die Generierung von zellbasierten Tumormodellen und deren transkriptomische und proteomische Untersuchung Einblicke in mutp53-regulierte Faktoren und Signalwege, die an der wechselseitigen Kommunikation zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung beteiligt sind, gewonnen werden. Diese Arbeit unterstreicht somit das vielseitige Potenzial von mutp53 die Tumormikroumgebung zu verändern
Establishing a NSCLC model to investigate the role of p53 DNA binding cooperativity for cell fate decicions in vitro and in vivo
No full textDer Tumorsuppressor p53 fungiert als eine zelluläre Drehschreibe, die eine Vielzahl von Stresssignalen erkennt und weiterverarbeitet. Über eine enge Kontrolle des Zellzyklus und des Zustands des Genoms sichert p53 die genomische Integrität einer Zelle und entscheidet durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor als Antwort auf zelluläre Stressoren über das Zellschicksal. Abhängig von Art und Ausmaß des Schadens, kann die Antwort von transientem Zellzyklusarrest mit Einleitung von DNA-Reparaturprogrammen über einen irreversiblen Zellzyklusstopp durch Seneszenz oder Differenzierung bis hin zur Entfernung der Zelle aus dem Organismus durch p53-vermittelte Apoptose reichen.
Für die Auswahl von Zielgenen und damit das p53-abhängige Zellschicksal spielt die p53 DNA Bindungskooperativität eine entscheidende Rolle. p53 bindet als Tetramer kooperativ an die DNA. Die strukturelle Basis hierfür stellen intermolekulare Interaktionen zwischen den beiden gegensätzlich geladenen Aminosäureresten Glutamat 180 und Arginin 181 an der Helix H1 der DNA Bindungsdomänen von jeweils zwei p53 Monomeren dar. Mutationen an dieser Stelle können die Kooperativität und damit Bindungsaffinität von p53 an die DNA verringern bzw. erhöhen. Dies beeinflusst die Zielgenselektion, denn hohe Kooperativität erweitert das Zielgenspektrum auch auf Gene mit von der p53-Konsensussequenz abweichenden p53-responsiven Elementen. Während Zielgene, die in der Auslösung von Zellzyklusarrest involviert sind, meist kanonische p53 RE aufweisen und daher sowohl von niedrig- als auch hoch-kooperativem p53 transaktiviert werden können, finden sich in den Promotoren von Apoptose-fördernden Zielgenen weniger perfekte, niedrig-affine p53 Bindungsstellen, für deren Bindung daher hohe Kooperativität erforderlich ist.
Der Einfluss der Bindungskooperativität auf das langfristige Proliferationsverhalten von Tumorzellen in vitro und in vivo konnte dabei bislang noch nicht vergleichend untersucht werden. Übergeordnetes Ziel dieser Arbeit war es daher, Zelllinien mit stabiler Expression von p53-Kooperativitätsmutanten zu etablieren, welche den Einfluss von Kooperativität auf das Zellschicksal abbilden und untersuchbar machen.
Hierzu wurde ein induzierbares p53-Expressionssystem mit den verschiedenen Kooperativitätsmutanten kloniert, die das ganze Spektrum der H1-Helix-Interaktionsstärken – von aufgehoben bis über dem physiologischen Niveau liegend – abdecken. Das System wurde weiterhin mit einem Reporter versehen, um die p53 Expression überwachbar zu machen. Die entstehenden Fusionsproteine wurden korrekt exprimiert und übten erst nach Aktivierung p53-spezifische Effekte aus.
Um eine optimale Vergleichbarkeit des Einflusses von Kooperativität auf das Zellschicksal herzustellen, wurde der Versuch unternommen, die p53 Konstrukte Endonuklease-vermittelt zielgerichtet in den Rag1 Genlokus p53-negativer H1299 Zellen zu integrieren. Dabei wird der zelluläre Reparaturmechanismus der homologen Rekombination ausgenutzt, um isogene Zelllinen zu generieren. Es zeigte sich eine sehr geringe Rekombinationsrate; zudem wiesen die positiv getesteten Klone unterschiedlich hohe p53-Proteinlevel und weiterhin keine induzierbare und effektive Aktivität von p53 auf. Daher eigneten sie sich nicht zur weiteren Untersuchung der Bindungskooperativität. Es lässt sich diskutieren, dass aufgrund verschiedener möglicher Gründe – z.B. dem epigenetischen Status des Rag1-Lokus oder Mutationen im DNA-Reparatursystem – Meganuklease-vermittelte zielgerichtete Integration in H1299 Zellen nur mit sehr geringer Effizienz möglich ist.
Daraufhin wurden durch konventionelle Transfektion und Selektion Zelllinien mit stabiler Expression der p53-Fusionsproteine generiert. Diese zeigten eine gute Expression der Konstrukte und nach Aktivierung von p53 starke, p53- und kooperativitätsabhängige Effekte. So zeigte sich bei der Untersuchung der langfristigen Auswirkung der Kooperativität auf die Proliferation eine mit steigender Kooperativität reduzierte Proliferationskinetik. Da die Zellen nicht isogen zueinander waren, zeigte sich in manchen der verwendeten Klone ein Einfluss der unterschiedlichen Proteinlevel auf das Zellschicksal, welche teilweise den Einfluss der Bindungskooperativität maskierte. Andererseits konnte aber auch verdeutlicht werden, dass dieses Modell bei sorgsamer Auswahl der Klone den Einfluss der p53 DNA Bindungskooperativität sehr gut abbilden kann. Daher eignet es sich sehr für weitere Experimente. Die Mechanismen p53-vermittelter Zellschicksalsentscheidungen zu verstehen, ist von großer Bedeutung, weshalb die weitere Erforschung der Bindungskooperativität – als ein Modulator dieser Entscheidungen – vorangetrieben werden sollte. Als eine der Möglichkeiten für weitere Untersuchungen mit diesem Modell bieten sich Xenograft-Studien an.The tumor suppressor p53 acts as a cellular hub which processes a multitude of stress signals. By ensuring a tight control of the cell cycle and the state of the genome it acts as a safeguard of genomic integrity of a cell and - as an answer to cellular stresses - decides the cell’s fate mainly through its function as a transcription factor. Depending on the type and extent of the damage, the answer can reach from transient cell cycle arrest with concurrent start of DNA-repair programs to an irreversible cell cycle arrest by senescence or differentiation up to – ultimately – the removal of the cell from the organism via p53-mediated apoptosis.
p53 DNA binding cooperativity plays an important role for target gene selection and thus for p53-dependent cell fate. p53 binds DNA as a tetramer in a cooperative manner. The structural basis for cooperativity is constituted by intermolecular interactions between the two oppositely charged amino acid residues glutamate 180 and arginine 181 in the helix H1 of the DNA binding domains of two p53 monomers. Mutations of these residues can lower or raise cooperativity and therefore DNA binding affinity of p53. This influences target gene selection, because high cooperativity expands the target gene spectrum to genes with p53 response elements deviating from the p53 consensus sequence. While target genes involved in cell cycle arrest mostly display canonical response elements and can therefore be transactivated by both low- and high-cooperative p53, promoters of apoptosis-promoting target genes often show imperfect, low-affinity p53 binding sites which can only be bound by high-cooperative p53.
The influence of binding cooperativity on long-term proliferation behavior of tumor cells in vitro and in vivo has not been assessed comparatively yet. A primary objective of this work was therefore to establish cell lines with stable expression of p53-cooperativity mutants by means of which the entire spectrum of H1-Helix interactions strength and the associated impact on cell fate can be investigated.
For this purpose an inducible p53 expression system with the different cooperativity mutants, which spanned the entire spectrum of cooperativity – from abrogated up to higher than physiological – was cloned. Furthermore, the system was labeled with a reporter, in order to monitor p53 expression. The created fusion proteins were expressed correctly and exerted p53-specific effects only after activation.
For an optimal comparability of the influence of cooperativity on cell fate, it was attempted to integrate the p53 construct into a given locus in p53-null H1299 cells by means of gene targeting; this means endonuclease-mediated targeted integration into the Rag1 locus via homologous recombination to generate isogenic cell lines. The recombination rate was very low; furthermore the positively tested clones exhibited different p53-protein levels and did not show inducible and effective activity of p53. Thus, they were not suitable for further investigation of binding cooperativity. It can be presumed that because of a variety of reasons – e.g. the epigenetic status of the Rag1 locus or mutations in the DNA repair system – Meganuclease-mediated targeted integration in H1299 cells is only possible with very low efficiency.
Thereupon additional cell lines with a stable expression of p53 fusion constructs were generated through conventional transfection and selection. They exhibited good expression of the constructs and strong p53- and cooperativity dependent effects on the cell fate upon p53 activation. For instance, cells showed reduced proliferation kinetics with increasing cooperativity. However, due to the fact that cells were not strictly isogenic, it could be observed that in some of the used clones different protein levels showed an effect on the cellular outcome upon p53 activation which in part masked influence of binding cooperativity. On the other hand, it could also be clarified that by means of careful selection of clones this model can display the influence of p53 DNA binding cooperativity very well. Hence, it is very suitable for additional experiments. Understanding the mechanisms of p53-mediated cell fate decisions is of great importance, thus further research on binding cooperativity as one modulator of these decisions should be conducted. There is a variety of possibilities for further investigations with this model, of which I suggest xenograft studies
Advanced preclinical CRISPR mouse models to explore context-dependent effects of TP53 mutations in cancer
No full textThe tumor suppressor p53 is the most frequently mutated protein in cancer patients and exhibits a unique mutational spectrum that is dominated by missense mutations. In contrast to the most prevalent hotspot mutations, 70% of all missense mutations are non-hotspot mutations with yet poorly characterized functions in tumorigenesis. Non- hotspot mutants often retain some wildtype activity, which corresponds to a partial loss- of-function (pLOF). Mutations that affect the DNA binding cooperativity of p53 fall into this class of mutants.
This work demonstrates that the prototypical DNA binding cooperativity mutant E177R can either promote tumorigenesis or induce tumor regression dependent on the cellular and genetic context. Expression of E177R in normal tissues resulted in increased susceptibility to spontaneous and oncogene-driven tumor development, emphasizing the pathogenic role of pLOF mutants. In striking contrast, expression of E177R in p53- deficient tumor cells revealed that the residual transcriptional activity of the mutant is able to promote the regression of already manifested tumors. That the same p53 mutant can have opposite effects on tumor growth highlights how genetic context determines the consequences of a cancer mutation.
To investigate the impact of specific mutations in different genetic contexts, we have developed a new method for generating genetically defined mouse tumors for preclinical studies. We have applied the CRISPR technology to induce cancer mutations rapidly and precisely in somatic cells and present a flexible toolkit based on adenoviral vectors for in vivo delivery of CRISPR effectors. In addition, we have generated a conditional reporter mouse that expresses a Gaussia princeps luciferase (GLuc). When GLuc is secreted by tumor cells, it accumulates in the blood and serves as a tumor marker to monitor cancer development and therapy responses. By combining the use of CRISPR adenoviruses and GLuc reporter mice, we have established a preclinical mouse tumor model that allows the rapid and flexible induction of autochthonous tumors that are easily monitored using blood samples to study the impact of a cancer mutation on tumorigenesis and cancer therapy in a genetically defined context.Der Tumorsuppressor p53 ist das am häufigsten mutierte Protein in Krebspatienten und weist ein einzigartiges Mutationsspektrum auf, das von Missense-Mutationen dominiert wird. Im Gegensatz zu den am häufigsten vorkommenden Hotspot-Mutationen, sind 70% aller Missense-Mutationen Non-Hotspot-Mutationen, deren Funktion bei der Tumorentstehung noch nicht ausreichend bekannt ist. Non-hotspot-Mutationen behalten oft eine gewisse Wildtyp-Aktivität, was einem partiellen Funktionsverlust (pLOF) entspricht. Mutationen, die die DNA-Bindungskooperativität von p53 beeinträchtigen, fallen in diese Klasse von Mutanten.
Diese Arbeit zeigt, dass die prototypische DNA-Bindungskooperativitätsmutante E177R, je nach zellulärem oder genetischem Kontext, in der Lage ist, entweder Tumorentstehung oder Tumorregression zu fördern. Die Expression von E177R in normalen Geweben führte zu einer erhöhten Anfälligkeit für spontane und Onkogen- induzierte Tumorentwicklung, was die pathogenen Eigenschaften von pLOF-Mutanten verdeutlicht. In auffälligem Gegensatz dazu zeigte die Expression von E177R in p53- defizienten Tumorzellen, dass die transkriptionelle Restaktivität der Mutante die Regression von bereits manifestierten Tumoren ermöglicht. Dass ein und dieselbe p53- Mutante entgegengesetzte Auswirkungen auf das Tumorwachstum haben kann, verdeutlicht, wie der genetische Kontext die Folgen einer Tumormutation bestimmt. Um den spezifischen Einfluss solcher Mutationen in unterschiedlichen genetischen Kontexten zu untersuchen, haben wir eine neue Methode zur Erzeugung genetisch definierter Maustumore für präklinische Studien entwickelt. Wir haben die CRISPR- Technologie eingesetzt, um Krebsmutationen schnell und präzise in somatischen Zellen zu induzieren, und stellen ein flexibles Toolkit vor, das auf adenoviralen Vektoren für den Transfer von CRISPR-Effektoren basiert. Darüber hinaus haben wir eine konditionelle Reportermauslinie generiert, die die Gaussia princeps Luciferase (GLuc) exprimiert. Von Tumorzellen sezernierte GLuc reichert sich im Blut an und dient dort als Tumormarker zur Überwachung der Tumorentwicklung und des Therapieansprechens. Durch die Kombination von CRISPR-Adenoviren und GLuc-Reportermäusen haben wir ein präklinisches Maustumormodell etabliert, das die schnelle und flexible Induktion von autochthonen Tumoren ermöglicht, die sich leicht anhand von Blutproben überwachen lassen, um die Auswirkungen einer Krebsmutation auf Tumorentwicklung und Krebstherapie in einem genetisch definierten Kontext zu untersuchen
Influence of the p53 DNA binding cooperativity on the tumour suppressor activity & Monitoring the dynamics of clonal tumour evolution in vitro & in vivo using secreted luciferases
No full textDer Tumorsuppressor p53 wird als „Wächter des Genoms“ bezeichnet und spielt eine wichtige Rolle bei der Prävention von Krebserkrankungen. p53 ist ein sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor, der durch verschiedene Formen von Zellstress wie DNA-Schäden oder Onkogene aktiviert wird und in Abhängigkeit der Schwere der entstandenen Schäden eine Vielzahl verschiedener Zielgene transaktiviert, die Zellzyklus Arrest, Seneszenz, Differenzierung und Apoptose induzieren. Bei der Entscheidung über Überleben oder Sterben tragen posttranskriptionelle Modifikationen von p53 und Interaktionen mit Kofaktoren dazu bei, dass p53 bestimmte Gruppen von Zielgenen aktiviert. Es ist aber unklar, wie diese Entscheidung über das Zellschicksal auf der Ebene der Promotorbindung von Zielgenen durch p53 getroffen wird. Für die Bindung an die DNA bilden vier p53-Proteine ein Tetramer, wobei die DNA Bindungsdomänen kooperativ an die DNA binden. Dabei interagieren die H1-Helices der DNA-Bindungsdomänen zweier benachbarter p53-Monomere über eine Salzbrücke.
Um den Einfluss der DNA-Bindungskooperativität für die tumorsuppressive Funktion von p53 zu untersuchen, wurden p53 H1-Helixmutanten generiert, die das komplette Spektrum von niedriger bis starker DNA-Bindungskooperativität aufweisen und bezüglich ihrer genomischen Bindung und Transaktivierung von Zielgenen sowie ihrer Antwort auf Stress untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Kooperativität eine Bindung an degenerierte Motive, wie sie in proapoptotischen Genen vorkommen, ermöglicht und so das Bindungsspektrum von p53 erweitert. Eine niedrige Kooperativität erlaubt die Induktion von Zellzyklus-Arrest, verhindert aber die Induktion von Apoptose. Somit moduliert die DNA-Bindungskooperativität die Entscheidung über das Zellschicksal, bestimmt die Eliminierung von geschädigten Zellen durch Apoptose und trägt zur Tumorsuppressoraktivität von p53 bei.
Tumore sind heterogene Zellpopulationen, die aus genetisch unterschiedlichen Subklonen bestehen, die in einem iterativen Evolutionsprozess aus genetischer Mutation und Selektion entstehen. Die Mehrzahl der Tumorsubklone kann häufig therapeutisch zerstört werden, doch kann bei einer Therapie der starke Selektionsdruck das Auswachsen und Überleben resistenter Klone fördern. Das Verständnis über die genetischen Veränderungen in der klonalen Tumorentwicklung, die zur Tumorinitiation, Progression, Metastasierung, Therapieresistenz und Rezidiven beitragen, ist von großem Interesse, um Präventionsstrategien und Therapien zu entwickeln. Die Rolle einzelner Gene bei der Tumorentstehung kann spezifisch mittels RNA Interferenz unter Verwendung von short hairpin RNAs (shRNA) untersucht werden, die einen stabilen Funktionsverlust-Phänotyp generieren. Dabei werden in Experimenten shRNA-exprimierende Tumorzellen oft mit Fluoreszenzreportern markiert und verfolgt. Dies funktioniert gut in Zellkulturexperimenten oder Leukämie-Mausmodellen, aber nicht in soliden Tumoren, die 90% aller Tumore im Menschen ausmachen.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Systems zur konstitutiven und induzierbaren Markierung von Tumorzellen mit sezernierten Luciferasen. Dafür wurde ein dualer Luciferase Assay entwickelt, der es ermöglicht, zwei unterschiedliche shRNA-exprimierende Tumorzellklone kompetitiv zu verfolgen, sowohl in vitro als auch in vivo. Die Aktivität der sezernierten Gaussia (GLuc) und Cypridina (CLuc) Luciferasen kann verlässlich und spezifisch in Überständen von Zellmischungen oder im Xenograft-Modell ohne größere Eingriffe durch minimalinvasive Methoden im Mausblut gemessen werden und korreliert mit der Tumorzellzahl, bzw. der Tumorgröße. Die Ergebnisse zeigen, dass sich mit diesem dualen Assay die Entwicklungsdynamik von Tumorsubklonen auch in soliden Tumoren zeitlich erfassen lässt, und etablieren die Anwendungsmöglichkeit zur Untersuchung einzelner Gene und deren Beitrag zur Tumorentwicklung, Metastasierung und Tumortherapie. Durch die Verwendung einer der Luciferasen als interne Kontrolle in diesem kompetitiven Ansatz zur Normalisierung der Daten ist die Varianz der Ergebnisse deutlich geringer und die Versuchstierzahlen können somit um bis zu drei Viertel reduziert werden. Durch Verwendung sezernierter Luciferasen konnte so unter Berücksichtigung des 3R-Prinzips eine Methodik etabliert werden, um die Anzahl und die Belastung von Tieren in der Tumorforschung deutlich zu reduzieren.p53 is known as the “guardian of the genome” and plays an important role in the prevention of cancer development. In response to different kinds of cellular stress like DNA damage or oncogene activity p53 binds as a sequence specific transcription factor to the DNA and induces the expression of genes involved in cell cycle arrest, senescence, differentiation and apoptosis. It is known that interaction with cofactors and modifying enzymes is involved in the decision between survival and death by p53. Nevertheless it remains unclear how this decision is made at the level of p53 binding to promoters. p53 forms a tetramer and binds to the DNA in a cooperative manner via the DNA binding domain. For this the H1 helices of two adjacent p53 monomers interact by forming a salt bridge.
To determine the role of p53 DNA binding cooperativity for tumour suppression, p53 H1 helix mutants which cover the whole range from low to high cooperativity were generated and analyzed with respect to their genomic binding profiles, transactivation of target genes and response to cellular stress.
The results show that the binding spectrum of p53 is extended by DNA binding cooperativity to include degenerated response elements found in proapoptotic genes. Therefore low cooperativity p53 induces cell cycle arrest but prevents the induction of apoptosis. Hence, DNA binding cooperativity modulates the cell fate decision, determines the elimination of damaged cell through apoptosis and contributes to the tumour suppressor activity of p53.
Tumours are heterogeneous cell populations that consist of genetically distinct subclones. These subclones arise through the reiterative process of genetic mutation and selection. Most of these cancer clones can be eliminated therapeutically but due to a strong selective pressure during therapy resistant variants can expand. The genetic mutations that contribute to tumour initiation, progression, metastasis and therapy resistance are attractive targets for the development of therapeutic treatments. The contribution of single genes to cancer can be analyzed specifically with RNA interference and the use of short hairpin RNAs (shRNA) by generating a loss-of-function phenotype. In such experiments tumour cells carrying shRNAs can be marked and tracked with fluorescent markers. This works well in in cell culture studies or in leukemia mouse models but not for solid tumours, which comprise 90% of all cancers.
Hence a system was generated to mark tumour cells constitutively or in an inducible manner with secreted luciferases. We developed a dual luciferase assay to track the fate of two different shRNA-expressing tumour cell clones competitively, both in vitro and in vivo. The activities of the secreted Gaussia (GLuc) and Cypridina (CLuc) luciferases can easily and specifically be measured in the supernatant of cultured cells or minimal-invasively in mouse xenograft models in the blood of mice. The luciferase activities also correlate well with the tumour cell number or the tumour size. We show that this dual assay enables the time-resolved monitoring of clonal tumour evolution in a dynamic manner and its suitability for solid tumours as well as for the analysis of genes and their contribution to tumour development, metastasis and therapy. With one of the secreted luciferases as internal control for normalization the variance of the data is reduced and allows a reduction of animal numbers by approximately 75%. Using secreted luciferases and in consideration of the 3R principle we established a methodology to reduce the burden of animals in tumour research
The role of DNA-binding-cooperativity for p53-mediated tumor suppression lung tumor xenograft model
No full textp53 wird wegen seiner herausragenden Rolle als Tumorsuppressor auch als
Wächter des Genoms bezeichnet: als Transkriptionsfaktor reguliert es die
Expression zahlreicher Gene und nimmt hierdurch Einfluss auf die Zellproliferation.
Bei zellulärem Stress, wie zum Beispiel bei DNA-Schädigung oder
Aktivierung von Onkogenen, steigt der Spiegel von p53 in der Zelle rasch an.
Mögliche Konsequenzen sind ein transienter Zellzyklusarrest, der eine DNAReparatur
ermöglicht, die Seneszenz, ein irreversibler Zellzyklusarrest, oder
die Apoptose, der programmierte Zelltod. Durch diese Maÿnahmen wird die
Proliferation der Zelle vorerst gestoppt und der Organismus vor Generierung
und Vermehrung von Krebszellen geschützt.
Wie genau die Entscheidung zwischen transientem Zellzyklusarrest, Seneszenz
und Apoptose getroffen wird, ist bis heute nicht abschließend geklärt. p53 bindet
als Tetramer kooperativ an die DNA, was bedeutet, dass die Bindung des
kompletten p53-Tetramers an die DNA stärker ist als die Summe der Bindungen
der vier einzelnen p53-Monomere. Die Stabilität der Bindung zwischen
den einzelnen p53-Molekülen beeinflusst die Auswahl der Target-Gene entscheidend
und korreliert mit dem Ausmaÿ der induzierten Apoptose.
Um den Einfluss der DNA-Bindungskooperativität von p53 auf die Tumorsuppression
zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit unterschiedlich stark kooperative
p53-Mutanten stabil in eine p53-negative Lungenkarzinomzelllinie
transfiziert. Im Lungentumor-Xenograft-Modell konnte gezeigt werden, dass
sich bei höherer DNA-Bindungskooperativität von p53 signifikant weniger Tumore
entwickeln. Eine zusätzliche Chemotherapie mit Doxorubicin vermochte
die Tumormasse nochmals zu reduzieren. Diese Ergebnisse belegen eindrucksvoll
die Abhängigkeit der Tumorsuppression sowie der Chemosensibilität von
der DNA-Bindungskooperativität von p53. Interessanterweise war keine konstitutive
Aktivität von p53 notwendig, sondern eine konditionelle Aktivierung
ausschlieÿlich in der letzten Behandlungswoche führte zu einem gleichwertigen
tumorsuppressiven Effekt.
Dieses Wissen um die Effekte der DNA-Bindungskooperativität ist therapeutisch
hoch interessant, da Substanzen, die die Kooperativität erhöhen und somit
die Apoptoserate steigern, zur Behandlung von Tumorerkrankungen eingesetzt
werden könnten. Alternativ könnte eine transiente Absenkung der Kooperativit
ät der gesunden Körperzellen bei Chemotherapie die Nebenwirkungsrate
senken.p53 is known as the guardian of the genome due to its remarkable role as
a tumor suppressor: as a transcription factor it regulates the expression of a
multitude of genes, thereby influencing cell proliferation. Under cellular stress,
such as after DNA-damage or activation of oncogenes, intracellular levels of
p53 can rise quickly, leading to diverse reactions. These include transient cell
cycle arrest, which allows DNA repair, senescence, an irreversible form of cell
cycle arrest, and apoptosis, the programmed cell death. These mechanisms can
inhibit cell proliferation and thus protect the organism against generation and
proliferation of cancer cells.
To date, the detailed mechanisms determining transient cell cylcle arrest, senescence
or apoptosis remain to be elusive. p53 binds to the DNA as a tetramer
in a cooperative manner, meaning that binding-strength of the whole
p53-tetramer exceeds the sum of the binding strength of the four monomers.
Binding stability between the four p53-molecules crucially influences target
gene selection and correlates with apoptotic rates.
The aim of this study was to investigate the influence of DNA-binding-cooperativity
of p53 on its tumor suppressive capacity in vivo. p53-mutants with different
cooperativity, ranging from extremely weak to strong, were transfected
into a p53-negative lung tumor cell line. In a xenograft model it could be proven
that higher DNA-binding-cooperativity leads to less tumor burden. Chemotherapy
with doxorubicin additionally reduced tumor burden. These results
underline a distinct dependency of tumor suppression and chemosensitivity of
the tumor cells on the DNA-binding-cooperativity of p53. Interestingly, no
constitutive activation of p53 was necessary, as a conditional activation of p53
only in the last week of treatment led to an equivalent effect.
The gained insights into the effects of DNA-binding-cooperativity are of substantial
relevance as substances which enhance cooperativity and thereby increase
apoptosis rates could be potential drugs in cancer therapy. On the other
hand, transient reduction of cooperativity in healthy bystander cells during
chemotherapy could reduce side effects
- …
