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Inflammasome activation by helicobacter pylori and its implications for persistence and immunity
No full textInfection with the Gram-negative pathogen Helicobacter pylori is the most prevalent chronic bacterial infection affecting about 50 % of the human world population and is the main risk factor for gastric cancer development. The pro-inflammatory cytokine IL-1β plays a crucial role in the development of gastric tumors, and polymorphisms in the IL-1 gene cluster resulting in increased IL-1β production have been associated with increased risk for gastric cancer. Recently, Helicobacter pylori was postulated to activate the inflammasome in human and mouse immune cells, and the molecular mechanisms and the bacterial virulence factors activating the inflammasome were elucidated in cell culture as well as animal models. It appears that H. pylori-induced IL-1β secretion is mediated by activation of toll-like receptor 2 (TLR-2), Nod-like receptor family member NLRP3 and caspase-1. The cag pathogenicity island-encoded type IV secretion system, lipopolysaccharide, vacuolating cytotoxin, and urease B subunit appear to play a role in inflammasome activation. In addition, recent results indicate that the TLR-2 → NLRP3 → caspase-1 → IL-18 axis is critical to H. pylori-specific immune regulation conferring protection against allergen-induced asthma and inflammatory bowel disease in murine models. The present chapter will review the proposed mechanisms of NLRP3 inflammasome activation during H. pylori infection and discuss the recent progress in this important research field
Charakterisierung neuer Virulenzmechanismen der gastrointestinalen Pathogene Campylobacter jejuni und Helicobacter pylori
No full textThe pathogens H. pylori and C. jejuni are the causative agents of many gastrointestinal diseases. The exact mechanism these pathogens use to cause disease is not yet fully understood. It has previously been determined that H. pylori requires an intact cagPAI for pathogeneses. It is also known that several virulence factors are important for the pathogeneses of both bacteria. This study focused on one virulence factor, which is encoded with a high sequence similarity in both pathogens, the serine protease HtrA (high temperature requirement A). In regards to both bacteria, it has been previously shown that this protease is able to cut the adherens junctions (AJ) protein E cadherin. The aim of this work was to identify further target proteins of HtrA, for both H. pylori and C. jejuni. This study effectively determined that the HtrA of both bacteria is able to cut occludin and claudin 8. These are two members of the tight junctions (TJ) protein family. In addition, the cleavage site of HtrA could be identified in the occludin, which is located within the second extracellular loop. The cutting of these proteins by HtrA resulted in the opening of the epithelial layer.
Another target protein of H. pylori HtrA (HtrAHp).was identified in this work; it is the multifunctional cell protein cortactin. In studies published by Prof. Steffen Backert and his research team, it was observed that cortactin is manipulated by H. pylori to provide an advantage to the bacterium.
The present study demonstrates new target proteins (occludin, claudin-8 and cortactin) from HtrA. After the cleavage experiments we investigated in their function during infection. For this purpose, the CRISPR/Cas9 method was established and used for the successful generation of two knockout cell lines. The knockout cell lines demonstrated that both occludin and cortactin have an influence on infection, but in the case of occludin, other TJ proteins take over the function of occludin within the epithelial layer.
Furthermore, it was determined that cortactin forms a complex with both the TJ associated protein ZO 1 and the kinase Par1b/MARK2. During infection, the complex formation is increased which gives H. pylori an advantage. The advantage is that the pathogen is more likely to have access to important nutrients that are not available in the lumen for example iron (Fe3+) which promotes long term colonization of the epithelium, and increases the permeability between neighboring cells, thereby simplifying the bacterium to reach his basolateral receptors.Die Pathogene Helicobacter pylori (H. pylori) und Campylobacter jejuni (C. jejuni) sind Erreger vieler Magen Darm Erkrankungen im Menschen. H. pylori kann Magenschleimhautentzündungen und Magenkrebs verursachen, C. jejuni löst Durchfallerkrankungen bei Patienten aus. Die genauen Mechanismen, wie beide Pathogene die ihnen zugeschriebenen Krankheiten auslösen, sind noch nicht vollständig verstanden. Bisher ist bekannt, dass H. pylori die oben beschriebenen Krankheiten nur mit einem intakten cagPAI, worauf das T4SS kodiert vorliegt, auslösen kann. Des Weiteren sind einige Virulenzfaktoren von beiden Pathogenen beschrieben worden, die an den Veränderungen der Epithelschicht beteiligt sind. Zu den Virulenzfaktoren wird unter anderem die Serinprotease HtrA gezählt. Diese kommt in beiden Pathogenen vor und weist eine hohe Sequenzähnlichkeit auf. Es wurde für beide Bakterien gezeigt, dass diese Protease in der Lage ist, das Adherens junction Protein E Cadherin zu schneiden. Ein Ziel dieser Arbeit war es, weitere Zielproteine von HtrA zu identifizieren, sowohl für H. pylori als auch für C. jejuni. Es konnte gezeigt werden, dass das HtrA von beiden Bakterien in der Lage ist, Occludin und Claudin 8 zu schneiden. Beide Proteine werden zu den Tight junctions (TJ) gezählt, welche eine wichtige Proteingruppe darstellt. Ihre Funktionen innerhalb des Zellverbandes sind zum einen, die Barriere aufzubauen und zum anderen, die Polarität der Zelle aufrechtzuerhalten. Außerdem konnte die Schnittstelle von HtrA in Occludin identifiziert werden, welche sich innerhalb der zweiten extrazellulären Schleife befindet. Ein weiteres Zielprotein von H. pylori HtrA (HtrAHp), welches in dieser Arbeit identifiziert wurde, ist das multifunktionelle Zellprotein Cortactin. In bereits veröffentlichten Studien der Arbeitsgruppe von Prof. Steffen Backert konnte beobachtet werden, dass Cortactin von H. pylori zum Vorteil für das Bakterium manipuliert wird.
Nachdem neue Zielproteine (Occludin, Claudin-8 und Cortactin) von HtrA identifiziert wurden, sollte deren Funktion während der Infektion mit den Pathogenen genauer untersucht werden. Zunächst wurde dazu in dieser Arbeit die CRISPR/Cas9 Methode im Labor etabliert. Mit Hilfe dieser Methode konnte sowohl ein knockout in Occludin als auch in Cortactin in polarisierten Caco 2 Zellen generiert und darüber hinaus ein Einfluss beider Proteine auf die Infektion beobachtet werden. Zudem konnte hinsichtlich des Occludins gezeigt werden, dass andere TJ Proteine die Funktion von Occludin im Epithel übernehmen können, wenn dieses deletiert vorliegt.
Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Cortactin sowohl mit dem TJ Protein ZO 1 als auch mit der Kinase Par1b/MARK2 einen Komplex bildet. Diese Komplexbildung wird jeweils in der Infektion mit H. pylori verstärkt, wodurch sich das Bakterium einen Vorteil verschafft. Das Pathogen gelangt zum einen leichter an wichtige Nährstoffe, die im Lumen nicht verfügbar sind (Eisen (Fe3+)), was eine Langzeitkolonisierung des Epithels begünstigt und zum anderen wird die Permeabilität zwischen benachbarten Zellen erhöht, wodurch es dem Bakterium vereinfacht wird, an seine basal liegenden Rezeptoren zu gelangen
Classification of Helicobacter pylori virulence factors: Is CagA a toxin or not?
No full textSince its discovery, Helicobacter pylori has been identified as the causative agent of various gastric diseases. H. pylori produces myriads of diseaseassociated virulence factors. These bacterial determinants can be distinguished as cell-binding factors, immunoregulatory components, survival factors, toxins, and effector proteins. For most of these factors there is consensus about their classification. However, there is a strong dispute in the literature as to whether one of the best-studied factors, CagA, represents a toxin or not. CagA displays unique functions that are clearly different from conventional toxins, and CagA counteracts the activities of an established H. pylori toxin, VacA. Canonical toxins commonly have specific (and narrow) targets, can act even in the absence of the bacterial cell, and elicit acute damage to host cells. However, there is still no agreement on the classification of CagA. Here we discuss whether CagA acts as a toxin, and propose a classification consensus for CagA
Cell Communication and Signaling / The functional interplay of Helicobacter pylori factors with gastric epithelial cells induces a multi-step process in pathogenesis
No full textInfections with the human pathogen Helicobacter pylori (H. pylori) can lead to severe gastric diseases ranging from chronic gastritis and ulceration to neoplastic changes in the stomach. Development and progress of H. pylori-associated disorders are determined by multifarious bacterial factors. Many of them interact directly with host cells or require specific receptors, while others enter the host cytoplasm to derail cellular functions. Several adhesins (e.g. BabA, SabA, AlpA/B, or OipA) establish close contact with the gastric epithelium as an important first step in persistent colonization. Soluble H. pylori factors (e.g. urease, VacA, or HtrA) have been suggested to alter cell survival and intercellular adhesions. Via a type IV secretion system (T4SS), H. pylori also translocates the effector cytotoxin-associated gene A (CagA) and peptidoglycan directly into the host cytoplasm, where cancer- and inflammation-associated signal transduction pathways can be deregulated. Through these manifold possibilities of interaction with host cells, H. pylori interferes with the complex signal transduction networks in its host and mediates a multi-step pathogenesis.Gernot Posselt, Steffen Backert and Silja Wessle
The Cag pathogenicity island and interaction between TLR 2/ NOD 2 and NLRP 3 regulate IL ‐1β production in Helicobacter pylori infected dendritic cells
No full textPeer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/100315/1/eji2723.pd
Rolle verschiedener sekretierter oder translokalisierter Effektormoleküle des gastrischen Pahogens Helicobacter pylori
No full textH. pylori is estimated to colonize the human stomach in almost 50% of the world population and has established itself as survival specialist by avoiding host cell recognition and elimination. Pathologic effects due to its persistence are depending on a multitude of host-pathogen interactions and infection may develop from simple symptoms to chronic gastritis, peptic ulcer or even cancer formation. More virulent strains of H. pylori encode a type IV secretion system (T4SS) able to translocate the effector protein CagA into gastric epithelial cells. Upon its delivery CagA undergoes tyrosine phosphorylation at specific sequence motifs identified as EPIYA-sites (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala), termed A, B and C in Western- and A, B and D in East Asian-type strains. This tyrosine phosphorylation is mediated by Src and Abl host kinases. The phosphorylated EPIYA-sequence sites are able to recruit host signaling factors of various SH2-domain containing human proteins to highjack downstream signaling cascades for its own benefit. By now, tyrosine phosphorylation patterns of CagA were mainly based on the use of pan-phosphotyrosine-antibodies that originally were developed for recognition of mammalian proteins. Systematic studies on recognition patterns of the different phosphorylated-EPIYA motifs by the different antibodies were so far missing. By synthesis of phospho- and non-phosphopeptides derived from the Western and East Asian CagA EPIYA-motifs seven different commercially available pan-phosphotyrosine antibodies were tested for their recognition capability by Western blotting. The results indicated that a total of 9 to 11 amino acids are sufficient to detect phosphopeptides with high specificity. In addition, infection studies using diverse representative strains of Western and East Asian H. pylori were performed and revealed great variability in recognition capability. The obtained data thus allow valuable insights in tyrosine phosphorylation and improve current knowledge of CagA phosphorylation patterns.
Interestingly, the persistent infection of H. pylori was not only implicated in gastric disease development, but was also linked to allergic and chronic inflammatory disease protection. The proinflammatory cytokine IL-1β plays a major role in disease outcome and is the result of inflammasome activation and processing by caspase-1. The assembly of the inflammasome, a multi-protein complex, is important in recognition of pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and activation of the inflammatory response. IL-1β and IL-18 processing and secretion are major events implicated in gastric inflammation and carcinogenesis mediated by the inflammasome. In murine BMDCs (bone marrow derived dendritic cells) it was found that inflammasome activation by H. pylori requires NLRP3, a cytosolic Nod (nucleotide-binding oligomerization domain)-like pyrin domain containing sensor protein and TLR2 (Toll-like receptor 2) mediated signaling. In this context, the urease B subunit of H. pylori was identified to be involved in the NLRP3 inflammasome activation triggered via TLR2. The ability of urease to activate TLRs on its own was thus determined using HEK (Human Embryonic Kidney)-Blue™-TLR2 and TLR4 cells in stimulation studies. Human HEK Blue™ cells represent a reporter cell line stably transfected with a secreted embryonic alkaline phosphatase gene (SEAP) under the control of a NF-κB and AP-1 promoter and the desired TLR gene to allow assessment of activation. In line with the observation of others, the experiments verified the involvement of urease in TLR2 activation by using recombinant urease B as well as urease mutant strains in stimulation studies. In addition also activation of TLR4 was detected by using recombinant urease B. So far, no other group reported about urease B involvement and TLR4 mediated activation of NF-κB as human TLR activation was not assessed in these studies. Since different LPS synthesis genes were identified to play a role in pro-IL-1β processing and associated inflammasome activation as well, the involvement of three different genes, namely LPS-1,2-glycosyltransferase (HPG27_146 or HP0159), mannose-6-phosphate isomerase (HPG27_38 or HP0043) and GDP-D-mannose dehydratase (HPG27_39 or HP044) were investigated in HEK-Blue™-IL-1β cells and the human monocytic cell line THP-1. However, no clear conclusion could be drawn as mutation in the respective genes only showed minimal changes in IL-1β mediated NF-κB activation. However, IL-8 expression differed dependent on the used strain. The higher virulent strain of H. pylori, 7.13 resulted in lower levels of IL-8 but higher levels IL-1β while for B128 the opposite was determined. Interestingly, the two strains differ largely in the pathology they are causing, where B128 only results in mild symptoms and 7.13 is involved in carcinogenesis. This increased activation of IL-1β for 7.13 implicates a possible role in inflammasome activation and IL-1β processing. To better understand the roles of the LPS genes, LPS was isolated from the wild-type and mutant strains and stained by using the ProQ® Emerald 300 LPS staining kit. This revealed that all three genes were involved in O-antigen synthesis and thus might result in the difference in proinflammatory cytokine secretions. In accordance with the cytokine expression patterns, B128 presented also with a deficient O-antigen as the LPS mutant strains in the staining experiments and thus requires additional investigation in the future.
Besides the widely studied predominant virulence factors including CagA and VacA, the plasticity region of H. pylori strains offers a new platform for identifying new strain specific interaction partners. The plasticity region comprises are variable zone of genes which was identified by comparison of complete genome sequences. One of these new factors of this region is the recently discovered protein JHP940 or also termed CtkA for cell translocating kinase expressed by the jhp0940 gene of H. pylori strain J99. The protein was found to act as serine/threonine kinase able to induce cytokines in gastric epithelial cells and thus was investigated in more detail. In liquid culture H. pylori positive (J99 and SJM180) and negative (P1) wild-type strains were analyzed for JHP940 expression by Western blotting. In addition, secretion into the culture supernatant was identified in the CtkA positive strains J99 and SJM180. Furthermore, in in vitro tyrosine kinase assays it was shown that JHP940 acts as an auto-phosphorylating tyrosine kinase. These findings allow conclusions of the proteins’ involvement in proinflammatory signaling in the host by subversion of host signaling pathways. Overall, new information on H. pylori triggered proinflammatory stimulation and downstream signaling contributing to chronic manifestation and disease progression could be obtained by this thesis.Es wird angenommen, daß etwa 50% der Weltbevölkerung von dem im Magen angesiedelten Bakterium Helicobacter pylori befallen sind. Das Bakterium hat sich zu einem wahren Überlebenskünstler entwickelt, der gezielt die Erkennung durch das menschliche Immunsystem umgeht und dadurch seinen Fortbestand im Magen ermöglicht. Nichtsdestotrotz führt die ständige Präsenz des Bakteriums zu pathologischen Effekten die stark von Wirt-Pathogen-Interaktionen abhängen und von milden Symptomen bis zu chronischer Gastritis, Magengeschwüren oder sogar Krebs führen können. Die stark virulenten Stämme des Bakteriums besitzen ein sogenanntes Type IV-Sekretionssystem (T4SS) welches ermöglicht, dass das Effektorprotein CagA in gastrische Epithelzellen transloziert wird. Das so eingeschleuste CagA wird anschließend durch zelluläre Enzyme wie der Src- oder Abl-Kinase an spezifischen Tyrosinstellen phosphoryliert. Das phosphorylierte Tyrosin befindet sich in bestimmten Sequenzmotiven des CagA-Proteins, den EPIYA-Motiven (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala). Diese werden EPIYA-A, -B und -C in den westlichen Stämmen des Bakteriums bezeichnet, während die Stämme im fernöstlichen Raum die EPIYA-Motive A, B und D besitzen. Den phosphorylierten EPIYA-Sequenzen ist es möglich, wirtseigene Signalfaktoren von verschiedenen SH2-Domän tragenden Proteinen zu rekrutieren und damit nachgelegene Signalkaskaden für seinen eigenen Nutzen zu manipulieren. Bislang war die Erforschung dieser Tyrosinphosphorylierungen des CagA-Proteins auf die Verwendung von Pan-Phosphotyrosin-Antikörper beschränkt. Allerdings wurden diese Antikörper ursprünglich konstruiert, um die Phosphorylierung von Säugetieren und Menschen zu untersuchen. Systematische Untersuchungen zum Erkennungsmuster der verschiedenen EPIYA-Motive durch diese Antikörper wurden bislang nicht durchgeführt. Durch die Synthese von Phospho- und Nichtphospho-Peptiden, die entweder von den westlichen Stämmen der EPIYA-Sequenzen -A, -B und -C abstammen oder von den ostasiatischen EPIYA-Motiven A, B und D herrühren, konnten sieben verschiedene Pan-Phosphotyrosin-Antikörpern auf ihre Erkennungskapazität getestet werden. In Western Blot-Experimenten wurde gezeigt, dass 9 bis 11 Aminosäuren ausreichend sind, um die Phosphopeptide mit hoher Spezifität zu detektieren. Zusätzlich wurde in Infektionsstudien mit verschiedenen repräsentativen westlichen und ostasiatischen H. pylori-Stämmen die hohe Variabilität der Erkennungsmuster dieser Antikörper festgestellt. Die dadurch erhalten Erkenntnisse liefern zusätzliche wertvolle Informationen über die Tyrosinphosphorylierung von CagA und können Aufschluss über das CagA-Phosphorylierungsmuster geben.
Interessanterweise wurden neben der Virulenz des Bakteriums aber auch gewisse vorteilhafte Auswirkungen für den Wirt festgestellt, wie etwa eine verringerte Entstehung von Allergien oder chronisch-inflammatorische Erkrankungen wie Asthma. Das pro-inflammatorische Zytokin IL-1β etwa spielt eine maßgebende Rolle in der Pathogenese, das auf der Aktivierung des Inflammasomes und der Caspase-1 beruht. Die Bildung des Inflammasoms, ein Multiproteinkomplex, ist wichtig in der Erfassung von sogenannten PAMPs (pathogen associated molecular patterns), pathogen assoziierte molekularen Muster oder Signaturen und der Aktivierung des Entzündungsprozesses. Die IL-1β- und IL-18-Aktivierung und -Sekretion, die vom Inflammasome initiiert wird, sind dabei entscheidende Abläufe in der Entzündungs- und Krebsentstehung des Patienten. In dendritischen Mauszellen wurde festgestellt, dass die Aktivierung des Inflammasoms durch H. pylori auf NLRP3, ein im Zytosol befindliches Nod ((Nucleodide oligomerisation domain)-like pyrin domain)-Sensorprotein beruht und über TLR2 (Toll-like Rezeptor) vermittelte Signalwege benötigt. Es wurde festgestellt, dass die Urease B-Untereinheit von H. pylori über TLR2 an der NLRP3-Inflammasome Aktivierung involviert ist. Das Vermögen der Urease Toll-like Rezeptoren zu aktivieren wurde deshalb in Reporterzelllinien getestet. Dazu wurden HEK (Human Embryonic Kidney cells)-Blue™-TLR2- und TLR4-Reporterzellen, welche stabil mit einem Phosphatase-Gen (SEAP, secreted embryonic alkaline phosphatase), das unter der Kontrolle von NF-κB und AP-1 Promoter steht, und mit dem entsprechenden TLR-Gen transfiziert sind, herangezogen. In Übereinstimmung mit Beobachtungen anderer Forschungsgruppen konnte die Beteiligung der Urease an der TLR2-Aktivierung festgestellt werden. Dazu wurde neben rekombinanter Urease B auch H. pylori-Stämme, die eine Mutation im Urease-Gen tragen in Stimulationsexperimenten getestet. Allerdings wurde zusätzlich auch eine Aktivierung des TLR4 entdeckt, welche bislang noch von keiner anderen Gruppe berichtet wurde. Da auch verschieden LPS-Synthese-Gene verantwortlich für den Prozess der Pro-IL-1β-Aktivierung identifiziert wurden, wurden drei dieser Gene genauer untersucht. Die Gene, HP0159 welches für LPS-1,2-Glycosyltransferase, HP0043 das für Mannose-6-phosphate Isomerase und HP0044 das für GDP-D-Mannose Dehydratase kodiert wurden auf HEK-Blue™-IL-1β und Monozyten, (THP-1) getestet. Dabei konnten allerdings keine genaueren Rückschlüsse gezogen werden, da Mutationen in diesen Genen kaum Auswirkung auf die IL-1β-Aktivierung in Infektionsstudien zeigten. Die Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-8 und IL-1β in ELISA-Tests ergab allerdings unterschiedliche Ergebnisse, die sehr vom jeweiligen H. pylori-Stamm abhängig waren. Der stärker virulente Stamm 7.13, führte nur zu einer geringen IL-8-Expression allerdings erhöhten IL-1β-Werten. Der Stamm B128 dagegen, der nur zu milden Symptomen im Menschen führt, zeigte ein gegensätzliches Bild. Die verstärkte Aktivierung von IL-1β mit dem Stamm 7.13 impliziert eine mögliche Involvierung der Inflammasom-Aktivierung und IL-1β-Stimulierung. Zum besseren Verständnis der Rolle der verschiedenen LPS-Gene wurde deshalb LPS der mutationstragenden Stämme wie auch wild-type Stämmen isoliert und mittels ProQ® Emerald 300 LPS-Färbung untersucht. Dabei konnte die Beteiligung dieser Gene an der Synthese des O-Antigens sichtbar gemacht werden, welches möglicherweise zu den Unterschieden der pro-inflammatorischen Zytokinexpression beiträgt. Im Einklang mit den Ergebnissen der Zytokinsekretion, wies LPS des Stammes B128 auch ein größtenteils fehlendes O-Antigen auf. Um jedoch genaue Rückschlüsse des Einflusses von LPS auf die krankmachende Wirkung des Bakteriums zu erlauben, sind allerdings zusätzliche Untersuchungen notwendig.
Neben den weit erforschten Virulenzfaktoren CagA und VacA bietet die Plastizitätsregion von H. pylori eine Basis um neue stammspezifische Interaktionspartner und Faktoren zu entdecken. Beruhend auf Genomsequenzvergleichsdaten bildet die Plastizitätsregion eine variable Zone von stammspezifischen Genen aus. Ein dort kürzlich entdeckter Faktor ist das Protein JHP940 oder auch CtkA für zelltranslozierte Kinase genannt, des H. pylori-Stamms J99. In Flüssigkulturen von H. pylori-Stämmen, die das Gen jhp0940 tragen (J99 und SJM180) konnte die Expression und Sekretion des Proteins mittels Western Blot bestimmt werden. In in vitro Tyrosin-Kinase Assays wurde außerdem die Aktivität des Proteins als autophosphorylierende Tyrosinkinase festgestellt. Diese Entdeckung erlaubt die Annahme, dass das Protein am pro-inflammatorischen Geschehen im Wirt beteiligt ist, und zu Veränderungen in Signaltransduktionswegen führen kann. Alles in allem, konnten anhand der hier erhaltenen Ergebnisse neue Informationen über die pro-inflammatorischen und pathogenen Auswirkungen durch H. pylori erzielt werden
Impact of the Gastrointestinal Microbiome in Health and Disease: Co-evolution with the Host Immune System
No full textMicrobes within the gastrointestinal tract communicate with each other and with the host, which has profound effects on health and disease development. Only now, it is becoming apparent that how and when we acquire our own unique collection of “gut microbes” and also how we choose to maintain them is fundamental to our health. Helicobacter pylori is the most common bacterial infection worldwide, colonizing around half of the world’s population, and is the major risk factor for gastric adenocarcinoma. More recently, it has also been shown to have some beneficial effects in terms of protecting against the development of other diseases. Here, we review the current knowledge on how H. pylori has shaped gastrointestinal microbiota colonization and the host immune system with specific focus on the impact of H. pylori on the various microbiome niches of the gastrointestinal tract. We discuss how the presence of H. pylori influences the physiology of three major regions within the gastrointestinal tract—specifically the oesophagus, stomach and colon. We pay particular attention to the role of H. pylori under chronic inflammatory conditions including the development of cancer. With increased incidence of diseases such as eosinophilic oesophagitis, oesophageal adenocarcinoma and squamous cell carcinoma being attributed to the decline in H. pylori, their disease pathogenesis in light of changing H. pylori colonization is also discussed.</p
Charakterisierung der anti-apoptotischen Aktivität des Coxiella burnetii Typ-IV-Effektorproteins AnkG
No full textCoxiella burnetii ist ein obligat intrazelluläres, gramnegatives Bakterium aus der Klasse der γ Proteobakterien und der Erreger der Zoonose Q-Fieber. Eine Infektion mit C. burnetii erfolgt vorwiegend über die Inhalation kontaminierter Staubpartikel und verläuft meist asymptomatisch oder mild grippeähnlich. In einigen Fällen kann sich akutes oder chronisches Q-Fieber manifestieren. Akutes Q-Fieber zeichnet sich durch grippeähnliche Symptome, atypischer Pneumonie oder Hepatitis aus. Chronisches Q-Fieber ist häufig durch Endokarditis gekennzeichnet. Während der Infektion exprimiert C. burnetii ein Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS). T4SS sind Multiproteinkomplexe durch die Bakterien Effektorproteine in die Wirtszelle translozieren können, mit dem Ziel, diese zu ihren Gunsten zu manipulieren. Das T4SS von C. burnetii ist für die intrazelluläre Replikation und das Überleben des Bakteriums essentiell und stellt somit einen wichtigen Virulenzfaktor dar. Es wurde angenommen, dass C. burnetii T4SS-Effektorproteine in die Wirtzelle transloziert, um eine erfolgreiche Infektion zu etablieren. Das erste funktionell charakterisierte T4SS-Effektorprotein von C. burnetii war AnkG. AnkG inhibiert die Wirtszellapoptose, die einen wichtigen Bestandteil des angeborenen Immunsystems darstellt.
In der vorliegenden Arbeit wurde die anti-apoptotische Aktivität des T4SS-Effektorproteins AnkG genauer untersucht. Um zu klären in welchem Zellkompartiment AnkG vorliegt, wurden Lokalisierungsstudien mit GFP- und HA-gekoppeltem AnkG durchgeführt. Es zeigte sich, dass ektopisch exprimiertes AnkG zytosolische Lokalisierung mit Assoziation zu den Mitochondrien aufweist. Nach Apoptoseinduktion migriert AnkG in den Zellkern. Die nukleäre Lokalisierung von AnkG ist essentiell für die Inhibierung der Wirtszellapoptose, da eine AnkG-Mutante, die aufgrund eines N-terminalen nuclear export signals (NES) nicht im Zellkern verbleiben kann (NES-AnkG), nicht in der Lage ist die Wirtszellapoptose zu inhibieren. Da die Interaktion mit dem Wirtszellprotein p32 mit der anti-apoptotischen Aktivität von AnkG korreliert, wurde eine funktionelle Abhängigkeit angenommen. Um dieser Vermutung nachzugehen, wurde die p32-Bindestelle identifiziert und mutiert (AnkGR22/23S). Mit Hilfe von AnkGR22/23S wurde gezeigt, dass sowohl die Lokalisierung als auch die Migration von AnkG eine intakte p32-Bindestelle voraussetzen. Mit einer weiteren Mutante, NLS-AnkGR22/23S, die nicht an p32 bindet, aber mit Hilfe eines N-terminalen nuclear localization signals (NLS) in den Zellkern migriert, wurde jedoch gezeigt, dass die Bindung an p32 keinen direkten Einfluss auf die anti-apoptotische Aktivität von AnkG hat. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die anti-apoptotische Aktivität von AnkG von einem durch Stress induzierten Transportmechanismus kontrolliert wird, der die Bindung an das Wirtszellprotein p32 voraussetzt. Außer für die Lokalisierung und Migration hat die Bindung an p32 jedoch keinen Einfluss auf die Aktivität von AnkG.
In vorangegangenen Studien konnte der für die Funktion essentielle Bereich von AnkG auf die ersten 69 Aminosäuren begrenzt werden. In dieser Arbeit sollten die funktionellen Bereiche von AnkG weiter eingegrenzt werden. Zunächst wurde die anti-apoptotische Aktivität von AnkG aus verschiedenen C. burnetii-Isolaten verglichen. Die Sequenzen von AnkG aus den Isolaten RSA943 („Nine Mile“, AnkGNM), 5J108-111 („Dugway“, AnkGDug) und Q212 („G“, AnkGG) zeigen an zwei Aminosäurepositionen Variation, wobei eine an Position 11 und somit im funktionellen N-Terminus des Proteins liegt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich bei der Aminosäure an Position 11 um eine funktionelle Aminosäure handeln könnte, da AnkGDug und AnkGG, die hier eine Leucin tragen, eine höhere anti-apoptotische Aktivität zeigen als AnkGNM, das an dieser Stelle ein Isoleucin besitzt. Weiterhin wurde eine bioanalytische Sequenzanalyse durchgeführt. Die Analyse ergab, dass sich am N-Terminus von AnkG, zwischen Aminosäure 1 bis 5 ein potentielles IBM (IAP binding motif) befindet. Die Deletionsmutante AnkG6-338, der nur das potentielle IBM fehlt, zeigte eine geringere anti-apoptotische Aktivität. AnkG6-69 kann die Apoptose nicht inhibieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass es sich bei dem potentiellen IBM und einen funktionellen Bereich von AnkG handelt. IBMs sind in proapoptotischen Proteinen und aktiven Caspasen zu finden und maßgeblich bei der Apoptose beteiligt. Bisher wurden IBMs nur in pro-apoptotischen Proteinen identifiziert. AnkG ist das erste beschriebene anti-apoptotische Protein und auch das erste Effektorprotein, bei dem ein potentielles IBM identifiziert wurde. Da AnkG6-338 keinen vollständigen Funktionsverlust zeigt, ist es möglich, dass AnkG neben dem IBM noch einen weiteren funktionellen Bereich besitzt, der bisher noch nicht identifiziert werden konnte.
Da p32 nicht den eigentlichen Interaktionspartner für die Inhibierung der Apoptose darstellt, wurde vermutet, dass weitere AnkG-Zielproteinen existieren. Mittels eines Y2H-screens wurde das Wirtszellprotein UBC9 als potenzieller Bindepartner identifiziert. UBC9 ist ein SUMO1 E2-Enzym und maßgeblich an SUMO1-regulierten Zellprozessen beteiligt. Die SUMOylierung von Proteinen spielt in verschiedenen Zellprozessen, unter anderem der Apoptose eine wichtige Rolle. Auch UBC9 wurde in mehreren Fällen als anti-apoptotisches Protein beschrieben
Cell Communication and Signaling / Transmigration route of Campylobacter jejuni across polarized intestinal epithelial cells: paracellular, transcellular or both?
No full textAbstract: Intact intercellular junctions and cellular matrix contacts are crucial structural components for the formation and >maintenance of epithelial barrier functions in humans to control the commensal flora and protect against intruding microbes. Campylobacter jejuni is one of the most important zoonotic pathogens causing food-borne gastroenteritis and potentially more severe diseases such as reactive arthritis or Guillain–Barré syndrome. Crossing the intestinal epithelial barrier and host cell invasion by C. jejuni are considered to represent the primary reasons of gut tissue damage in humans and various animal model systems including monkeys, piglets, rabbits, hamsters and ferrets. C. jejuni is also able to invade underlying tissues such as the lamina propria, can enter the bloodstream, and possibly reach distinct organs such as spleen, liver or mesenteric lymph nodes. However, the molecular mechanisms as well as major bacterial and host cell factors involved in these activities are poorly understood. Various models exist by which the pathogen can trigger its own transmigration across polarized intestinal epithelial cells in vitro, the paracellular and/or transcellular mechanism. Recent studies suggest that bacterial factors such as flagellum, serine protease HtrA and lipooligosaccharide LOS may play an active role in bacterial transmigration. Here we review our knowledge on transmigration of C. jejuni as well as some other Campylobacter species, and discuss the pros and cons for the route(s) taken to travel across polarized epithelial cell monolayers. These studies provide fresh insights into the infection strategies employed by this important pathogen.Steffen Backert, Manja Boehm, Silja Wessler and Nicole Tegtmeye
Helicobacter pylori and Extragastric Diseases
No full textThe Gram-negative bacterium Helicobacter pylori is predominantly known for its tight association with peptic ulcer disease and gastric cancer development. However, recent epidemiological and experimental evidence suggests that chronic infection with H. pylori may at the same time be beneficial to the host by conferring protection against gastroesophageal diseases, asthma, other allergic disease manifestations and inflammatory bowel diseases (IBD). In this chapter, we summarize the epidemiological data that are available to date to support or refute a possible inverse correlation of H. pylori infection with various extragastric diseases. We further examine and discuss the experimental evidence, generated mostly in mouse models of allergic diseases and IBD, showing that these disorders fail to develop in the presence of H. pylori. The proposed mechanisms of the protective effects of H. pylori, which appear to involve the induction of regulatory T-cells (Tregs) with highly suppressive activity, are presented and explained
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