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Recovery of acid proteases from fishery discards with aqueous micellar two-phase systems and their use for X-ray film recycling
No full textThe continuous expansion of fish production results in increasing amounts of discards, i.e. viscera, skin and frame, whose inappropriate disposal causes environmental damage. Conversion of this waste into value-added products is one of the best alternatives to reduce the pollution problem. The feasibility of using aqueous micellar two-phase systems (AMTPS), formed by biodegradable Genapol X-080 (GX-080) and sodium citrate, to recover valued acid proteases from surubí (Pseudoplatystoma sp) fishery discards was evaluated for the first time. The effects of biomass load, pH and surfactant concentration on the extraction were analyzed using a two-level full factorial design. GX-080 concentration and biomass load were the most significant factors (p < 0.05). AMTPS formed by GX-080 4% w/w showed a successful performance for the recovering of 69% of AP from the crude extract in the surfactant-rich phase with a purification factor of 1.83. Regard to the storage stability, this extract conserved at least 89% of its proteolytic activity for 76 days at 0 °C. It also showed a notable hydrolyzing activity of the gelatin-silver coating of used X-ray films, thus opening new perspectives on the use of acid proteases for recycling purposes.Fil: Acevedo Gomez, Antonella Valeria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Bustillo, Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Nerli, Bibiana Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos Rosario; Argentin
Actividad antimicrobiana de una PLA2 básica aislada del veneno de Bothrops diporus
No full textLa Organización Mundial de la Salud ha enfatizado la necesidad de nuevos medicamentos para combatir la resistencia bacteriana a
los antibióticos. Esto ha provocado una búsqueda de nuevos agentes terapéuticos de diversas fuentes naturales, como proteínas y
péptidos con potente actividad antimicrobiana de organismos secretores. En nuestro país una de las serpientes venenosas de mayor
importancia médica es Bothrops diporus ("yarará chica"). Su veneno ha demostrado tener efecto inhibitorio sobre numerosas cepas
gram positivas y negativas, sin embargo, no se ha estudiado previamente esta actividad con las toxinas purificadas. Es por ello que,
el objetivo de este trabajo fue estudiar el potencial efecto antimicrobiano de una PLA2 básica aislada del veneno de B. diporus sobre
una cepa de Staphylococcus aureus.
Se trabajó con un pool de venenos desecados, homogeneizados y conservado a –20oC. El aislamiento y purificación de la enzima
PLA2 se llevó a cabo en dos etapas; una cromatografía de intercambio iónico (Sulfopropil-celulosa), y una cromatografía de
exclusión molecular (Sephadex G75). A cada fracción obtenida se le ensayó la actividad hemolítica indirecta, actividad proteolítica y
se estimó el peso molecular de la enzima mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). Las bacterias
Staphylococcus aureus (ATCC 25923TM), se cultivaron y repicaron en medio de agar tripticasa de soya (TSA, Britania), en
condiciones aeróbicas a 37°C. En el test de microdilución las suspensiones bacterianas se ajustaron al tubo N° 0.5 de la escala Mc
Farland (1.5 x108 ufc/mL) y se pre incubaron con igual volumen de la PLA2 en distintas concentraciones (5.5-350 μg/mL
finales). Luego de 24 h de incubación a 37°C la turbidez fue determinada a 620 nm. Se realizaron controles de crecimiento utilizando
caldo TSA en lugar de la enzima y un control de actividad inhibitoria positiva con antibiótico (Piperacilina-Tazobactam). La actividad
antibacteriana fue medida como una inhibición del aumento de la turbidez. Además, de las determinaciones que evidenciaron un
efecto inhibitorio significativo, se tomó una alícuota con ansa y se sembró en placas de agar TSA por método de dilución en placa
incubando durante 24 h a 37°C.
En cuanto a los resultados obtenidos, la primer etapa cromatográfica de intercambio iónico permitió separar y concentrar las
proteínas con carga positiva o básicas del veneno de B. diporus. Esta fracción se separó en una segunda etapa de cromatografía de
exclusión molecular logrando resolver diferentes picos proteicos. Todas las fracciones presentaron actividad hemolítica indirecta,
seleccionándose el último pico proteico por ser el único con ausencia de actividad proteolítica. Se evaluó la pureza de la enzima por
SDS-PAGE, observándose una banda homogénea con un peso molecular de ~14 kDa.
Esta PLA2 básica aislada del veneno de Bothrops diporus evidenció un efecto inhibitorio del crecimiento bacteriano dependiente de
la concentración, luego de 24 h de incubación a 37°C. El crecimiento de Staphylococcus aureus disminuyó aproximadamente un
15% con las dosis intermedias de la enzima ensayada (88, 125 y 175 μg/mL) y se pudo comprobar que con las concentraciones más
altas (250 y 350 μg/mL) se inhibió el crecimiento bacteriano en un 28% y 43% respectivamente con respecto al control de
crecimiento. La dilución en placa de la concentración más alta ensayada y con mayor efecto inhibitorio demostrado por el test de
microdilución evidenció el desarrollo de un menor número de colonias con respecto al control.
Estudios previos han reportado coincidentemente que varias PLA2 aisladas del género Bothrops poseen actividad antimicrobiana
frente a las cepas de S. aureus. Estos resultados preliminares sientan base en el estudio de la PLA2 aislada de B. diporus como
potencial prototipo de antibiótico
Efecto inhibitorio sobre la adhesión de células tumorales de una fosfolipasa A2 (PLA2) aislada del veneno de Bothrops alternatus
No full textEl cáncer es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. La diseminación de células cancerosas desde el
tumor primario (metástasis) es la principal causa de mortalidad en estos pacientes. Las células metastásicas pasan por cuatro
procesos esenciales: desprendimiento, migración, invasión y adhesión celular.
En el nordeste argentino, Bothrops alternatus (yarará grande) es una de las especies de serpientes más distribuidas. Entre los
componentes principales de su veneno se encuentran las fosfolipasas A2 (PLA2). Previamente se ha logrado aislar y caracterizar
una PLA2 acídica de este veneno que demostró no ser miotóxica in vivo o in vitro. El hecho de que esta toxina acídica aislada del
veneno de yarará grande no sea citotóxica per se y la potencial unión con integrinas alfa v beta 3, demostrada por estudios teóricos
in silico, hicieron de esta toxina un blanco interesante para evaluar su potencial efecto inhibitorio sobre la adhesión de células
tumorales de la línea LM3. Para ello en primer lugar se aisló una PLA2 acídica del veneno de Bothrops alternatus (30mg) mediante
dos etapas cromatográficas, una cromatografía de intercambio iónico (DEAE) y una segunda cromatografía de exclusión molecular
(Sephadex G-75). Ensayos de actividad proteolítica, actividad hemolítica indirecta y SDS-PAGE se realizaron para control de su
pureza. Una vez obtenida la enzima, se evaluó su citotoxicidad (3h - 95, 190 y 380 μg/mL) sobre las células de la línea tumoral LM3
en DMEM-5% SFB a 37°C-5% CO2. Para el ensayo de inhibición de la adhesión, las células fueron pre-incubadas por 30 min a
37°C con las concentraciones no-citotóxicas de la PLA2 o en medio de cultivo (control) y sembradas en placas de 96 wells. Luego de
1.5h, las células no adheridas fueron removidas con un lavado suave con buffer fosfato. Las células adheridas fueron fijadas y
coloreadas con el colorante cristal violeta. El porcentaje de adhesión fue determinado por comparación de las absorbancias leídas
(620nm) con las del promedio de los controles, considerado como 100% de adhesión.
Los resultados mostraron que, en primer lugar se logró aislar una PLA2 acídica del veneno de B. alternatus de aproximadamente 28
KDa. A los tiempos y concentraciones ensayadas no evidenció ser citotóxica sobre las células de la línea LM3. Utilizando estas
concentraciones no citotóxicas, demostró inhibir la adhesión celular de forma dosis dependiente. La disminución en la adhesión se
observó a partir de concentraciones superiores a 190 μg/mL, inhibiendo en aproximadamente un 40% este proceso celular con la
máxima dosis ensayada (380 μg/mL).
En conclusión, la fosfolipasa A2 (PLA2) acídica aislada del veneno de Bothrops alternatus (yarará grande) inhibe la adhesión de
células tumorales in vitro de manera dosis dependiente. Si bien es necesario realizar más estudios, estos hallazgos sugieren el uso
potencial de esta toxina como prototipo de droga con efecto antitumoral
Potencial aplicación en técnicas de cultivo celular del colágeno obtenido de la piel de surubí
No full textEl colágeno se emplea en la fabricación de alimentos, productos cosméticos, farmacéuticos y en la industria biomédica debido a su
versatilidad, biocompatibilidad y biodegradabilidad. En las últimas décadas el colágeno proveniente de animales acuáticos ha
concitado un gran interés, siendo numerosos los estudios publicados sobre su extracción y caracterización. Entre otras propiedades
interesantes que posee, ha demostrado ser una alternativa al colágeno extraído de mamíferos en diversas aplicaciones biomédicas.
La fuente principal del colágeno de animales acuáticos es la piel, subproducto abundante de la industrialización del pescado. En el
NEA se producen 74 tn de surubí cuyo procesamiento genera subproductos que podrían transformarse en productos de valor
agregado, contribuyendo a la disminución de los problemas ambientales asociados a su deposición final y aumentando el retorno
económico de las industrias procesadoras de pescado. En este sentido, el colágeno es la proteína de la matriz extracelular más
usada para el cultivo celular puesto que facilita la fijación celular, el crecimiento, la diferenciación, la migración y la morfogénesis del
tejido. En estas técnicas se emplean matrices naturales o artificiales que permiten desarrollar cultivos tridimensionales, siendo la más
utilizada la matriz de colágeno. Así, el objetivo de este trabajo fue obtener colágeno de la piel de surubí pintado utilizando un extracto
con actividad pepsina y evaluar la formación de geles para ser empleados en técnicas de cultivo celular. Las vísceras y la piel de
ejemplares de surubí (P. corruscans) fueron suministrados por miembros del SIVEP y almacenados a -20°C hasta su utilización. El
extracto crudo rico en pepsina (EC) se preparó por disgregación mecánica del estómago de surubí empleando buffer fosfato 50mM
pH 7 (1g tejido/5mL), se centrifugó, el sobrenadante se liofilizó y se conservó a -20°C hasta su utilización. La extracción de colágeno
de la piel de surubí (CS) se realizó mediante adición del EC (10 U/g de piel) durante 72h. El CS se secó empleando una bomba de
vacío y el sólido obtenido se reservó a -20°C hasta su utilización. Se cuantificó el contenido de hidroxiprolina y el patrón de proteínas
(SDS-PAGE) del CS. Se prepararon soluciones de CS en ácido acético 0,5M (5mg/mL), se esterilizaron con filtros de 0,22μm. Para
la formación de geles en baño de hielo se mezclaron en proporción 8:1 solución de CS estéril:10X (DMEM) y se llevó a pH 7 con
NaOH 0,1M. Se sembraron 500 uL de la mezcla por pocillo en placas para cultivo celular de 24 wells. La polimerización se realizó en
un incubador de CO2 durante 24h a 37°C. Como patrón se utilizó el colágeno comercial bovino (CB). En el SDS-PAGE se observó
que el CS presenta un patrón de bandas análogo al descripto para el colágeno tipo I, compuesto por cadenas por cadenas alfa y
beta. La cuantificación de hidroxipolina y contenido de colágeno determinó que las soluciones reconstituidas de CS de 5,71mg/mL
contenían 0,20±0,01 mg/mL y 1,62±0,07mg/mL de hidroxiprolina y colágeno. Demostrando que el 28,4% del CS corresponde
efectivamente a colágeno y la muestra está acompañada de impurezas no detectables mediante SDS-PAGE. El CS fue capaz de
formar geles a las 24h en condiciones de pH y temperatura estándares utilizadas en cultivo celular. La adición de medio de cultivo
(DMEM) no alteró la estabilidad de la matriz y los geles se mantuvieron intactos en la parte inferior de cada well. La observación
macroscópica no evidenció diferencias entre los geles formados con CS y el CB. En la microscopía de contraste de fases se observó
una menor densidad de entrecruzamiento en el gel formado por el CS. Al emplear pepsina es posible que ésta digiera el colágeno
hasta cierto punto, conduciendo a una disminución significativa de la actividad de reticulación de las fibras nativas. Si bien estos
resultados son preliminares, la utilización del colágeno de surubí para la formación de geles y matrices en condiciones adecuadas de
esterilidad resulta una línea de gran interés para las técnicas de cultivos celulares. Además, la utilización de un subproducto
abundante como la piel del surubí para la obtención de una molécula de alta demanda como el colágeno mediante una metodología
sencilla podría potenciar la producción ictícola de la región y generar nuevas cadenas de valor
Efecto del veneno de Bothrops diporus sobre el sistema vascular de embriones de Gallus gallus domesticus
No full textEn el nordeste argentino la gran mayoría de los envenenamientos por mordedura de serpiente son causados por Bothrops diporus
"yarará chica". Es un vipérido distribuido desde el suroeste de Brasil a través de Paraguay hasta el centro de Argentina. Su veneno
está compuesto principalmente por metaloproteasas de tipo PI y PIII (SVMP), fosfolipasas A2 (PLA2s), serinoproteasas (SVSP),
L-aminoácido-oxidasas (LAOs) y péptidos vasoactivos responsables de sus efectos proteolíticos, hemorrágicos y miotóxicos. El
sistema vascular del embrión de pollo (G. g. domesticus), está formado por el corazón y los vasos sanguíneos intraembrionarios y
extraembrionarios (membranas corioalantoideas (CAM) y del saco vitelino). Tanto los ensayos realizados en CAM como las pruebas
de detección de embriotoxicidad, utilizan este modelo animal. Se ha demostrado que las vías responsables de la receptividad del
dolor no se forman por completo hasta el día 13 del desarrollo, por lo que el uso de embriones de pollo desde el día embrionario 0
hasta el día 9 previenen el sufrimiento de los animales en este modelo. Así, este modelo embrionario aplicado a la investigación
toxicológica, es un modelo alternativo apropiado en relación con los principios de las 3R (reemplazo, reducción y refinamiento). El
objetivo de este trabajo fue revelar los cambios a nivel microscópico inducidos por el veneno de B. diporus en el sistema vascular de
embriones de pollo, corazón y membranas corioalantoideas. Se trabajó con un pool de venenos desecados, homogeneizados y
conservado en a –20oC hasta el momento de ser utilizado en los ensayos. Los huevos de G. g. domesticus se limpiaron con etanol
70% y se incubaron durante cinco días a 37 °C y 60% de humedad. Se realizó rotación periódica de los huevos para prevenir la
adhesión de los embriones a las membranas. La fertilidad de los huevos se corroboró mediante el método de inspección a trasluz en
ovoscopio. Únicamente los óvulos fecundados con embriones vivos y en desarrollo se seleccionaron como modelo animal. En el día
5 de incubación los huevos fueron retirados de la incubadora y los extremos se limpiaron nuevamente con etanol 70% luego se les
practicó un orificio de 0,5 x 0,5 cm en el extremo romo de la cáscara del huevo directamente por encima del embrión, se les inyectó 1
mL de una solución de veneno de B. diporus (1mg/mL) y se cubrió el orificio con papel Parafilm. Este procedimiento se realizó por
triplicado (n=3 huevos). A los huevos utilizados como controles se les inyectó solución fisiológica estéril y se los colocaron
nuevamente en incubadora. A las 48 h posteriores a la inoculación del veneno se quitó el papel parafilm, se agrandaron los orificios y
los embriones fueron retirados de los huevos. La embriotoxicidad del veneno en embriones de pollo se analizó mediante evaluación
histológica. Para ello, se realizaron preparados con los embriones de G. g. domesticus y sus membranas extraembrionarias,
siguiendo las técnicas convencionales de deshidratación, inclusión de cortes y coloración. Se realizó la inclusión en butilo-parafina y
las secciones fueron obtenidas con micrótomo, se observó por microscopía y se registraron imágenes. El veneno de Bothrops
diporus es altamente proteolítico, hemorrágico y miotóxico. Estos efectos se deben principalmente a las metaloproteasas (SVMPs) y
las fosfolipasas A2 (PLA2s). Las SVMPs inducen hemorragia, ampollas, dermonecrosis y degradación de los componentes de la
matriz extracelular y proteínas de las membranas celulares. Las PLA2s inducen mionecrosis y también afectan los vasos linfáticos.
Esta alteración tan importante del sistema vascular contribuye a la isquemia y posterior necrosis del tejido. En este sentido,
específicamente en el tejido cardiaco de la región auricular se apreció desorganización y espacios de pérdida de las fibras
musculares. Los capilares se observaron con abundantes prolongaciones y la luz parcialmente ocluida, el grosor de la pared
endotelial es variable con núcleos picnóticos. En la región ventricular se observaron áreas de necrosis de las fibras musculares e
infiltrado. A nivel de las membranas corioalantoideas se pudo observar un aumento en el grosor del capilar, acompañado por una
acidofília citoplasmática. El daño vascular endotelial ocasionó un intenso edema, los cuales pueden asociarse a fenómenos
hipóxicos, y estos a su vez, a procesos isquémicos que generarían la muerte celular. En conclusión, el veneno de Bothrops diporus
induce alteraciones en el sistema vascular del embrión de Gallus gallus domesticus que contribuyen en la intoxicación a la isquemia
y necrosis del tejido
Efectos inflamatorios de isoformas de fosfolipasas A2 aisladas del veneno de Bothrops diporus
No full textBothrops diporus también conocida como “yarará chica” es una serpiente distribuida desde el suroeste de Brasil, a través de
Paraguay hasta el centro de Argentina. Además de sus efectos sistémicos, el veneno de esta especie induce un importante daño
tisular local caracterizado por mionecrosis, hemorragia, ampollas y edema. El proteoma de este veneno ha demostrado la presencia
mayoritaria de fosfolipasas A2 (PLA2s) (24.1% del total de proteínas). Estas toxinas son clave en los efectos inflamatorios inducidos
en el envenenamiento botrópico, caracterizados por la activación de células inmunes innatas y células endoteliales y la liberación de
varios mediadores inflamatorios que interfieren en la dinámica vascular. Estos mediadores inflamatorios, incluyen citoquinas,
quimiocinas, aminas vasoactivas y eicosanoides producidos por componentes plasmáticos o liberados en las proximidades de la
lesión por células endoteliales, leucocitos del tejido (mastocitos), macrófagos y leucocitos infiltrados. Si bien se ha demostrado
previamente la actividad inflamatoria de otras PLA2s de venenos botrópicos , no se ha evaluado previamente el efecto de estas
toxinas aisladas del veneno de yarará chica en la secreción de mediadores inflamatorios. Es por ello que el objetivo del presente
trabajo fue evaluar por primera vez, el perfil de citoquinas secretadas por células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
incubadas con un pool de isoformas de PLA2s aisladas del veneno de B. diporus. La importancia de estos estudios radica en
comprender los mecanismos inflamatorios locales desencadenados que podrían conducir al descubrimiento de nuevas dianas
terapéuticas para un tratamiento más eficaz en el envenenamiento por serpientes botrópicas. Se trabajó con un pool de venenos de
especímenes adultos de ambos sexos de B. diporus proporcionado por el Centro de Producción de Suero Antiofídico (CEPSAN) del
Ministerio de Producción de la Provincia de Corrientes. El mismo fue desecado, homogeneizado y conservado en freezer a –20oC.
Para el aislamiento de fosfolipasas A2, se disolvieron alícuotas de veneno (1,8–2,0 mg) en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %
(solvente A), se centrifugaron para eliminar los desechos y se separaron mediante RP-HPLC en una columna C18 (4,6 × 250 mm,
partículas de 5 um), utilizando un cromatógrafo de líquidos de alta resolución Agilent 1220 con detección a 215 nm. La elución se
realizó utilizando un gradiente de disolvente B (acetonitrilo con TFA al 0,1%) de 0 a 70 % en un caudal de a 1 ml/min. Las fracciones
de interés (en la región de elución de las PLA2) se recolectaron, se liofilizaron y se almacenaron a -20 °C hasta su análisis. Las
concentraciones de proteína se estimaron midiendo la absorbancia a 280 nm. Su masa molecular se determinó por espectrometría
de masas (MALDI-TOF MS, Shimadzu). Las Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se obtuvieron de tres donantes
sanos. Las PBMC se cultivaron en medio RPMI suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10 % y se incubaron a 37 °C con 5%
de CO2. Para la detección de Citoquinas se utilizó la tecnología IsoPlexis-CodePlex. Brevemente, se pre-incubaron 1x106 PBMC
con 25 ug de un pool de las isoformas de PLA2 aisladas del veneno de B. diporus. Luego de 4, 10 y 24h a 37°C y 5% de CO2, se
centrifugó y se recolectaron los sobrenadantes para la medición de citoquinas secretadas. Para ello, se seleccionó el panel “Human
Adaptive Immune” que evaluó: GM-CSF, Granzyme B, IFN-gamma, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17A,
IP-10, MCP-1, MIP-alfa, MIP-beta, Perforin, sCD137, TNF-alfa, TNF-beta. Se sembraron 11 uL de los sobrenadantes en los chips
CodePlex y se insertaron en el sistema IsoLight para luego analizar los datos con el software IsoSpeak. Los ensayos se realizaron
por duplicado. El perfil de HPLC del veneno de B. diporus presentó picos proteicos significativos a los 51–56 min de elución, región
cromatográfica donde comúnmente se encuentran las PLA2 de los venenos ofídicos. Se seleccionaron y recolectaron estas
fracciones que se denominaron picos 1, 2, 3, 4, y 5, Se terminó por espectrometría de masas, una masa molecular promedio de
13-14 kDa correspondientes a isoformas de PLA2. Utilizando la tecnología de Isoplexis-Codeplex se pudo determinar que las PBMC
humanas incubadas con 25 ug/mL de un pool de las isoformas de PLA2 aisladas mostraron principalmente incrementos en los
niveles de citoquinas pro-inflamatorias, en comparación al control sin estimular, a los tres tiempos evaluados. Sin embargo, la mayor
expresión se evidenció luego de 4h de incubación con una mayor intensidad de señal esencialmente de los mediadores
pro-inflamatorios TNF-alfa, TNF-beta, IL-2, IL-7, IL-17, INFgamma, Granzyma B, MIP1-alfa, MIP1-beta, MCP1 y únicamente
detectándose una sobreexpresión de IL-13, GM-CSF y de IL-5 como mediadores anti-inflamatorios posiblemente como un
mecanismo de contrarregulación. Resultados similares se obtuvieron por ejemplo con una PLA2 aislada del veneno de Bothrops
leucurus que indujo la secreción de citoquinas pro-inflamatorias en PBMC sin ninguna variación en los niveles de citoquinas
anti-inflamatorias. Como así también, isoformas de PLA2 (Lys-49 y Asp-49) aisladas del veneno de Bothrops asper y Bothrops
pauloensis, que incrementaron los niveles de citoquinas proinflamatorias como IL-6 y TNF-alfa. Estos resultados preliminares,
sientan base en el estudio y comprensión de los eventos inflamatorios desencadenados en el accidente ofídico causado por B.
diporus para el potencial descubrimiento de nuevos blancos terapéuticos
Effect of Bothrops diporus venom on the vascular system of Gallus gallus domesticus embryos
No full textThe majority of snakebites in northeastern Argentina are caused by Bothrops diporus (yarará chica). Envenomation causes predominantly local myotoxicity, characterized by myonecrosis often associated with hemorrhage, blistering and edema. The venom proteome of this snake comprises PI- and PIII-SVMPs, PLA2 molecules, BPP-like peptides, L-amino acid oxidase and serine proteinases. The aim of this work was to evaluate the changes induced by B. diporus venom in the vascular system of chicken. Briefly, fertilized chicken eggs of Gallus gallus domesticus were obtained from ?La Elina? establishment, disinfected and then incubated at 37°C and 65% relative humidity. The viability of the embryos and the vasculature of the CAM were visually inspected. An opening on the apex of the eggs was made on day 8, venom solution (1 mg/mL) was injected and then sealed with parafilm to avoid contamination and desiccation. Controls were injected with sterile physiological solution. After 48h incubation, parafilm paper was removed, the orifices were enlarged and embryos were removed. The embryotoxicity of the venom was analysed by histological evaluation. Histopathological evaluation evidenced, specifically in the cardiac tissue of the atrial region, disorganization and spaces of loss of muscle fibers. The capillaries showed abundant prolongations and the light partially occluded, the thickness of the endothelial wall was variable. In the ventricular region, areas of muscle fiber necrosis and infiltrate were observed. At the level of the chorioallantoic membranes an increase in capillary thickness was observed, accompanied by cytoplasmic acidophilicity. Endothelial vascular damage caused intense edema, which can be associated with hypoxic phenomena and ischemic processes that would generate cell death. In conclusion, Bothrops diporus venom induces alterations in the vascular system of the G. g. domesticus embryo that contribute to tissue ischemia and necrosis intoxication.Fil: Sasovsky, Daniela Jaqueline. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas Naturales y Agrimensura. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; ArgentinaFil: Olea, Gabriela Beatriz. Universidad Nacional del Nordeste; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste; ArgentinaFil: Bustillo, Soledad. Universidad Nacional del Nordeste; Argentina8 th International Toxinology MeetingOxfordInglaterraLibPubMedi
Implementación del estudio de casos como estrategia de prevención de la responsabilidad penal en los estudiantes de las instituciones educativas oficiales del municipio de Soledad
No full textThe problems in the Municipality of Soledad by minors and adolescents in their behaviors of rebellion, irresponsibility, aggressiveness, which often culminate in inappropriate or criminal behavior, are consequences of measures of assurance with or deprivation of liberty; situations that are reflected and evidenced in the Official Educational Institutions affecting the School coexistence and exposing the other students at risk; it is for this reason that the Rectors and the administrative authorities are jointly with the educational community to implement strategies for the social and school impact that this problem generates and that with the passage of the years has been increasing by leaps and bounds, by itself, with the implementation of this Project through the teaching of Criminal Responsibility to the student to be aware of their actions, to know their consequences, to strengthen the values and to acquire the ability to discern in the resolution conflicts in a favorable and that because they are minors and adolescents the best way to do through the didactics as a stimulating pedagogic strategy, great impact, innovative that strengthens the citizen competences of Coexistence and Peace, Participation and democratic Responsibility Plurality, identity and valuation of differences; in order to strengthen the learning of the healthy coexistence and good school behavior of the students of the Official Educational Institutions of the Municipality of Soledad.La Problemática existente en el Municipio de Soledad por parte de los menores y adolescente en sus comportamientos de rebeldía, irresponsabilidad, agresividad, que muchas veces culminan conductas inapropiadas o delictivas traen como consecuencias medidas de aseguramiento con o sin privación de la libertad; situaciones que se reflejan y evidencian en las Instituciones Educativas Oficiales afectando la Convivencia escolar y exponiendo en riesgo a los demás estudiantes; es por ello, que los Rectores como autoridades administrativas deben de manera conjunta con la comunidad educativa implementar estrategias para mitigar el impacto social y escolar que esta problemática genera y que con el transcurrir de los años viene acrecentándose a pasos agigantados; por consiguiente, se pretende con la implementación de este Proyecto piloto que a través de la Prevención de la Responsabilidad Penal permita al estudiante ser consciente de sus actos, conocer sus consecuencias, propiciar el fortalecimiento de los valores y a adquirir la capacidad de discernir en la resolución de conflictos de manera favorable y que por tratarse de menores y adolescentes la mejor forma de hacerlo es a través de la didáctica implementando el Estudio de Casos o llamado también Método de Casos, como estrategia pedagogía estimulante, de gran impacto, innovador que fortalezca la Participación, la Responsabilidad democrática, Pluralidad, identidad y valoración de las diferencias; con el fin de fortalecer la Competencia de Convivencia y Paz Escolar de los estudiantes de las Instituciones Educativas Oficiales del Municipio de Soledad.Jurado Zabaleta, Anllyneis ElviraQuintero Bustillo, Esther Juli
Sistemas micelares biocompatibles formados por surfactantes sintéticos y biológicos: formulación, análisis y aplicaciones
No full textEl presente trabajo de tesis se centró en el desarrollo y caracterización fisicoquímica de nuevas formulaciones de micelas mixtas biocompatibles, formadas por biosurfactantes (BS) y surfactantes (SF) sintéticos no iónicos.
Inicialmente, se estudiaron las propiedades fisicoquímicas y aplicaciones de un extracto de BS del tipo lipopéptidos (LP) producido por Pseudomonas syringae pv. tabaci (PTA) en un biorreactor con columna de fraccionamiento de espumas. Tras 14 h de fermentación, se obtuvo un índice de emulsificación (IE) del 63% y una concentración de BS de 550 mg/L. La concentración micelar crítica (CMC) fue de 1.844,68 mg/L, reduciendo la tensión superficial a 30,07 mN/m. Al estudiar el efecto del pH en soluciones acuosas de citrato de sodio (NaCit), se observó una disminución significativa en la CMC, la cual disminuyó hasta 863,20 mg/L en pH 5,00 y hasta 341,98 mg/L en pH 7,00. El diámetro hidrodinámico (Dh) de los autoensamblados formados fue de 87,63 nm en agua, incrementando su valor hasta 173 nm en presencia de NaCit. Las emulsiones formadas con hidrocarburos mostraron una estabilidad superior al 90% después de 24 horas.
Posteriormente, se abordó la formulación y caracterización fisicoquímica de sistemas micelares mixtos combinando surfactantes sintéticos (SF) como Tergitol 15-S-7 (Tg7) y Genapol X-080 (GX) con biosurfactantes (BS) como ramnolípidos (RL) comerciales y extracto de LP producido en nuestro laboratorio. Se encontró que la CMC de Tg7 y GX en agua fue de 18,23 mg/L y 21,14 mg/L, respectivamente. Ambos valores disminuyeron en presencia de aniones comsmotrópicos como el NaCit. Al combinar los SF con BS, se observó sinergia en los sistemas con LP, mientras que los sistemas con RL mostraron interacciones desfavorables. Se determinó la concentración necesaria para reducir la tensión superficial en 20 mN/m (C20), con valores de 13,75 mg/L para Tg7 y 10,55 mg/L para GX en agua, mejorando en medios con NaCit y en sistemas con LP. El análisis hidrodinámico mostró un aumento en el Dh de las micelas con el pH y la presencia de NaCit, indicando la formación de estructuras más asimétricas en ambientes de alta fuerza iónica. En cuanto al potencial zeta (ζ), la adición de RL aumentó la carga negativa en pH 7,00. En cambio, los LP no modificaron significativamente el ζ. Finalmente, las curvas de coexistencia para la separación de fases revelaron que los sistemas en NaCit a pH 7,00 alcanzaron las temperaturas de separación de fase más bajas, lo que, junto con la presencia de LP, favoreció la separación de fases a menores temperaturas, lo que puede ser útil en procesos de extracción de biomoléculas y aplicaciones industriales sostenibles.
En una tercera etapa, se exploró el uso de sistemas micelares de dos fases acuosas (SMDFA) para la extracción de biomoléculas, específicamente tocoferoles (TF) y el colorante azul cibacron (AC), empleando combinaciones de SF sintéticos (Tg7 y GX) y BS (RL y LP). Los resultados mostraron que los valores de coeficiente de reparto (Kr) para AC en SMDFA sin BS fueron mayores a 5, con preferencia por la fase superior rica en micelas. La adición de RL y LP mostró efectos distintos en la extracción de AC, siendo el extracto de LP el que presentó menor eficacia, probablemente debido a su composición química. Un diseño factorial 2³ identificó las mejores condiciones extractivas para los TF, que consistieron en utilizar Tg7 al 9% p/p y RL al 0,25% p/p en NaCit 100 mM a pH 5,00 y 56°C, logrando una recuperación casi completa de TF en la fase superior, con alta actividad antioxidante. Además, se compararon dos metodologías de recuperación de TF de desodorizado de soja: saponificación modificada seguida de extracción con SMDFA y saponificación convencional seguida de extracción con solventes. La saponificación modificada seguida de extracción con SMDFA superó al método convencional, alcanzando un índice de acidez de 1,44% y una recuperación de γ-tocoferol del 91,98% en la fase superior micelar. Además, se obtuvo una alta eficiencia de asociación (94% para α-tocoferol), sugiriendo que los SMDFA también pueden mejorar la estabilidad y biodisponibilidad de los TF.
Finalmente, se evaluó la citotoxicidad y actividad antimicrobiana de los SF Tg7, GX y el extracto de LP de PTA en células eucariotas y bacterianas. En células C2C12, Tg7 y GX demostraron baja citotoxicidad a concentraciones menores de 0,05 mg/mL, mientras que el extracto LP no fue citotóxico hasta 5 mg/mL. En mezclas de surfactantes, el efecto citotóxico se atribuyó a las mayores concentraciones de Tg7 y GX. Además, se observó que el extracto LP indujo necrosis celular, confirmado mediante pruebas de morfología y liberación de LDH. En cuanto a su potencial antitumoral, el LP inhibió en un 58% la adhesión de células tumorales LM3 y en un 37% su migración, sugiriendo que puede obstaculizar la propagación de células cancerígenas. Los ensayos antimicrobianos mostraron inhibición significativa de Staphylococcus aureus con el extracto LP y otros surfactantes, mientras que no hubo actividad inhibitoria contra Escherichia coli. Estos resultados evidencian la baja citotoxicidad y el potencial del extracto LP como agente antimicrobiano y antitumoral en distintas aplicaciones biotecnológicas.Fil: Martini, Georgina. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentina
Citotoxicidad de extractos acuosos de Ipomoea carnea y su principal principio activo, swainsonina, sobre la línea celular tumoral C6
No full textLos componentes bioactivos más importantes de I. carnea son las calisteginas (A3, B1, B2, B3 y C1) y la swainsonina (SW). Este
último es un alcaloide que inhibe la acción de dos enzimas provocando una alteración en la degradación de los oligosacáridos y un
procesamiento incompleto de las glicoproteínas. Las calisteginas también son alcaloides, las cuales son potentes inhibidores de la
enzima glucosidasa. Se cree que ambos fitoconstituyentes son responsables de la enfermedad de almacenamiento lisosomal. Sin
embargo, existe cierta controversia en la literatura con respecto a la participación de estos compuestos. Por un lado, se propone que
las calisteginas no contribuyen a la toxicidad de I. carnea y, por otro lado, se demostró un síndrome neurológico asociado al
consumo de plantas que no contenían swainsonina sino sólo calisteginas. Las lesiones histológicas inducidas por esta planta se
caracterizan principalmente por la vacuolización de diferentes células, especialmente neuronas del sistema nervioso central.
También se observó necrosis neuronal, formación de esferoides axonales y astrogliosis. En este sentido, se ha confirmado que el
extracto alcaloidal de esta planta induce alteraciones morfológicas consistentes con activación glial y degeneración vacuolar en
cultivos primarios de células gliales. Es por ello que el objetivo de este trabajo fue determinar y comparar la citotoxicidad de extractos
acuosos de I. carnea y su principal principio activo, swainsonina, sobre la línea tumoral C6 y evaluar por fluorescencia los cambios
morfológicos inducidos por los extractos acuosos y la swainsonina en las células gliales.
Para la obtención del extracto acuoso vegetal (EA) se maceraron hojas secas en etanol al 96%, tras la evaporación total a presión
reducida a 50oC se suspendieron en agua para eliminar el residuo ceroso y se extrajo consecutivamente con éter sulfúrico, acetato
de etilo y, por último, n-butanol. La solución acuosa fue liofilizada y almacenada a -20°C. Posteriormente se realizó la determinación
de SW en el EA por cromatografía líquida de alto rendimiento y espectrometría de masas (HPLC-MS/MS) en el Poisonous Plants
Research Laboratory (PPRL) (Utah, Estados Unidos). Por otro lado, la SW natural aislada de Astragalus lentiginosus, fue donada por
el Dr. Dale Gardner del PPRL. Con la concentración de SW previamente definida por HPLC-MS/MS en el EA, se realizó el ensayo de
citotoxidad sobre la línea celular C6 (ATCC: CCL-107TM), correspondiente a un glioma maligno de murino, comparándola con la SW
natural. Las células se expusieron a diferentes concentraciones de EA o SW natural (25- 1000 μM) y la viabilidad celular se
determinó mediante tinción con cristal violeta. El porcentaje de viabilidad celular se determinó comparando las absorbancias
resultantes con la absorbancia media de los pocillos de control. También se realizó un análisis morfológico con microscopía de
fluorescencia, se utilizó la tinción dual fluorescente naranja de acridina/bromuro de etidio en las células cultivadas sobre cubreobjetos
y tratadas con 300 μM de EA o 1000 μM de SW natural. Tras la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS y se adicionó
una mezcla de los fluorocromos durante un minuto. Se aplicaron los cubreobjetos a los portaobjetos y las secciones se observaron y
fotografiaron en un microscopio de fluorescencia.
Los resultados evidenciaron una concentración de 1,6 μg de SW por miligramo y además se logró detectar la presencia de
calisteginas. La citotoxicidad del EA sobre las células de la línea C6 se comparó con el efecto de la SW natural en cantidades
equivalentes. Mientras que el EA mostró una citotoxicidad dosis-dependiente, ninguna de las dosis ensayadas de SW natural
evidenció efectos sobre la viabilidad celular tras 48h de incubación. En cuanto a los cambios morfológicos analizados mediante
microscopía de fluorescencia inducidos por el EA y la SW natural, las células de glioma no tratadas mostraban una fluorescencia
verde, un núcleo claro con estructura intacta y presentaban cierta fluorescencia roja anaranjada punteada en el citoplasma
homogéneamente distribuida que representa los lisosomas. En las células tratadas con 300 μM de EA tras 48 h de incubación se
observaron células con fluorescencia rojo-anaranjada irregular en su periferia debido a la permeabilización por bromuro de etidio
compatible con necrosis. Por otro lado, tras el tratamiento con 1000 μM de SW natural, las células mostraron un aumento del número
de lisosomas presentes en el citoplasma sin evidenciar alteraciones en sus membranas celulares.
En conclusión, estos hallazgos demuestran que la swainsonina no sería el único componente presente en el extracto alcaloide de I.
carnea responsable de la citotoxicidad in vitro en las células de glioma. Otros componentes, como las calisteginas, podrían contribuir
actuando sinérgicamente y desencadenando la muerte celular por necrosis. Por otra parte, SW es probablemente responsable de la
astrogliosis por una posible disfunción lisosomal y por tanto del almacenamiento intracelular
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