185 research outputs found
AFMBioMed Conference: Paris, France, August 2011
No full textInternational audienceThe fourth edition of the AFMBioMed Conference, Paris 2011 was organized by the Institut Curie, INSERM, and the Life Science Division of the CEA (DSV). The conference was held at the Institut Curie, Paris, France on 23–26 August and chaired by Dr Simon Scheuring
From eye lens cells to lens membrane proteins : Development and application of a hybrid high-speed atomic force microscopy/optical microscopy setup
No full textJe utilise le AFM et le HS-AFM pour étudier les caractéristiques mécaniques du cellule du cristallin et aussi des protéines de membrane de la cellule, AQP0 et Connexon. L’énergie d'interaction de la AQP0 est -2.7 kBT, très nécessaire pour former les microdomaines de jonctions (junctional microdomain). Aussi c' est la première fois qu il est possible de voir des protéines individuel et son mouvement en cellules vivants. La formation de microdomaines est important pour la transparence du cristallin, et le AQP1 ne le peux faire.I used the AFM and HS-AFM for characterise the eye lens and the eye lens membrane protein, AQP0 and connexon.A QP0-AQP0 interaction energy is -2.7kBT, it is important for the formation of junctional microdomains, which keep the distance between the cells lens and lens transparency. this is the first report which is present time the visualization of unlabelled membrane proteins on living cells under physiological conditions. AQP1 can not maintain the lens transparency because it does not form junctional microdomains
Discrimination between cyclic nucleotides in a cyclic nucleotide-gated ion channel
No full textCyclic nucleotide-gated ion channels are crucial in many physiological processes such as vision and pacemaking in the heart. SthK is a prokaryotic homolog with high sequence and structure similarities to hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-modulated and cyclic nucleotide-gated channels, especially at the level of the cyclic nucleotide binding domains (CNBDs). Functional measurements showed that cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a channel activator while cyclic guanosine monophosphate (cGMP) barely leads to pore opening. Here, using atomic force microscopy single-molecule force spectroscopy and force probe molecular dynamics simulations, we unravel quantitatively and at the atomic level how CNBDs discriminate between cyclic nucleotides. We find that cAMP binds to the SthK CNBD slightly stronger than cGMP and accesses a deep-bound state that a cGMP-bound CNBD cannot reach. We propose that the deep binding of cAMP is the discriminatory state that is essential for cAMP-dependent channel activation
Effect of crowdedness in the life cycle of lysenin studied by high-speed atomic force microscopy
No full textDe nombreuses fonctions de la membrane plasma dépendent de manière vitale de sa structure et de sa dynamique. L’observation d’une diffusion anomale in vivo et in vitro par l’utilisation de la microscopie en fluorescence et par le pistage de particules Isolées ont permis de développer notre conception de la membrane, en la faisant passer d’un fluide homogène à deux couches avec des protéines se diffusant librement, à une mosaïque extrêmement organisée, surpeuplée et agglomérée de lipides et de protéines. Malheureusement, il n’a pas été possible d’apparenter les diffusions anomales à des détails moléculaires en raison du manque de capacité d’observation moléculaire directe et unmarqués Dans cotre cas, nous utilisons la microscopie à force atomique à grande vitesse, et une méthodologie d’analyse innovante pour analyser le pore en formant la protéine Lysine dans un environnement surpeuplé et nous documentons l’existence de différents régimes de diffusion au sein de la même membrane. Nous montrons la formation de phases locales de verre, où les protéines sont attrapées dans des cages formées par proximité cages sur des échelles de temps allant jusqu’à 10 s, ce qui n’avait pas été antérieurement observé de manière expérimentale pour les membranes biologiques. De plus, autour de patchs d’apparence solide et de molécules immobiles nous avons pu détecter une phase du verre plus lente qui mène à l’emprisonnement de la protéine et à la création d’un périmètre de diffusion de la membrane diminué .Many functions of the plasma membrane depend critically on itsstructure and dynamics. Observation of anomalous diffusion in vivo and in vitro usingfluorescence microscopy and single particle tracking has advanced our concept of themembrane from a homogeneous fluid bilayer with freely diffusing proteins to a highlyorganized crowded and clustered mosaic of lipids and proteins. Unfortunately,anomalous diffusion could not be related to local molecular details given the lack ofdirect and unlabeled molecular observation capabilities. Here, we use high-speedatomic force microscopy and a novel analysis methodology to analyze the poreforming protein lysenin in a highly crowded environment and document coexistenceof several diffusion regimes within one membrane. We show the formation of localglassy phases, where proteins are trapped in neighbor-formed cages for time scales upto 10 s, which had not been previously experimentally reported for biologicalmembranes. Furthermore, around solid-like patches and immobile molecules aslower glass phase is detected leading to protein trapping and creating a perimeter ofdecreased membrane diffusion
Charactérisation de la mécanique cellulaire par microscopie à force atomique : cartographie d'élasticité et microrhéologie à grande vitesse
No full textLa mécanique cellulaire a gagné un intérêt croissant en raison de son implication fondamentale dans des nombreux processus cellulaires, notamment la migration, la division, la différentiation et l’apoptose. Entre autres techniques, la microscopie à force atomique (AFM) s’est avérée particulièrement utile pour la caractérisation mécanique des cellules vivantes. Dans cette thèse, deux aspects différents ont été étudiés par AFM. Dans un premier temps, l’élasticité des cellules épithéliales étalées sur des micropatterns adhésifs a été cartographiée. Cette étude montre que l’élasticité d’une cellule varie en fonction de sa géométrie d’adhésion à la fois au niveau global et subcellulaire. La deuxième partie de cette thèse est dédiée à la caractérisation de la réponse viscoélastique d’une cellule à un stimulus mécanique oscillatoire à haute fréquence. Des études précédentes montrent que la réponse des cellules est dominée par un stress élastique et suive une loi de puissance faible à basse fréquence. Une réponse cellulaire essentiellement visqueuse est attendue à haute fréquence, mais jusqu’à présent les limitations techniques ont empêché l’évaluation de cette propriété. Dans ma thèse, ces limitations ont été dépassées grâce à la modification d’un AFM à grande vitesse (HS-AFM). Des mesures de rhéologie active sur fibroblastes ont été réalisées entre 1Hz et 120 kHz, permettant d’étendre de deux ordres de grandeur l’échelle de fréquences explorée. Ce travail montre une réponse cellulaire aux stimulations à haute fréquence plus visqueuse qu’à basse fréquence, mais suggèrent aussi une réponse bien plus complexe qu’attendue.The field of cell mechanics gained a growing interest because of its fundamental implication in several cellular processes, such as migration, division, differentiation and apoptosis. Among other techniques, atomic force microscopy (AFM) demonstrated particularly useful for the mechanical characterization of living cells. In this thesis, two different aspects were investigated by AFM. In the first part, the elastic properties of epithelial cells grown on adhesive micropatterns were mapped. This study shows that the elasticity of a cell varies as a function of the geometry of its adhesive environment on both global and subcellular scales. The second part of this thesis focuses on the characterization of the viscoelastic response of a cell subjected to an oscillatory mechanical stimulus at high frequency. Previous studies show that the response of cells to such stimuli is mainly dominated by elastic stress and follows a weak power law at low frequency. Instead, a predominantly viscous behavior is expected at high frequency. Up to now, technical limitations prevented the experimental validation of this property. In this thesis, these limitations were overcome thanks to the modification of a high-speed AFM (HS-AFM). With this setup, active rheological measurements of living fibroblasts could be performed from 1 Hz to 120 kHz, extending of two orders of magnitude the frequency scale explored until now. This work highlights a response of cells to high-frequency stimuli which is more viscous than at low frequency, but also suggests a more complex response than expected
The 4.5 A structure of human AQP2
No full textLocated in the principal cells of the collecting duct, aquaporin-2 (AQP2) is responsible for the regulated water reabsorption in the kidney and is indispensable for the maintenance of body water balance. Disregulation or malfunctioning of AQP2 can lead to severe diseases such as nephrogenic diabetes insipidus, congestive heart failure, liver cirrhosis and pre-eclampsia. Here we present the crystallization of recombinantly expressed human AQP2 into two-dimensional protein-lipid arrays and their structural characterization by atomic force microscopy and electron crystallography. These crystals are double-layered sheets that have a diameter of up to 30 microm, diffract to 3 A(-1) and are stacked by contacts between their cytosolic surfaces. The structure determined to 4.5 A resolution in the plane of the membrane reveals the typical aquaporin fold but also a particular structure between the stacked layers that is likely to be related to the cytosolic N and C termini
Atomic force microscopy of membrane proteins (study of photosynthetic membranes and the mitochondrial outer membrane)
No full textLa microscopie à force atomique (AFM) a été utilisée pour étudier différents systèmes biologiques. Une nouvelle application de l'AFM a été mise au point pour étudier des membranes non supportées. L'AFM a permis l'étude du système photosynthétique bactérien. Ainsi j'ai étudié l'insertion des capteurs de lumière de type 2 dans des bicouches lipidiques de différentes compositions (Gonçalves et al., 2005b). Mon attention s'est ensuite porte e sur les membranes natives, champ dans lequel l'équipe a une quasi-exclusivité des compétences au niveau mondial. Ainsi le système photosynthétique a pu être étudié sur deux souches bactériennes: Phaeospirillum molischianum (Gonçalves et al., 2005a) et Rhodopseudomonas palustris (Scheuring et al., 2006), approfondissant nos connaissances sur ce système, ubiquitaire sur Terre, et ces bactéries, qui ont un intérêt croissant pour les milieux industriels. Portant l'étude de membranes natives plus loin, j'ai étudié les membranes externes de mitochondries et ainsi, j'ai pu étudier in situ le canal ionique voltage d pendant et son assemblage supramoléculaire (Gonçalves et al., 2007). Dans un souci de développement technologique, un nouveau système a été développé. Celui-ci a en effet permis d'étudier des membranes non supportées, séparant deux compartiments aqueux, dont la composition est modulable. Ce système permettra donc de coupler les études fonctionnelles de protéines activables par des gradients entre les compartiments, aux études structurales permises par l'AFM à haute résolution. Nous avons démontré la faisabilité de telles expériences en appliquant notre système à l'étude des couches S de Corynebacterium glutamicum ainsi qu'à la bactériorhodopsine (Gonçalves et al., 2006).PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF
The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM
No full text© The Author(s), 2020. This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License. The definitive version was published in Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. C., Gladfelter, A. S., & Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications, 11(1), (2020): 5062, doi:10.1038/s41467-020-18778-x.Septins are GTP-binding proteins involved in diverse cellular processes including division and membrane remodeling. Septins form linear, palindromic heteromeric complexes that can assemble in filaments and higher-order structures. Structural studies revealed various septin architectures, but questions concerning assembly-dynamics and -pathways persist. Here we used high-speed atomic force microscopy (HS-AFM) and kinetic modeling which allowed us to determine that septin filament assembly was a diffusion-driven process, while formation of higher-order structures was complex and involved self-templating. Slightly acidic pH and increased monovalent ion concentrations favor filament-assembly, -alignment and -pairing. Filament-alignment and -pairing further favored diffusion-driven assembly. Pairing is mediated by the septin N-termini face, and may occur symmetrically or staggered, likely important for the formation of higher-order structures of different shapes. Multilayered structures are templated by the morphology of the underlying layers. The septin C-termini face, namely the C-terminal extension of Cdc12, may be involved in membrane binding.We thank J. Thorner for the generous gift of the CTE mutant plasmids. K.S.C. was supported in part by a grant from NIGMS under award T32 GM119999 and A.S.G., F.J. and S.S. were supported by NIH RO1 GM130934
The Supramolecular Architecture of the Bacterial Photosynthetic Apparatus Studied by Atomic Force Microscopy (AFM)
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