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Das EBNA1-Protein des Epstein-Barr Virus: Genetische und funktionelle Analyse
No full textDas Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert primäre humane B-Zellen und kann deren unbegrenzte Proliferation induzieren. Dieser Prozess der Wachstumstransformation von B–Zellen ist ein Modellsystem, das die pathogenen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 1 (EBNA1) wurde als essentiell für den Prozess der Wachstumstransformation primärer humaner B-Lymphozyten beschrieben, weil es an der latenten Replikation über den viralen Replikations-Ursprung oriP, der extrachromosomalen Erhaltung des Virus-Episoms und der transkriptionellen Trans-aktivierung der latenten Gene beteiligt ist (Rickinson und Kieff, 2001). Dieses Postulat wurde nie experimentell untersucht, da die genetische Analyse mit den bisherigen Methoden nicht möglich war. Das Maxi-EBV-System macht das Genom von EBV einer genetischen Manipulation zugänglich und erlaubt auch die Herstellung von Viren, denen essentielle Gene fehlen (Delecluse et al., 1998).
Ein Ziel meiner Doktorarbeit war die Herstellung und Analyse eines EBNA1-negativen Virus. Entgegen der Lehrmeinung war es mit EBNA1-negativem Maxi-EBV möglich, wachstums-transformierte Zellklone nach Infektion von primären humanen B-Lymphozyten zu etablieren. Das virale Genom war in sämtlichen erhaltenen lymphoblastoiden Zelllinien so integriert, dass alle untersuchten latenten EBV-Proteine exprimiert wurden. Meine Ergebnisse zeigen eindeutig, dass EBNA1 prinzipiell für die Wachstumstransformation entbehrlich ist. Mit EBNA1-positiven Viren werden die primären B-Zellen jedoch mindestens um den Faktor 10.000 besser wachstumstransformiert. Da EBNA1 den episomalen Status des Virusgenoms vermittelt, scheint die Etablierung des EBV-Genoms in infizierten Zellen der limitierende Schritt zu sein. Auch in vivo im SCID-Maus-Modell erwies sich EBNA1 als entbehrlich für die Tumorbildung, womit es nicht als essentielles Onkogen von EBV betrachtet werden kann.
Ein weiterer im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchter Aspekt war die Frage, ob EBNA1 für die extrachromosomale Erhaltung und Replikation des EBV-Episoms durch heterologe Genprodukte ersetzt werden kann. Zu diesem Zweck wurden Fusionsproteine aus der DNA-Bindedomäne von EBNA1 mit den zellulären Proteinen Histon H1 bzw. HMG-I (Mitglied der hoch mobilen Protein-Gruppe) hergestellt. Ich konnte zeigen, dass HMG-I:EBNA1- und H1:EBNA1-Fusionsproteine in der Lage sind, kleine oriP-enthaltende Plasmide und Maxi-EBVs episomal zu erhalten und die zelluläre Replikations-Maschinerie zu rekrutieren. Zusätzlich dazu unterstützen die Fusionsproteine im EBNA1-negativen Maxi-EBV die Produktion infektiöser Viren.
Für ein konditional regulierbares Vektorsystem wurden Fusionsproteine aus der EBNA1-Transaktivierungsdomäne und der DNA-Bindedomäne des Tet-Repressors (TetR) hergestellt. Diese Proteine sollten mit Tet-Operator-Sequenzen (TetO, TetR-Bindemotiv) interagieren, die multimerisiert auf oriP-basierte Vektoren kloniert wurden. Dadurch sollte die Erhaltung der oriP-basierten Vektoren in der Zelle konditional regulierbar gestaltet werden. Es gelang in dieser Doktorarbeit zum ersten Mal ein System zu etablieren, mit dem Plasmide episomal erhalten werden und bei Zugabe von Doxyzyklin konditional regulierbar verloren gehen.
Dieses erstmals realisierte konditional regulierbare Vektorsystem schafft neue Wege, die virale und zelluläre Replikation genauer zu untersuchen. Außerdem öffnen sich Möglichkeiten für eine sicherere Gentherapie, da die viralen Anteile auf ein Minimum reduziert werden können. Mit einem solchen System könnten EBV-Genvektoren in B-Zellen eingeführt werden und nach Expression des auf dem Vektor kodierten, therapeutischen Gens könnte die Genfähre durch Tetrazyklin-Applikation wieder aus dem Patienten entfernt werden
Influence of atmospheric conditions on the range distance and number of returned points in Leica Scanstation 2 point clouds
No full textThe aim of this research is to analyze experimentally the influence of atmospheric conditions on a series of measurements obtained by a terrestrial laser scanner. The scan series represents a dike covered by containers. These containers are gradually filled with water during the experiment to simulate a controlled dike collapse. From the morning of 25.09.2008 till the afternoon of 27.09.2008 two kinds of measurements were made. The first one assessed the atmospheric condition by measuring variations in radiation, temperature and humidity, which were taken as weather attributes for future analysis. The second measurements were made by the terrestrial laser scanner ScanStation 2 from Leica. During the experiment a total of 159 scans with a resolution of 5 cm on 50 m distance of the dike were made. On the scanned region twelve stable virtual targets were selected based on intensity and range. Three scan attributes were determined for each target at each of the 159 epochs: number of observed points, mean distance between scanner and target, and also standard deviation of these distances. The resulting scan attributes are compared to the 3 atmospheric attributes described above. The results indicate that scans affected by fog can be detected automatically by analyzing independent meteorological data. A weak linear relation of about 2 mm range increment per degree temperature increment at 70 m distance should be further investigated.Remote SensingAerospace Engineerin
IL-12-induced T-bet expression and IFNγ release in lymphocytes from asthmatics—Role of MAPkinases ERK-1/-2, p38MAPK and effect of dexamethasone
No full textSummaryThe transcription factor T-box-expressed-in-T-cells (T-bet) is required for TH1 lymphocyte differentiation, regulates the IL-12-induced expression of the TH1-specific cytokine IFNγ and may be dysregulated in asthmatics.The modulatory role of extracellular signal-regulated kinase (ERK)-1/-2, p38mitogen-activated protein kinase (MAPK) and dexamethasone on IL-12 induced T-bet and IFNγ expression was assessed in peripheral blood lymphocytes of 10 atopic asthmatics and 10 nonatopic normals.IFNγ production was dependent on phosphorylation of ERK-1/-2 and p38MAPK, as examined by PD098059, an inhibitor of the upstream activator of MAPKkinase (MKK-1), and SB203580, an inhibitor of p38MAPK. The inhibitory effect of PD098059 on IFNγ release was decreased in asthmatic T-cells compared with normals.The IL-12-induced T-bet expression and the inhibitory effect of SB203580 were increased in asthmatic T-cells compared with normals.Dexamethasone blocked the IL-12-induced T-bet expression in asthmatic T-cells completely and decreased IL-12-induced IFNγ release by ∼50%, which occurred to the same extent in asthmatic and normal T-cells.In conclusion, (1) p38MAPK-pathway rather than ERK-pathway may play a more basic role in the regulation of the increased T-bet expression in asthma, and (2) ERK- and p38MAPK-activation modulate IFNγ expression independently of T-bet and this regulatory role of ERK-1/-2 on IFNγ release is impaired in asthma. The therapeutic benefit of dexamethasone on T-bet and IFNγ production seems to be critical
doi:10.1093/nar/gkn273 Conditional gene vectors regulated in cis
No full textNon-integrating gene vectors, which are stably and extrachromosomally maintained in transduced cells would be perfect tools to support long-term expres-sion of therapeutic genes but preserve the genomic integrity of the cellular host. Small extrachromo-somal plasmids share some of these ideal character-istics but are primarily based on virus blueprints. These plasmids are dependent on viral trans-acting factors but they can replicate their DNA molecules in synchrony with the chromosome of the cellular host and segregate to daughter cells in an auto-nomous fashion. On the basis of the concept of the latent origin of DNA replication of Epstein-Barr virus, oriP, we devised novel derivatives, which exclusively rely on an artificial replication factor for both nuclear retention and replication of plasmid DNA. In addition, an allosteric switch regulates the fate of the plasmid molecules, which are rapidly lost upon addition of doxycycline. Conditional mainte-nance of these novel plasmid vectors allows the reversible transfer of genetic information into target cells for the first time
Complex protein-DNA dynamics at the latent origin of DNA replication of Epstein-Barr virus
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Systematic verification of upstream regulators of a computable cellular proliferation network model on non-diseased lung cells using a dedicated dataset
No full textThis is an open access article published under the Creative Commons CC-BY-NC 3.0 license
117. HSPG Binding Properties of Adeno- Associated Virus Retargeting Mutants and Consequences for Their In Vivo Tropism
No full textEngineering adeno‐associated virus serotype 2‐based targeting vectors using a new insertion site‐position 453‐and single point mutations
No full textCD8 T cell recognition of endogenously expressed Epstein-Barr virus nuclear antigen 1
No full textThe Epstein-Barr virus (EBV) nuclear antigen (EBNA)1 contains a glycine-alanine repeat (GAr) domain that appears to protect the antigen from proteasomal breakdown and, as measured in cytotoxicity assays, from major histocompatibility complex (MHC) class I-restricted presentation to CD8+ T cells. This led to the concept of EBNA1 as an immunologically silent protein that although unique in being expressed in all EBV malignancies, could not be exploited as a CD8 target. Here, using CD8+ T cell clones to native EBNA1 epitopes upstream and downstream of the GAr domain and assaying recognition by interferon gamma release, we show that the EBNA1 naturally expressed in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines (LCLs) is in fact presented to CD8+ T cells via a proteasome/peptide transporter-dependent pathway. Furthermore, LCL recognition by such CD8+ T cells, although slightly lower than seen with paired lines expressing a GAr-deleted EBNA1 protein, leads to strong and specific inhibition of LCL outgrowth in vitro. Endogenously expressed EBNA1 is therefore accessible to the MHC class I pathway despite GAr-mediated stabilization of the mature protein. We infer that EBNA1-specific CD8+ T cells do play a role in control of EBV infection in vivo and might be exploitable in the control of EBV+ malignancies
