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Deciphering Hox/cofactor interactions at the super-resolutive scale and transcriptional control of autophagy by Hox/LamC complexes in Drosophila fat body
No full textLa régulation transcriptionnelle est le sujet principal de nombreuses recherches et est un mécanisme indispensable pour assurer les fonctions cellulaires de tout organisme. Les avancées technologiques dans le monde de la microscopie ouvrent de nouvelles opportunités pour visualiser différentes étapes de ce mécanisme. Notamment les dynamiques et la localisation d’un FT a l’échelle super-résolutive. Cependant, un unique FT n’est pas suffisant pour réguler finement l’activation ou la répression de la transcription d’un gène. En effet, différents complexes de FT coopèrent pour atteindre une telle précision de régulation. La visualisation de la fixation d’un complexe (binaire) sur sa séquence régulatrice cible serait donc un atout pour mieux déchiffrer la régulation transcription elle.La première partie de mon travail de Thèse a consisté à mettre en place des outils permettant de visualiser en microscopie confocale et super-résolution, la fixation de complexes Hox-cofacteur sur des séquences ADN cibles spécifiques. Ces outils ont été appliques pour quantifier l’enrichissement de différents complexes Hox/Exd au niveau d’un enhancer connu (appelé fkh250) du gène cible forkhead (fkh) dans les glandes salivaires de la larve de drosophile. J’ai combine la méthode de BiFC (confocale) ou BiFC-PALM (super-résolution) et le système ParB/INT pour visualiser simultanément les complexes Hox/Exd et l’enhancer fkh250, respectivement.Mes analyses confirment un enrichissement spécifique des complexes Hox/Exd sur les différents types d’enhancer fkh250. Surtout, des résultats préliminaires indiquent la possibilité de quantifier le nombre exact de complexes Hox/Exd fixes sur l’enhancer fkh250 a l’échelle super-résolutive.La deuxième partie de mon travail de thèse concerne l’analyse d’une nouvelle interaction entre les protéines Hox avec la Lamine C (LamC) pour une répression transcriptionnelle active des gènes lies a l’autophagie (atg) dans le corps gras de la larve de drosophile. Ce travail a permis de révéler un profil de co-expression typique des protéines Hox et de la LamC, au sein du noyau par imagerie confocale ≪ Lightning ≫ et l’importance de contrôler le positionnement des loci génomiques pour une régulation fine de la transcription.Transcriptional regulation is essential for all cellular functions and is the subject of a number of studies. Technological advances in the field of microscopy open new opportunities to visualize different steps of this mechanism. In particular, it allows visualizing individual TFs at the super resolution scale in vivo.However, an isolated TF is not sufficient to tightly regulate the activation or repression of a target gene. Indeed, different complexes need to cooperate to achieve this level of accurate control. The observation of binary protein-protein interactions bound on a specific DNA sequence would be an asset to decipher the complex mechanism of transcription.The first part of my thesis project consisted to establish the tools allowing the visualization of different Hox-cofactor complexes on a specific target sequence, at confocal resolution and super-resolution. These tools were applied to quantify a specific enrichment of Hox/Exd complexes on a well characterized enhancer called fkh250. This enhancer is regulating the expression of a Drosophila salivary gland gene named forkhead (fkh). I combined Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC) (confocal resolution) or BiFC-PALM (super-resolution) with the ParB/INT system to simultaneously detect Hox/Exd complexes bound to the fkh250 enhancer,respectively.My results confirm a specific enrichment of Hox/Exd complexes on several fkh250 enhancers. Moreover, my preliminary results show the possibility to perform bi-colour PALM for revealing in the same nucleus the Hox/Exd complexes and its target DNA sequences.The second part of my project revealed a new interaction between Hox proteins and a nuclear matrix component, the Lamin C (LamC), in the context of transcriptional repression of autophagy related genes (atg) in Drosophila larval fat body. This work revealed a typical profile of co-expression of Hox and LamC in Drosophila fat body nuclei. This profile was imaged through confocal Lightning microscopy. These results also revealed the importance of genomic loci positionning for the fine control of transcription
Deciphering the molecular interactions between Hox proteins and their partners
No full textLes gènes Hox sont présents dans la majorité des espèces du règne animal et sont nécessaires à la différenciation coordonnée des cellules le long de différents axes longitudinaux au cours du développement embryonnaire. Ils sont impliqués dans le maintien de l'homéostasie de nombreux tissus à l'âge adulte. Des mutations affectant leur expression et/ou leur fonction sont ainsi retrouvées dans de nombreux cancers chez l'Homme.Les gènes Hox codent pour des facteurs de transcription reconnaissant des séquences nucléotidiques très similaires. L'interaction avec une classe évolutivement conservée de cofacteurs, les protéines Pbx et Meis, permet aux protéines Hox de reconnaître des sites de liaison plus spécifiques. Cette interaction a d'abord été décrite pour dépendre d'un petit motif commun aux protéines Hox, l'hexapeptide (HX). Cependant, des analyses récentes ont montré que ce motif pouvait en fait être dispensable in vivo, soulignant une capacité étonnante des protéines Hox à pouvoir potentiellement utiliser différents motifs pour interagir avec les mêmes cofacteurs. Mon travail de thèse s'inscrit dans la problématique du rôle des petits motifs dans les interactions Hox-cofacteur. Un premier projet a consisté à réaliser une analyse systématique du mode d'interaction de chaque représentant des groupes de paralogie des protéines Hox humaines avec leurs cofacteurs Pbx/Meis. Ce travail a révélé de nouveaux modes d'interaction pour plusieurs protéines Hox. Un deuxième projet a consisté à mettre en place un nouveau système de crible moléculaire pour identifier des partenaires de la protéine humaine HoxA9 sauvage ou mutée dans son motif HX dans différentes lignées cellulaires. L'ensemble de mon travail de thèse ouvre ainsi de nouvelles perspectives sur notre compréhension du mode moléculaire d'action des protéines Hox et de leurs cofacteurs, que cela soit en contexte développemental normal ou pathologiqueHox genes are present in the vast majority of the animal kingdom, and are required for the differentiation of several longitudinal axes during embryogenesis. There are also involved in the homeostasis of several tissues in the adult organism. Mutations affecting their expression and/or function are found in numerous human cancers.Hox genes encode for transcription factors that recognize short and highly similar DNA-binding sites. The direct interaction between Hox proteins and two evolutionary classes of cofactors, the Pbx and Meis proteins, allows them to recognize more specific DNA-binding sites. This interaction was first described to rely on a common short Hox protein motif called hexapeptide (HX). However, subsequent functional and molecular analyses showed that the HX motif could be dispensable for the interaction with Pbx and Meis partner in vivo. These results strongly suggest that Hox proteins could use different motifs to interact with the same set of cofactors. Such alternative motifs are unknown in mammalian Hox proteins.My thesis work is dedicated to the issue of the role of the HX motif and other short motifs in Hox-cofactor interactions. More particularly, I developed two main projects using human Hox proteins and cell lines derived from different tissues as a model system. My first project consisted in the systematic analysis of the interaction property of all Hox paralogs with the Pbx/Meis cofactors. This work revealed new Pbx/Meis-interaction interfaces in human Hox proteins. My second project consisted in establishing a new molecular screen to identify transcriptional partners of the wild type or HX-mutated human HoxA9 protein in different cell lines.Overall, my thesis work opens new perspectives into our understanding of the molecular mode of action of Hox proteins and their cofactors, in a normal or pathological developmental contex
Special Issue “Hox Genes in Development: New Paradigms”
No full textIn this Special Issue on “Hox genes in development: new paradigms”, we present a compilation of articles and reviews tackling various aspects of the Hox biology field [...
HOX dose and the specification of flight appendages in insects
No full textLes insectes présentent une étonnante diversité morphologique dans les organes de vol, et cette évolution a conduit à leur rayonnement au sein du règne animal. L'une des modifications les plus frappantes est la transformation des ailes postérieures en structures d'équilibrage très réduites, appelées haltères. Des travaux pionniers chez la drosophile ont montré que la spécification des haltères est sous le contrôle du gène Hox Ultrabithorax (Ubx). En revanche, la formation des ailes antérieures est décrite pour être indépendante des gènes Hox, mais cette observation est controversée chez d’autres insectes. Au cours de mon doctorat, j'ai réexaminé le rôle des gènes Hox pour la spécification des organes du vol chez la drosophile. Mes travaux montrent que la protéine Hox Antennapedia (Antp) est exprimée à un niveau faible dans des cellules spécifiques du primordium de la marge et est nécessaire à la formation correcte de l’aile adulte. De manière étonnante, Antp peut également fonctionner comme Ubx et former un haltère quand la protéine est exprimée à des niveaux similaires à ceux de Ubx. Ainsi, la formation d’organes de vol divergents chez la drosophile est directement contrôlée par une dose spécifique de protéine Hox et non par une protéine Hox spécifique. Les gènes Hox sont intrinsèquement liés à l'évolution de la diversité morphologique chez les animaux. Par conséquent, le rôle de la dose des protéines Hox a également été testé d'un point de vue évolutif parmi plusieurs lignages d'insectes. Les résultats montrent que la dose de protéines Hox est à peu près la même entre les primordia antérieur et postérieur d’un insecte à quatre ailes comme Bombyx mori. Dans l’ensemble, mes résultats démontrent que la spécification des organes de vol n’est pas un programme Hox-indépendant et que la variation de la dose des protéines Hox est un moyen de modifier la taille et la forme de l’aile, pouvant ultimement aboutir à la création d’un tout nouvel organe d’équilibrage au cours de l’évolution des insectes. Enfin, au cours de mon doctorat, j'ai également participé à plusieurs projets parallèles visant à identifier et à caractériser le rôle des nouveaux cofacteurs des protéines Hox dans différents contextes développementaux, notamment la spécification de l’haltère et la répression de l'autophagie. Ces travaux s'appuient en partie sur la complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC), une méthode que nous avons récemment couplée à la panoplie d'outils génétiques de la drosophile pour réaliser des criblages d'interactions protéine-protéine à grande échelle in vivo.Insects display an astonishing array of diversity in flight appendage morphologies and theirevolution led to the catalyzed radiation of insects in the animal kingdom. The first definite modellinking the Hox genes to morphological evolution was demonstrated in Drosophila. One of themost striking modifications is the transformation of hindwings into highly reduced balancingstructures called halteres. Work in Drosophila established that the specification of halteres isunder the control of a single Hox gene, Ultrabithorax (Ubx). In contrast, the formation of forewingshas been described to be Hox-independent. During my Ph.D., I reconsidered the role of Hox genesfor flight appendage specification in Drosophila. I show that the Hox protein Antennapedia (Antp)is expressed at a low level in specific cells of the wing blade primordium and required for theproper formation of the adult wing. Moreover, Antp works like Ubx to form a haltere whenexpressed in the levels of Ubx. Thus, the formation of divergent flight organs in Drosophila is notdependent on a specific Hox protein but on a specific Hox dose.Hox genes are intrinsically linked to the evolution of morphological diversity in animals.Therefore the role of the Hox dose was also tested from an evolutionary point of view amongseveral insect lineages. Results show that the Hox dose is for example pretty much the samebetween the forewing and hindwing primordia of the four-wing insect species Bombyx mori.Altogether, my results demonstrate that the specification of flight appendages is not aHox-independent developmental program and that the variation in the Hox dose is a way tomodify the wing size and shape, ultimately leading to a completely new balancing organ duringinsect evolution
Dose and cofactors of Hox proteins during flight organs development of insects
No full textAu cours de l'évolution, les êtres vivants ont développé une étonnante diversité morphologique leur permettant de s'adapter à des environnements très variés. L'un des exemples les plus frappants est la radiation des appendices de vol chez les insectes à partir d'ancêtres possédant deux paires d'ailes très similaires. Plusieurs travaux montrent l'importance d'un gène Hox particulier, Ultrabithorax ( Ubx), pour la formation des organes de vol postérieurs. Ceux-ci correspondent à des organes balanciers appelés « haltères » chez les diptères. A l'inverse, la formation des organes de vol antérieurs est considérée comme indépendante des gènes Hox. Au cours de mes travaux de thèse, nous avons remis en question ce modèle, et montré que la protéine Hox Antennapedia (Antp) est non seulement produite da ns le primordium de l'a ile mais éga lement nécessaire à la formation des ailes antér ieures chez la mouche des fruits Drosophila melanogaster. De manière surprenante, la dose de Antp est bien en deçà de celle observée pour Ubx dans le primordium d'haltère, et l'augmentat ion artificielle de cette dose suffit à transformer l'aile en haltère. À l'inverse, la diminution contrôlée de la dose de Ubx induit une transformation de l'haltère en aile. Ces résultats montrent ainsi que ce n'est pas le type de protéine Hox, ici Antp ou Ubx, mais leur dose, qui contrôle le programme développemental de type a ile ou haltère chez la drosophile. L'analyse du rôle du facteur de transcription Homothorax (Hth) montre également que celui-ci est nécessaire respectivement à l'activation de Antp et à la répression de Ubx dans les primordia d'aile et d'haltère, permettant de mettre en place un profil d'expression spécifique. L'observation d'une corrélation entre variation de dose Hox et formation d'ailes identiques ou différentes dans d'autres lignages d'insectes permet de proposer un nouveau modèle dans lequel les modifications du niveau d'expression des gènes Antp et Ubx pourraient être plus largement responsables de la diversification morphologique des organes de vol au cours de l'évolution des insectes. Comment la protéine Ubx parvient à spécifier le programme développemental des haltères chez la drosophile reste encore mal compris au niveau moléculaire. En particulier, il est attendu que son activité dose-dépendante puisse reposer sur l'interaction avec d'autres partenaires transcriptionnels. J'ai donc initié deux approches complémentaires originales pour identifier de nouveaux cofacteurs de Ubx. Si l'une des approches n'a pu aboutir à son terme, l'autre a permis d'identifier un certain nombre de nouveaux partenaires et de révéler une stabilité surprenante du programme développemental de l'haltère.During evolution, animais have developed an astonishing morphological diversity, allowing them to adapt to a wide variety of environments. One of the most striking examples is the radiation of flight appendages in insects, starting from ancestors with two similar pairs of wings. Severa! studies showed the implication of a particular Hox gene, Ultrabithorax ( Ubx), in the formation of posterior flight organs. These organs correspond to the "halteres" in Diptera. Conversely, the formation of anterior flight organs is considered to be Hox independent.During my Ph.D work, we have questioned this mode!. We showed that the Hox protein Antennapedia (Antp) is produced in the wing primordium of the fruit fly Drosophi/a melanogaster and is required for the formation of forewings. Surprisingly, the express ion level of Antp is much lower than the level of Ubx in the haltere primordium, and the artificial increase of Antp level can transform the wing into a haltere. Conversely, the artificial decrease of the Ubx level can induce a haltere to wing transformation. These results show that this is not the type of the Hox protein, here Antp or Ubx, but the specific dose, which is important for the formation of a wing or a haltere in Drosophi/a. We also identified the transcription factor Homothorax (Hth) as an upstream regulator of Antp and Ubx in the wing and haltere primordia respectively. The observation of a correlation between Hox dose variation and wing morphology in other insect lineages supports a new mode! in which morphological diversification of flight organs during insect evolution could arise from changes in the Antp and Ubx expression level. How the Ubx protein could specify the haltere developmenta l program at the molecular level remains elusive. lt is expected that the dose-specific activity of Ubx in the haltere could rely on the interaction with other transcr iptiona l partners. 1 present two complementary approaches that 1 developed ta capture such cofactors. While one approach is still ongoing, the other led ta the identification of interesting putative Ubx-partners. This work also revea led a surpr ising robustness in the Ubx transcr iptional program that may expia in why halteres diverged very little during insect evolution
The leitmotif of AI safety: the example of vehicles with driving delegation
No full textOnly the unknown frightens men. But once a man has faced the unknown, that terror becomes the known.Antoine de Saint Exupéry, Wind, Sand and Stars, 1938 According to Samir Merabet, “the recognition of a legal status for artificial intelligence is likely to reduce distrust of it, and even create a feeling of confidence”. The development of public policies and normative actions relating to vehicles with driving delegation – i.e. vehicles equipped with various devices and systems based on the u..
Application de la complémentation de fluorescence bi-moléculaire à l'étude du mode d'action des protéines Hox in vivo
No full textComment le plan d’organisation d’un organisme est-il mis en place est une question centrale de la biologie du développement. Les séquençages complets de plusieurs génomes de métazoaires ont montré qu’un nombre restreint de molécules régulatrices soutiennent la diversité des plans d’organisation des animaux, suggérant que ces molécules sont utilisées de manière répétée dans des contextes différents. Cela soulève la question de la diversité d’action : comment ces molécules acquièrent-elle une diversité fonctionnelle ? De plus, la plupart des molécules régulatrices partagent des motifs (fonctionnels/structuraux) communs, soulevant la question de la spécificité : comment des molécules partageant des propriétés biochimiques similaires contrôlent-elles des programmes développementaux spécifiques ?Mon équipe d’accueil s’intéresse à ces questions en utilisant les facteurs de transcription Hox de la Drosophile comme paradigme d’étude.Durant ma thèse, j’ai développé trois lignes de recherches : (1) J’ai adapté la technique de complémentation bi-moléculaire de fluorescence (BiFC) de visualisation des interactions protéines-protéines à l’embryon de drosophile en développement.(2) J’ai employé la BiFC pour disséquer la formation des complexes Hox-protéines PBC. Mes résultats remettent en question le paradigme établit : (a) en soulignant la multiplicité des modes d’interaction Hox-PBC existants, (b) en démontrant que cette diversité peut être source de spécificité d’action.(3) La BiFC a ensuite été exploitée dans un crible par approche gènes candidats pour identifier de nouveaux partenaires des protéines Hox.My current laboratory aims to tackle the issue of specificity and diversity of regulatory molecules, taking the Drosophila Hox transcription factors as a paradigm for the analysis. During my PhD, I developed three connected research lines.Project 1: Visualization of protein interactions in living Drosophila embryos by the BiFC assayOur results establish the general suitability of BiFC for revealing and studying protein interactions in their physiological context during the rapid course of Drosophila embryonic development.Project 2: Investigation of Hox/PBC complex formation in vivo using BiFC Our findings challenge the current paradigm of Hox/Pbx complex assembly: (a) highlighting the existence of alternative modes of Pbx recruitment, (b) demonstrating that unique Hox-PBC interaction modes can provide specific regulatory function in absence of DNA-binding selectivity.To achieve this project BiFC was also performed with vertebrate Hox proteins in chicken embryos.Project 3: Realization of a candidate interaction screen based on BiFC to identify novel Hox protein partners in vivo(a) We have revealed that Hox proteins establish specific interactions with different subunits of the general mediator complex. These results constituted one of the rare studies making a direct link between the Hox regulators and components of the basal transcriptional machinery, in a physiological context.(b) We have discovered that Hox proteins can interact with importin proteins. This result allows us to assess the importance of controlling the nuclear localization of Hox proteins for controlling their regulatory activities during embryogenesis
Samir Merabet, Vers un droit de l'intelligence artificielle
No full textInternational audiencethèse Aix-Marseille, 2018, dir. H. Barbier, 540 p., Dalloz, coll. « Nouvelle bibliothèque de thèses », à paraîtr
A nanobody based approach to capture interactomes of dimeric protein complexes in living cells
No full textL’identité et le devenir de chaque cellule dépend du contenu en protéines et, en particulier, des réseaux d'interactions protéine-protéine (IPP, également appelés interactomes). Les protéines ont la propriété générale de s'engager dans des assemblages macromoléculaires très variés, chacun ayant des fonctions bien distinctes. Par conséquent, identifier les IPP et les lier à des complexes particuliers est un enjeu crucial mais difficile en biologie. Cette problématique a été au cœur de mon travail de doctorat. Une première partie de mon travail est dédiée à l'amélioration d'une méthode existante pour capturer de nouvelles IPP dans le contexte de fonctions biologiques définies. Ce travail a été réalisé avec ERK1, un régulateur clé en aval de plusieurs voies de signalisation impliquées dans de nombreux cancers. Les nouveaux outils ont été testés dans le contexte de fonctions de ERK1 sensibles à deux molécules inhibitrices dans les cellules humaines HEK293T. Une interaction a été confirmée aux niveaux fonctionnel et moléculaire, ainsi qu’en utilisant une stratégie d'imagerie originale pour accéder à la dynamique des IPP dans les cellules vivantes. La deuxième partie de mon travail de doctorat est dédiée à l'établissement d'une méthodologie pionnière pour capturer les IPP endogènes établies par un complexe protéique dimérique spécifique dans les cellules humaines vivantes. Cette méthodologie couple la Complémentation de Fluorescence Bimoléculaire (BiFC) et les technologies démarquage par la biotine de proximité. Plus précisément, elle repose sur l’utilisation d’un petit anticorps (appelé aussi « nanobody ») dirigé contre le complexe BiFC et fusionné à la ligase biotine TurboID. Ces outils ont été établis avec les complexes TAZ/14-3-3e et TAZ/TEAD2, qui traduisent respectivement l'activité de la voie de signalisation Hippo dans le cytoplasme et le noyau. Notre approche a permis de capturer les interactomes spécifiques de ces deux complexes protéiques et d'identifier un nouveau régulateur clé du complexe TAZ/14-3-3e pour contrôler ses fonctions de prolifération cellulaire. Dans son ensemble, mon travail de doctorat a introduit deux méthodologies complémentaires pour déchiffrer les réseaux d'IPP au niveau de fonctions biologiques spécifiques ou pour un complexe protéique spécifique en contexte cellulaire vivant. Ces approches offrent une nouvelle dimension pour comprendre les fonctions des protéines et les interactomes sous-jacents dans des contextes cellulaires normaux ou pathologiques.Cell fate and fitness depend on the protein content, and in particular on the interaction networks (also called interactomes) connecting the different proteins. Proteins have the general property to engage in diverse and occasionally overlapping macromolecular assemblies, each serving distinct purposes. Therefore, identifying protein-protein interactions (PPIs) and linking them to complexes is a crucial yet challenging issue in biology. This issue was at the core of my PhD work. The first part of my work was dedicated to the improvement of an existing method for capturing novel PPIs in the context of defined biological functions. This work was established with ERK1, which is a key downstream regulator of several signaling pathways involved in many different cancers. The new tools were tested in the context of two different inhibitory molecules to capture drug-sensitive interactions of ERK1 in human HEK293T cells. One such interaction was confirmed at the functional and molecular levels, by using an original imaging strategy to access the PPI dynamics in live cells. The second part of my PhD work was dedicated to the establishment of a pioneer methodology to capture endogenous PPIs established by a specific dimeric protein complex in human live cells. This methodology couples Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) and proximity biotin labelling technologies. More specifically, it is based on a GFP-nanobody directed toward the BiFC complex and fused to the TurboID biotin ligase. Tools were established to map TAZ/14-3-3 and TAZ/TEAD complexes interactome, which translate the activity of the Hippo signaling pathway in the cytoplasm and nucleus, respectively. Our approach allowed capturing specific interactomes of the two dimeric protein complexes and identifying a novel key regulator of TAZ/14-3-3 complexes in a cancer cell context. Collectively, my PhD work introduced two complementary methodologies for deciphering PPI networks in the context of specific biological functions or in the context of a specific protein complex in human live cells. These approaches provide a novel dimension for understanding protein functions and the underlying interactomes in normal or pathological cell contexts
Le digital Service Act : guide de lutte contre les contenus illicites
No full textInternational audienc
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