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Relação entre as vias de reparo de quebras duplas e excisão de nucleotídios em resposta às lesões induzidas por inibidores de topoisomerase 2
Get PDFO câncer se caracteriza por uma doença multifatorial e de alta complexidade, tornando-se, nas últimas décadas, um problema de saúde pública mundial. Dentre as principais abordagens de tratamento encontra-se a quimioterapia, que utiliza drogas com diferentes mecanismos de ação para atacar e controlar a proliferação das células tumorais, levando-as à morte. Existem então muitas estratégias para o combate desta doença, no entanto, apesar da ampla variedade e eficiência de muitos quimioterápicos, muitos tumores ainda apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Alguns mecanismos podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões geradas pelos quimioterápicos são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade da droga. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por inibidores de Topoisomerase 2 (TOP2), uma importante classe de quimioterápicos utilizada no tratamento de tumores de mama, osteosarcomas, leucemias, entre outros. Os trabalhos apresentados nesta tese tiveram como objetivo (1) compreender melhor o mecanismo de formação de lesões no DNA pelos inibidores de TOP2 e a influência da via NER, mais especificamente da proteína CSB, na resposta a estas lesões mediando a formação de quebras duplas no DNA; e (2) aplicar in vitro em células de câncer de mama um protocolo quimioterápico com um fármaco inibidor de TOP2 semelhante ao utilizado na clínica e avaliar a resposta destas células a longo prazo, mesmo após o final do tratamento, bem como analisar a expressão de genes da via NER em diferentes pontos deste protocolo. Além de apresentar uma revisão da literatura que aborda o papel das vias de reparo de DNA, com maior enfoque na via NER, em resposta a inibidores de TOP2, os demais trabalhos desenvolvidos durante a tese demonstram haver uma interação física da proteína CSB com TOP2 em resposta à tratamentos com inibidores de TOP2, encontrado por co-imunoprecipitação. Além disso, verificamos que a ausência de TOP2 por silenciamento gênico, mas não a sua inibição, favorece o acúmulo de estruturas como R-loops, híbridos de DNA:RNA que causam instabilidade genômica, no entanto não conseguimos relacionar a presença de CSB neste contexto. Com relação à aplicação do protocolo clínico nas células tumorais de mama, observamos que a proliferação das células tratadas foi bastante reduzida durante todo o protocolo utilizado, combinação de Doxorrubicina (DOX) e Paclitaxel. No entanto, quando as células foram acompanhadas ao final dos ciclos de DOX, ou ao final do protocolo completo, ambas as situações demonstraram que as células remanescentes apresentaram potencial para retomar seu crescimento. Ainda assim, de maneira geral pode-se dizer que a longo-prazo o protocolo utilizado apresentou uma boa eficiência em controlar esta proliferação. Ao analisar os níveis de expressão de diferentes genes da via NER após 1 ou 4 ciclos de tratamento com DOX constatamos uma maior expressão dos genes XPA, XPC, ERCC6 e ERCC4, bem como do gene MRE11, envolvido na reparação de quebras duplas, em relação às células não tratadas.Cancer is characterized by a multifactorial and highly complex disease, becoming, in the last decades, a world public health problem. Among the main approaches to treat this disease is chemotherapy, which uses drugs with different mechanisms of action to attack and control the proliferation of tumor cells, leading to death. Nowadays there are many strategies to combat this disease, however, despite the wide variety and efficiency of the chemotherapeutic drugs, many tumors still show resistance, resulting in a partially or totally ineffective treatment. There are some mechanisms known to be related to the development of this resistance profile, and the most studied one is the modulation of membrane proteins to increase the efflux of the drugs from the cells. Besides that, changes in DNA repair pathways also contribute to tumor resistance, since the chemotherapy-generated lesions can be removed before they become cytotoxic, thus reducing the effectiveness of the drug. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing and involvement of this pathway in response to Topoisomerase 2 (TOP2) inhibitors-induced lesions, which is an important class of chemotherapeutic used in the treatment of breast tumors, osteosarcomas, leukemias, etc. Considering that, the works presented in this thesis had 2 main goals: (1) understand the mechanism by which TOP2 inhibitors generate their lesions in the DNA and their influence of NER, more specifically CSB protein, in response to these lesions to mediate Double Strand Breaks (DSBs) in the DNA; and (2) apply a chemotherapy protocol using a TOP2 inhibitor similar to what is used in clinical practice and evaluate the long-term response of these cells, as well as analyze NER-genes expression at different time- points in this protocol. We present here a review that addresses the role of DNA repair pathways, focusing more on NER, in response to TOP2 inhibitors; besides that, the other works developed during the thesis demonstrate a physical interaction of CSB and TOP2 in response to treatments with TOP2 inhibitors, found by co-immunoprecipitation. In addition, we found that the absence of TOP2 by siRNA, but not its pharmacological inhibition, favors the accumulation of structures such as R-loops, DNA:RNA hybrids that cause genomic instability, but we could not relate the presence of CSB in this context. Regarding the application of the clinical protocol in breast tumor cells, we observed that the proliferation of the treated cells was greatly reduced throughout the protocol used, a combination of Doxorubicin (DOX) and Paclitaxel (PCTX). However, when cells were monitored at the end of DOX cycles, or at the end of the complete protocol, both situations demonstrated that the remaining cells had the potential to resume their growth. Nevertheless, in general we can conclude that at a long-term analysis, the protocol used presented a good efficiency in controlling this proliferation. When analyzing the expression levels of different NER genes after 1 or 4 DOX cycles we found a higher expression of XPA, XPC, ERCC6 and ERCC4 genes, as well as of MRE11, involved in the repair of DSBs, in relation to untreated cells
Influência de mecanismos de resposta a danos no DNA na resistência de células de leucemia ao antineoplásico Mitoxantrona
Get PDFA quimioterapia é uma das principais estratégias no tratamento do câncer. No entanto, muitos tumores apresentam resistência, tornando o tratamento parcial ou totalmente ineficaz. Existem alguns mecanismos que podem estar relacionados ao desenvolvimento desse perfil de resistência, sendo o mais estudado o aumento do efluxo das drogas através de proteínas de membrana celular. Por outro lado, uma alteração nas vias de reparo de DNA também contribui para a resistência tumoral, uma vez que as lesões são removidas antes mesmo de se tornarem citotóxicas para as células, reduzindo assim a efetividade do quimioterápico. Dentre as vias de reparo de DNA, a via do Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é uma das mais versáteis, e há estudos que demonstram seu envolvimento em resposta às lesões geradas por antraciclinas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a contribuição dos mecanismos de resposta à dano no DNA, bem como da via NER, na resistência à Mitoxantrona (MXT), um análogo de antraciclinas, na linhagem celular de leucemia HL-60/MX2. Para isso, analisou-se a sobrevivência celular, pelo método de exclusão por azul de tripan, o perfil de ciclo celular e a fosforilação da histona H2AX (γH2AX), por citometria de fluxo, além da análise de expressão gênica da via NER e proteínas de efluxo por qPCR. Os resultados indicam um perfil de resposta diferente entre a linhagem resistente e a linhagem sensível, observado pelo teste de sobrevivência e pelos diferentes perfis de ciclo celular e fosforilação de H2AX. Além disso, a análise de expressão gênica demonstra um aumento na expressão de genes da via NER, como ERCC1 já antes do tratamento e XPA após os tratamentos, na linhagem resistente. Estes resultados demonstram portanto envolvimento desta via de reparo de DNA na resistência tumoral da linhagem HL- 60/MX2.Chemotherapy is one of the main cancer treatment strategies; however, tumors can show resistance, which makes the treatment partial or totally inefficient. Among the mechanisms that may be related to the resistant profile, the most studied is increased drug efflux through ABC transporter permeases. On the other hand, altered DNA repair pathways may contribute to cancer resistance, since the lesions are removed before they become toxic to cells, which reduces chemotherapy effectiveness. Among DNA repair pathways, Nucleotide Excision Repair (NER) is one of the most versatile, and there are studies showing its involvement in removal of anthracyclines-induced lesions. Thus, our aim was to evaluate the contribution of DNA damage response mechanisms, focusing on NER, to the resistance to Mitoxantrone (MXT), an anthracycline analog, using the mitoxantrone-resistant leukemia cell line HL-60/MX2 as a model. After treatment with MXT and Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, cell survival was assessed by trypan blue exclusion method; cell cycle profile and H2AX histone phosphorylation (γH2AX) were evaluated by flow cytometry; and gene expression levels of NER and efflux proteins were determined by RT-qPCR. Results indicate a different response between the resistant HL-60/MX2 and the sensitive HL-60 cells, as observed in the survival assay, cell cycle, and H2AX phosphorylation profile. Furthermore, in the resistant cells, RTqPCR analysis showed an increase in the expression of NER genes, with ERCC1 expression increased before treatments, and XPA after the treatments. Therefore, our results indicate the contribution of NER machinery in the resistance of leukemia cells to Mitoxantrone
Influência do reparo por excisão de nucleotídeos na citotoxicidade do antineoplásico mitoxantrona
Get PDFA mitoxantrona (MXT) é um antineoplásico utilizado no tratamento de tumores como leucemias, linfoma não-Hodgkin e câncer de mama e próstata. Ela é classificada como uma antracenodiona, sendo um análogo estrutural das antraciclinas, como a doxorrubicina (DOX), cujo mecanismo de ação é baseado na inibição da enzima topoisomerase II (Topo II), através da formação dos complexos estabilizados Topo II-DNA. As antraciclinas e a MXT também são capazes de formar lesões do tipo adutos, pontes intercadeias de DNA (interstrand crosslink – ICL) e espécies reativas de oxigênio (ERO). Estudos têm demonstrado que a via de reparo por excisão de nucleotídeos (Nucleotide Excision Repair – NER) está envolvido na remoção de lesões no DNA induzidas pela DOX. Considerando as similaridades estruturais e de mecanismo de ação entre a MXT e a DOX, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da via NER na citotoxicidade da MXT, a fim de elucidar possíveis mecanismos envolvidos na resistência tumoral a esta droga. Os resultados encontrados demonstraram que células deficientes na via NER (XPA, XPD, XPC e CSB) apresentam elevada sensibilidade a MXT comparadas a células proficientes em reparo (MRC5). Apesar disso, células CSB (deficientes na subvia associada à transcrição - Transcription coupled – TCR-NER) são mais sensíveis a MXT que células XPC (deficientes na subvia de reparo global do genoma – Global genome repair – GGR-NER) e também apresentam diferenças no perfil de ciclo celular, síntese de DNA e formação dos complexos Topo II-DNA após tratamento com MXT. Células XPC, da mesma forma que as células proficientes MRC5 apresentam parada de ciclo celular em G2/M, recuperação da síntese de DNA e sinal semelhante para formação dos complexos Topo II-DNA, enquanto células CSB apresentam acúmulo de células na fase S, diminuição na síntese de DNA e sinal mais intenso para formação dos complexos Topo II-DNA. Além disso, a complementação das células CSB com a proteína CSB recuperou a resistência das células a MXT e também diminuiu a intensidade do sinal dos complexos Topo II-DNA. Estes resultados indicaram que a via NER está envolvida na resistência das células ao tratamento com MXT e que a proteína CSB ou a subvia TCR-NER tem um papel chave no processamento dos complexos Topo II-DNA.Mitoxantrone (MXT) is an antineoplastic drug used in treatment of tumors like leukemia, non-Hodgkin lymphoma and breast and prostate cancer. It is classified as an anthracenedione, being a structural analogue of anthracyclines, like doxorubicin (DOX), which action mechanism is based on topoisomerase II (Topo II) inhibition and formation of stabilized Topo II-DNA complexes. Anthracyclines and MXT also can form lesions like DNA adducts, interstrand crosslinks (ICL) and reactive oxygen species (ROS). Studies have shown that nucleotide excision repair (NER) pathway is involved in removal of lesions induced by DOX. Due to structural and action mechanism similarities between MXT and DOX, the aim of this work was to evaluate the influence of NER pathway in cytotoxicity of MXT, in order to elucidate possible mechanisms involved in tumor resistance to this drug. The results demonstrated that NER-deficient cells (XPA, XPD, XPC and CSB) show high sensitivity to MXT compared to repair proficient cells (MRC5). However, CSB cells (deficient in Transcription coupled repair – TCR) were more sensitive to MXT than XPC cells (deficient in Global genome repair – GGR) and also showed differences in cell cycle, DNA synthesis and Topo II-DNA complexes formation upon MXT treatment. XPC cells, in the same way as MRC5 proficient cells present G2/M cell cycle arrest, DNA synthesis recovery and similar signal for Topo II-DNA complexes formation, while CSB cells present accumulation of cells in S phase, reduced DNA synthesis and a more intense signal for Topo II-DNA complexes formation. Moreover, CSB cells complementation recovery MXT-resistance and also diminished Topo II-DNA complexes signal intensity. These results indicate that NER pathway is involved in cells resistance to MXT treatment and that CSB protein or TCR-NER sub pathway has a key role in processing of MXT induced Topo II-DNA complexes
Efeito citotóxico do Olaparib em células de câncer colorretal : estudo da influência de defeitos genéticos
Get PDFO câncer é a principal causa de morte nos paises economicamente desenvolvidos e a segunda em paises em desenvolvimento, resultado, em parte, da grande falta de especificidade dos tratamentos atualmente disponíveis. Por outro lado, uma aplicação clínica muito específica, denominada letalidade sintética, foi recentemente proposta. Nesta abordagem terapêutica os inibidores de poli(ADP-ribose) polimerases (PARP), também conhecidos como PARPis, mostraram-se capazes de induzir a morte celular seletiva em células tumorais com defeitos em BRCA1 e BRCA2 (ambas envolvidas no reparo de quebras duplas - DSBR). Assim, a excitante possibilidade de eliminar as células cancerígenas de maneira seletiva fez com que os PARPis passassem de interessantes ferramentas moleculares às mais promissoras drogas anticâncer da atualidade. Contudo, os mecanismos básicos envolvidos na citotoxicidade dos PARPis continuam pouco conhecidos e suas aplicações restritas a um pequeno grupo de cânceres. Por este motivo, neste trabalho, a citotoxicidade do Olaparib (um inibidor de PARP) foi investigada em um painel de linhagens de câncer colorretal (CRC). Os resultados demonstraram que o Olaparib é uma droga de ação lenta, cuja citotoxicidade pode ser modulada por defeitos genéticos em MLH1 (envolvido no reparo de bases mal-emparelhadas) e no supressor tumoral PTEN. Por outro lado, observou-se que o fenótipo MSI (Instabilidade de microssatélites) e os defeitos genéticos em p53 não influenciaram a citotoxicidade do Olaparib. Além disso, linhagens com resistência adquirida a Oxaliplatina (Oxp) e a 5-Fluorouracil (5- Fu) não apresentaram efeito refratário ao Olaparib, enquanto que linhagens com resistência adquirida a SN-38 (metabólito ativo do Irinotecano) apresentaram um forte efeito refratário. Finalmente, as associações de Oxp ou 5-Fu com Olaparib foram capazes de sensibilizar células com resistência relativa e adquirida. Juntos, estes resultados sugerem uma série de novas possibilidades para o emprego de inibidores de PARP no tratamento de CRC.Cancer is the main cause of death in developed countries and the second in lessdeveloped countries, that results in part from the low specific treatments available. However, a very specific therapeutic approach, called synthetic lethality, was recently proposed. The best documented synthetic lethal interaction was reported between poly(ADP-ribose) polymerases inhibitors (PARPis) and defects in BRCA1 and BRCA2 (both involved in double-strand break repair - DSBR), which may induce selective cancer cells death. Therefore, the exciting possibility to selectively kill cancer cells has been moving PARPis from interesting molecular tools to the forefront of cancer therapy research. However, the basic mechanisms involved in PARPis cytotoxicity are still poorly studied and its clinical applications are restricted to a small number of malignances. Herein, the Olaparib (PARPi) cytotoxicity was investigated in a colorectal cancer (CRC) cell line panel. The results demonstrated that Olaparib is a slow action drug, which may have its effects increased in cells with MLH1 (involved in mismatch repair) and PTEN (tumor supressor) defects. On the other hand, neither the MSI (microsatellite instability) phenotype nor the p53 defects were observed to influence on Olaparib cytotoxicity. Further, neither Oxp nor 5-Fu resistant cell lines presented cross-resistance to Olaparib, whereas a pronounced cross-resistance was observed for SN-38 (Irinotecan metabolite) resistant cell line. Finally, Olaparib associations with Oxaliplatin or 5-Fluorouracil were shown to sensitize cells with both relative and acquired resistances. Together, these results suggest a series of new possible uses for PARP inhibitors in CRC treatment
Atividade antimutagênica e citotóxica da β-glicana de Agaricus brasiliensis dependente da MAPK p38
Get PDFMuitos estudos têm demonstrado que extratos de Agaricus brasiliensis têm atividade citotóxica e antimutagênica, estes efeitos foram relacionados à β-glicana, um polissacarídeo constituinte de parede celular presente em um grande numero de organismos. No entanto, os mecanismos pelos quais este composto atua ainda não foram elucidados. O propósito deste trabalho foi identificar as possíveis vias de sinalização celular pelas quais a β-glicana induz os seus efeitos. Nós empregamos o inibidor da Proteína Cinase Ativada por Mitógeno p38 (MAPK p38) para avaliar a possível participação desta proteína de sinalização celular nas atividades citotóxica e antimutagênica da β-glicana. Os efeitos da β-glicana sobre a citotoxicidade (Sulforhodamine B – SRB – e thiazolyl blue tetrazolium bromide – MTT), antimutagênese (Micronúcleos), ciclo celular (Citometria de fluxo) e indução de apoptose (Vybrant® Apoptosis Assay Kit) foram verificados na linhagem celular H460 (Adenocarcinoma de efusões pleurais). Citotoxicidade foi observada com altas concentrações do polissacarídeo, porém estas concentrações não induziram a apoptose pelo ensaio Vybrant®. No entanto, as mesmas concentrações levaram a um grande acumulo de células em G2/M, indicando que a citotoxicidade da β-glicana resulta de sua capacidade de induzir a paradas de G2/M que podem inibir a proliferação celular. Por outro lado, concentrações não citotóxicas exibiram efeito antimutagênico, reduzindo o dano ao DNA induzido pelo MMS e permitindo a progressão do ciclo celular. Além disso, tanto a antimutagênese quanto a citotoxicidade da β-glicana foram inibidas pelo uso do inibidor da MAPK p38, demonstrando que estas duas diferentes atividades são dependentes de uma mesma via de sinalização celular.Many studies have demonstrated that Agaricus brasiliensis has cytotoxic and antimutagenic activities; these effects were related to ß-glucan, a polysaccharide constituent of the cell wall present in a large number of organisms. However, the exact mechanisms by which ß-glucan acts are not yet elucidated. The purpose of this work was to better undestand the possible signaling pathways by which ß-glucan carries its effects. We employed a p38 Mitogen Activated Protein Kinase (p38 MAPK) inhibitor (SB 202190) to evaluate the possible involvement of this signaling protein in the antimutagenic and cytotoxic activities of ß-glucan. Its effects on cytotoxicity (Sulforhodamine B – SRB – e thiazolyl blue tetrazolium bromide – MTT), antimutagenesis (Micronucleus assay), cell cycle progression (Flow Cytometry) and apoptosis induction (Vybrant® Apoptosis Assay Kit) were evaluated in H460 (human, pleural effusion, adenocarcinoma) cell line. Cytotoxicity was only observed at high concentrations of the polysaccharide. These concentrations did not induce a significant induction of apoptosis. However, these same concentrations trigger a high G2/M arrest, indicating that cytotoxicity of ß-glucan in H460 results from its capacity to induce cell cycle arrest that could prevent cell proliferation. On the other hand, low concentrations showed antimutagenesis effect, reducing MMS-induced DNA damage and allowing cell cycle progression. Besides, both antimutagenesis and cytotoxicity were greatly abrogated by the use of p38MAPK inhibitor, showing that these different activities are dependent on the same signaling pathway
Avaliação da indução de senescência e apoptose pelo tratamento com antraciclinas em fibroblastos humanos deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos
Get PDFDentre os agentes antitumorais, as antraciclinas Doxorrubicina (DOX) e Daunorrubicina (DNR) estão entre as drogas mais utilizadas. Seu mecanismo de ação classicamente reconhecido é a inibição da enzima topoisomerase II. No entanto estes agentes são responsáveis ainda pela geração de radicais livres, formação de pontes inter e intracadeia e de adutos no DNA. Pouco se sabe sobre como essas lesões são reparadas, mas existem indícios do envolvimento do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) na remoção dessas lesões. O NER é uma das vias mais versáteis de reparo envolvido principalmente em lesões que levam a desestabilidade na dupla hélice do DNA. Neste trabalho linhagens celulares de fibroblastos humanos proficientes (MRC5) e deficientes no NER (CSB, XPA e XPD) foram submetidas ao tratamento com DOX e DNR e avaliadas para viabilidade celular, morfologia nuclear, apoptose e senescência. Os resultados aqui obtidos demonstram que as linhagens deficientes no NER são mais sensíveis aos agentes do que a respectiva linhagem proficiente, e que morrem principalmente por apoptose. Quando avaliada a senescência celular, percebeu-se que as linhagens MRC5 e XPA entram em senescência com os tratamentos utilizados enquanto que nas linhagens CSB e XPD não se observa a mesma resposta. Provavelmente o resultado encontrado decorre do fato de CSB e XPD exercerem papel na transcrição e morrerem por apoptose antes de entrar em senescência, ou ainda pela importância delas na indução de senescência. Além disso, observou-se independência do mecanismo de inibição da topoisomerase II na citotoxicidade causada por DOX e DNR. Somando-se os dados encontrados, podemos sugerir que o NER tem envolvimento no reparo das lesões causadas por DOX e DNR, e que essa via possivelmente está associada à resistência encontrada na terapia clínica do câncer com essas drogas
Estudos dos alcalóides β-carbolínicos em diferentes modelos biológicos
Get PDFOs alcalóides β-carbolínicos possuem uma ampla distribuição, sendo encontrados em várias famílias de plantas, além de estarem presentes na fumaça do cigarro, bebidas alcoólicas, alimentos excessivamente cozidos e em mamíferos. Estes alcalóides são conhecidos por apresentarem várias ações farmacológicas sobre os sistemas nervoso central, muscular e cardiovascular, causando alucinações, tremores, convulsões, hipotensão e bradicardia. Possuem também atividade antioxidante e imunossupressora, além de ligarem-se a receptores de serotonina, dopamina, benzodiazepina; são também inibidores das enzimas monoamino-oxidase-A (MAO-A) e DNA topoisomerases. Os objetivos do presente estudo foram avaliar os possíveis efeitos antioxidantes, antimutagênicos, antigenotóxicos e neurocomportamentais dos alcalóides β-carbolínicos: harmano, harmina, harmol, harmalol e harmalina, utilizando teste de sensibilidade e antimutagênese em Saccharomyces cerevisiae, ensaio cometa em cultura de células de pulmão de hâmster chinês (V79) e avaliação do comportamento, através da tarefa de reconhecimento de novo objeto, em camundongos, respectivamente. Em testes de sensibilidade, todos os alcalóides protegeram as linhagens deficientes em sistemas de defesa antioxidante de S. cerevisiae contra danos induzidos pelos oxidantes H2O2 e paraquat. De maneira geral, os alcalóides β-carbolínicos protegeram mais as células dos danos gerados pelo H2O2 e o aumento da viabilidade foi mais significativo para as linhagens sod1Δ, sod2Δ e sod1Δsod2Δ. Também, possivelmente por uma ação seqüestradora de espécies reativas de oxigênio, os alcalóides β-carbolínicos mostraram forte atividade contra danos no DNA induzidos pelo H2O2, no teste de antimutagênese com a linhagem N123 de S. cerevisae e no teste de antigenotoxicidade, utilizando o ensaio cometa com células V79. As dihidro-β-carbolinas harmalina e harmalol mostraram um efeito mais pronunciado que as β-carbolinas nos ensaios citados acima. Quanto à avaliação dos efeitos neurocomportamentais em camundongos, a administração sistêmica dos alcalóides β-carbolínicos facilitou a formação de memória de curta duração, no caso da harmina, harmol e harmalina e, também a memória de longa duração (harmalina) em camundongos, verificada com uso da tarefa de reconhecimento de novo objeto
Avaliação das atividades mutagênica, antimutagênica e antioxidante de extrato e frações biologicamente ativas de Uncaria tomentosa
Get PDFA planta Uncaria tomentosa, pertencente à família Rubiaceae, tem sido utilizada na medicina tradicional para tratar diversas condições de saúde. Estudos investigando a atividade biológica de extratos e frações demonstraram atividades anti-inflamatória, antiviral, antimutagênica e antioxidante. Este trabalho tem como objetivo avaliar as atividades mutagênica, antimutagênica e antioxidante de um extrato etanólico bruto de U. tomentosa e de quatro frações isoladas obtidas a partir deste extrato, através de ensaios utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae e ensaios in vitro. O extrato e as frações apresentaram ausência de citotoxicidade e mutagenicidade em doses de até 500 μg/mL, e não foram capazes de proteger contra os agentes óxido de 4-nitroquinoleína e peróxido de hidrogênio. As frações de derivados quinóvicos e de polifenóis apresentaram atividade sequestradora de radical livre DPPH e redução do estresse oxidativo em levedura medido pelo teste de oxidação da diclorofluoresceína
Efeito do óleo essencial de Piper gaudichaudianum Kunth e do seu componente majoritário nerolidol sobre a estabilidade genômica de Saccharomyces cerevisiae
Get PDFPiper gaudichaudianum Kunth é uma planta da família Piperaceae, que se desenvolve abundantemente em toda a Mata Atlântica, sendo popularmente conhecida como pariparoba, jaborandi ou iaborandi. Na medicina popular suas raízes frescas são mastigadas e utilizadas como antiflamatório no alívio de dores de dente e contra distúrbios hepáticos. Um dos componentes mais estudados desta planta é o óleo essencial, cujas análises fitoquímicas revelaram o (E)-nerolidol como um dos compostos majoritários. No presente estudo, foram avaliadas as propriedades citotóxicas e mutagênicas, bem como investigados os mecanismos de citotoxicidade do óleo essencial de P. gaudichaudianum e de seu componente majoritário nerolidol, utilizando diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae. Foram empregadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em genes de reparo para excisão de bases (BER), excisão de nucleotídeos (NER), recombinação homóloga (HR), recombinação não-homóloga (NHEJ), reparo pós-replicativo (PRR) e síntese translesão (TLS). A influência do sistema redox foi avaliada em linhagens de S. cerevisiae deficientes em superóxido dismutase e/ou catalase. Os resultados dos tratamentos das linhagens XV185-14c e N123 de S. cerevisiae demonstram que, tanto o óleo essencial de P. gaudichaudianum, quanto o nerolidol induzem citotoxicidade de maneira dose dependente, sendo essa citotoxicidade mais pronunciada nos tratamentos com nerolidol. Nas avaliações de mutagênese o óleo essencial induziu efeito mutagênico na linhagem XV185-14c na concentração mais alta, entretanto o nerolidol não induziu qualquer tipo de efeito mutagênico. Os ensaios com as linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em reparo revelaram um importante papel da via BER no efeito citotóxico, tanto para os tratamentos com óleo essencial, o qual induziou uma grande sensibilidade na linhagem deficiente na DNA glicosilase Ntg2, quanto para o nerolidol, que induziu sensibilidade nas mutantes para a endonuclease Apn1 e glicosilase Ntg1. Curiosamente, linhagens deficientes em TLS e PRR não apresentaram sensibilidade aos tratamentos com o óleo essencial de P. gaudichaudianum, entretanto os simples mutantes rev1, rad30 e rad18 demonstraram notável resistência ao nerolidol. Além disso, verificou-se em linhagens deficientes na enzima superóxido dismutase (sod1 e sod2) um aumento de sensibilidade nos tratamentos com o óleo essencial e com o nerolidol. No ensaio de detecção de radicais livres, por 2’7’-diclorofluoresceína (DCFH-DA), verificou-se que ambos tratamentos induzem aumento de espécies reativas de oxigênio. Considerando a resposta das diferentes linhagens de S. cerevisie utilizadas neste estudo, o conjunto destes resultados leva-nos a sugerir que tanto o óleo essencial quanto o nerolidol não são mutagênicos e que a citotoxicidade induzida pelo óleo essencial está relacionada com a formação de lesões oxidativas, sendo o nerolidol o principal responsável pelos efeitos biológicos induzidos pelo óleo essencial de P. gaudichaudianum.Piper gaudichaudianum Kunth is a plant of the Piperaceae family, which develops abundantly throughout the Atlantic Forest, popularly known as pariparoba, jaborandi or iaborandi. In popular medicine the fresh roots are chewed and used as antinflamatory to relief of toothaches, and against liver disorders. One of the most studied components of the plant is the essential oil, which the phytochemical analysis revealed (E)-nerolidol as major compound. In the present study, we have evaluated the cytotoxicity and mutagenicity, as well as investigated the mechanism of cytotoxicity of essential oil of P. gaudichaudianum and its major component nerolidol using different strains S. cerevisiae. Strains deficient in DNA repair mechanisms such as base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), homologous recombination (HR), non-homologous end joining (NHEJ), post-replication repair (PRR) and translesion synthesis (TLS) were employed. The influence of the redox system was evaluated in superoxide dismutase and/or catalase defective strains. The results of treatment of XV185-14 and N123 S. cerevisiae strains demonstrated that the essential oil and nerolidol induced cytotoxicity in a dose dependent manner, and this cytotoxicity is more pronounced with nerolidol treatments. In the mutagenicity assay only P. gaudichaudianum essential oil, but not nerolidol was able to induce mutagenic effect at highest concentration in XV185-14c strain. Employing S. cerevisiae strains proficient and deficient in DNA repair treated with P. gaudichaudianum essential oil and neroliodol, it was observed an important role of the BER pathway in the cytotoxic response, since the essential oil induced a great sensitivity in strain deficient in DNA glycosylase Ntg2, and nerolidol in mutants deficient in Apn1 endonuclease and glycosylase Ntg1. Interestingly, deletion of TLS and PRR proteins had no influence on sensitivity to the essential oil, however single mutants rev1, rad30 and rad18 exhibited a remarkable resistance to nerolidol. Besides, the absence of superoxide dismutase enzyme increases the sensitivity to essential oil and nerolidol. In the 2`,7`-dichlorofluorescin (DCFH-DA) assay for detection of free radical generation, both treatments were able to increase ROS production. Considering the response of the different S. cerevisiae strains used in this study, our results demonstrate that P. gaudichaudianum essential oil and its major compound nerolidol are not mutagenic but do induce significant cytotoxic effects in S. cerevisiae that might be related to ROS generation. The cytotoxicity observed is mainly related to the generation of oxidative lesions. Moreover, nerolidol is the major compound responsible for the biological effects induced by P. gaudichaudianum essential oil
Interações genéticas entre o gene kin3 e os genes do complexo mrx de saccharomyces cerevisae
Get PDFNa levedura Saccharomyces cerevisiae, o gene KIN3 codifica uma serina-treonina cinase cuja função ainda é desconhecida. A proteína Kin3 é homóloga estrutural da proteína NIMA, de Aspergillus nidulans, a qual é necessária para a transição da fase G2/M do ciclo celular, e ainda possui papel na resposta a danos no DNA. Cinases relacionadas à NIMA (Nek´s) foram identificadas em diferentes espécies, e mamíferos contêm 11 Nek´s. Algumas destas cinases apresentam propriedades semelhantes a NIMA, estando envolvidas na progressão do ciclo celular e na resposta a danos no DNA. A proteína Kin3 possui propriedades semelhantes a Nek1 e Nek2. Nek1 interage com proteínas envolvidas na sinalização e reparação de danos no DNA. Linhagens mutantes kin3Δ são defectivas na parada da fase G2/M do ciclo celular em resposta a danos no DNA e apresentam uma pronunciada sensibilidade a diversos agentes mutagênicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação do gene KIN3 com os genes do complexo MRX (MRE11/RAD50/XRS2), envolvido na sinalização e reparação de danos no DNA, bem como na manutenção da integridade dos cromossomos. O perfil de sensibilidade dos simples e duplos mutantes sugerem uma interação epistática entre o gene KIN3 e os genes do complexo MRX, na resposta a danos causados por 8-metoxipsoraleno fotoativado, cisplatina e mustarda nitrogenada. A expressão do gene KIN3 durante estresse mutagênico não apresentou diferenças significativas entre a linhagem selvagem e as linhagens mutantes mre11Δ, rad50Δ e xrs2Δ. Os resultados obtidos ainda indicam que a proteína Kin3 possa estar agindo junto com o complexo MRX na via Mec1/Tel1 de sinalização de danos no DNA.In the yeast Saccharomyces cerevisiae, the KIN3 gene codifies a serine-threonine cinase whose function is still unknown. The Kin3 protein is a structural homolog of NIMA protein of Aspergillus nidulans, which is necessary to G2/M transition, and has a role in DNA damage response. NIMA-related kinases (Nrk´s) were identified in different species, and mammals contain eleven Nrk´s. Some of these kinases display similar properties with NIMA, being involved in cell cycle progression and DNA damage response. The Kin3p have similar properties with Nek1 and Nek2. Nek1 interacts with proteins involved in signaling and repair of DNA damage. Mutant strains in KIN3 are defective in the G2/M-phase checkpoint in response to DNA damage and display a pronounced sensitivity to several mutagens. The aim of this work was to evaluate the interaction between KIN3 gene and the genes of MRX complex (MRE11/RAD50/XRS2), involved in signaling and repair of DNA damage, as well in the maintenance of chromosome integrity. The sensitivity profile of single and double mutants suggests an epistatic interaction between the KIN3 gene and the genes of MRX complex, in damage response induced by photo-activated methoxypsoralen, cisplatin and nitrogen mustard. The KIN3 gene expression during mutagenic stress does not show significant differences between the wild type and mutant strains mre11Δ, rad50Δ and xrs2Δ. The obtained results indicate that the Kin3 protein can act together with the MRX complex in the Mec1/Tel1 pathway of DNA damage signaling
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