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Design von biokompatiblen Oberflächen basierend auf genetisch veränderten Oligomeren der Lumazine Synthase
No full textThe aim of the present work was to test and optimise various genetically engineered species of the protein oligomer Lumazine Synthase to improve their potential for bio-functionalisation of solid surfaces. Neutron reflectivity was used to investigate the profile of an adsorbed protein layer perpendicular to the surface. Lumazine Synthases were used for the setup of model systems of the actin cortex at both, the air/water-interface and at solid surfaces. The filament undulations were compared to the movements predicted by a newly developed theory for semiflexible filaments under such condition.Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene rekombinant hergestellte Spezies des Proteins Lumazine Synthase auf ihre Möglichkeiten zur Biofunktionalisierung anorganischer Oberflächen zu testen und deren Verwendbarkeit durch entsprechende Modifikationen zu optimieren. Mit Neutronenreflexion wurde nachgewiesen, dass die Moleküle als Monoschicht adsorbieren. Der Aufbau von Modellen des Aktincortexes wurde mit Lumazine Synthase sowohl an der Wasser/Luft-Grenzfläche als auch an festkörpergestützten Oberflächen realisiert. Mit fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen und einer selbstentwickelten Bildverarbeitungssoftware wurde die Bewegung der Aktinfilamente an Festkörpergrenzflächen analysiert und mit einer neuen Theorie zur Bewegung semiflexibler Filamente unter den oben genannten Bedingungen verglichen
Generische und spezifische Zelladhäsion
No full textThe development of a technique to measure the adhesion forces of receptor-ligand pairs under biocompatible conditions is the main focus of this thesis. The established reflection-interference contrast microscopy technique is upgraded to allow for measurements of the absolute distances between adhering membranes and solid surfaces. Giant vesicles are used to study the receptor-mediated adhesion to solid supported membranes. Introducing a soft polymer film between substrate and membrane makes it possible to attach receptors to surfaces without a considerable loss of their functionality. Absolute unbinding forces can be determined by the controlled detachment of the adhered giant vesicles from the substrate using magnetic tweezers. Moreover, the generic unbinding is shown to be a first order phase transition from an detailed analysis of the membrane fluctuations.Die Entwicklung einer Technik zur Messung der Adhäsionskräfte von Rezeptor-Ligand Paare unter biokompatiblen Bedingung stehen im Mittelpunkt der Arbeit. Die bestehende Reflektions Interferenz Kontrast Mikroskopie wurde erweitert und ermöglicht nun den absoluten Abstand zwischen adhärirenden Membranen und Festkörperoberflächen zu messen. Riesenvesikel werden benutzt um die Rezeptor vermittelte Adhäsion zu Oberflächen zu messen. Indem weiche Polymerfilme zwischen das Substrat und die Membran gebracht wurde, konnte weitgehend eine Verlust der Funktionalität der Rezeptoren vermieden werden
Viscoelastic Microscopy of the Cell Envelope of Human Endothelial Cells
No full textDie Arbeit beschreibt die viskoelastischen Eigenschaften der Zellhülle von humanen Endothelzellen. Durch die Beobachtung und die kontrollierte Auslenkung von magnetischen, an die Zellmembran gebundenen Kolloiden mit Hilfe der magnetischen Pinzette konnten die viskosen und elastischen Beiträge der Zellhülle in verschiedenen Zeitregimen bestimmt werden. Durch die Ausübung unterschiedlicher Kraftprofile (Dreieck, Rechteck, Treppe) auf die Magnetkolloide konnte die Gültigkeit der Theorie der linearen Viskoelastizität für die Zellmembran getestet werden. Über die Bindung von Invasin-beschichteten, unmagnetischen Kugeln ist es erstmals gelungen, das Deformationsfeld einer Punktstörung auf Endothelzellen zu visualisieren. Als Anwendung der Technik wurde der Einfluss von zytoskelettstimulierenden und zytoskelettzerstörenden Substanzen untersucht.The thesis discribes the viscoelastic properties of the cell envelope of human endothelial cells. By observation and controlled displacement of magnetic particles linked to the cell membrane ("magnetic tweezers") it was possible to determine the viscous and elastic contributions of the cell envelope in different time regimes. By application of various force profiles (triangle, square and step forces) to the magnetic beads the validity of the theory of linear viscoelasticity in respect to the cell membrane could be varified. By linkage of non-magnetic, Invasin-coated beads it was possible for the first time to visualise the strain field of endothelial cells caused by the action of a point force. As an application of the technique the influence of agents, which stimulated or disrupted the cytoskeleton, on the properties of the cell envelope was investigated
Identification of macromolecular complexes in electron tomograms of ice-embedded phantom cells
No full textDie Elektronentomographie ist die am allgemeinsten anwendbare Technik zur dreidimensionalen Strukturforschung mittels Elektronenmikroskopie. Es ist die einzige Methode zur Untersuchung pleomorpher Strukturen, von supramolekularen Komplexen, Organellen und zellulären Modellsystemen bis hin zu ganzen Zellen. Durch die Einführung automatisierter Datenerfassungssysteme ist es neuerdings möglich, in Eis eingebettete biologische Systeme in quasi-nativem Zustand zu untersuchen. Die vielversprechendste Entwicklung der Elektronentomographie ist ihre Anwendung auf zelluläre Organellen und ganze Zellen: Erstmals können makromolekulare Komplexe in ihrer quasi-nativen Umgebung dreidimensional visualisiert werden. Die Identifikation dieser Komplexe anhand ihrer strukturellen Signatur war bei der bislang erzielten Auflösung jedoch noch nicht möglich. Ein vorrangiges Ziel war folglich die Auflösung von zellulären Objekten zu verbessern. Die durchgeführte Installation eines 300 kV Mikroskops mit Feldemissionskathode und eines Energiefilters ermöglichte es erstmals, pleomorphe eiseingebettete Präparate mit einer Auflösung unter 4 nm abzubilden. Die dreidimensionale Untersuchung eines Modellsystems zur Injektion viraler DNS in Wirtszellen hat nicht nur gezeigt, dass die Auflösung um den Faktor 2 verbessert werden konnte; zusätzlich erlaubte die verbesserte Abbildungsqualität wichtige Rückschlüsse zur Wechselwirkung zwischen Virus und Wirt zu ziehen: Der Virenschwanz vollzieht beim Binden an das Wirtsprotein eine drastische Konformelle Änderung und dringt ca. 23 nm in den Wirt ein. Die strukturelle Untersuchung führte zu einem mechanistischen Modell, welches den Transfer der viralen DNS durch die Zellhülle beschreibt. Obwohl die Qualität der tomographischen Rekonstruktionen verbessert werden konnte, ist eine Interpretation der Tomogramme durch visuelle Inspektion auf Grund des hohen Rauschanteils schwer vorstellbar. Folglich wurden rechnerisch realisierbare Algorithmen zur Identifikation makromolekularer Komplexe entwickelt und auf verschiedene Modellsysteme angewandt. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Identifikation schon bei schlechterer Auflösung möglich ist, falls die molekularen Komplexe aus dem Zellverbund aufgereinigt werden. Bei einer Präparatdicke ab 250 nm ist eine Auflösung von 4 nm notwendig, um strukturell ähnliche Komplexe, wie z.B. das Thermosom, GroEL oder das 20S Proteasom zu unterscheiden. Die Anwendung der Algorithmen auf Protein-gefüllte Vesikel - sogenannte Phantomzellen - zeigt, dass mit dem momentanen experimentellen Aufbau bereits mehr als 90% der Partikel in einer quasi-zellulären Umgebung korrekt identifiziert werden können.Electron tomography is the most widely applicable method for obtaining three-dimensional information by electron microscopy. It is, in fact, the only method for investigationg pleomorphic structures, ranging from supramolecular assemblies, organelles and cellular model systems to whole cells. With the recent developments of automated data-acquisition schemes, it is now possible to study biological systems embedded in vitreous ice under low-dose conditions with minimal perturbations of the physiologic state. The most promising development in electron tomography is its application to cellular organelles and whole cells: macromolecular complexes can now be visualized three-dimensionally in their native cellular environment with molecular resolution. However, the identification of these macromolecular complexes by virtue of their structural signature is not possible at the resolutions reached so far. Consequently, a major challenge was to improve the resolution of electron tomograms of cellular objects. The installation of a 300 kV microscope with a field-emission gun and an energy filter allows to visualize pleomorphic biological samples three-dimensionally with a resolution below 4 nm for the first time. The three-dimensional analysis of a model system for the injection of viral DANN into host cells did not only reveal that the resolution could be improved by a factor of two, but the advanced imaging capabilities also allow to draw important conclusions concerning the interactions of virus and host: upon binding to the bacterial receptor protein, the tail undergoes a major conformational change and protrudes 23 nm into the host. This observation led to a mechanistic model how the viral DNA is transferred across the cell envelope. Even though the quality of the tomographic reconstructions could be improved, one cannot expect to be able to interpret such tomograms by visual inspection. Hence, computational feasible algorithms to identify macromolecular complexes within the cellular environment were mapped out and applied to several model systems. The results show that the identification is possible even at lower resolutions, given that the macromolecular complexes are purified biochemically from the cellular context. For specimens thicker than 250 nm, a resolution better that 4 nm turns out to be necessay to distinguish complexes structurally as similar as the Thermosome, GroEL and the 20S Proteasome. The application of the identification algorithms to protein-filled vesicles - so called phantom cells - reveals that more than 90 % of the particles can be identified correctly within their quasi-cellular anvironment with the presently used setup
Establishment of a model system of cell adhesion via specific bonds of low affinity
No full textIn der vorliegenden Arbeit wird ein Modellsystem etabliert, das es erlaubt, neue Einblicke in die Wechselwirkungsmechanismen der Zell-Zell-Adhäsion zu gewinnen. Es ist dabei gelungen, die spezifische Wechselwirkung, die durch ein Rezeptor-Ligand-Paar mit geringer Affinität vermittelt wird, und deren Zusammenwirken mit unspezifischen Wechselwirkungen sowohl im thermodynamischen Gleichgewicht als auch unter Einfluss einer äußeren Störung zu charakterisieren. Das verwendete Rezeptor-Ligand-Paar (das Membranprotein E-Selektin und das Glykolipid Sialyl-LewisX-Lipid) spielt unter anderem eine wichtige Rolle in der Migration von Leukozyten aus den Blutgefäßen ins entzündete Gewebe während der Immunantwort. Das Modellsystem besteht aus einschaligen Riesenvesikeln mit rekonstituierten Liganden, die als Testzellen dienen und festen Substraten mit adhärierten Rezeptoren, die als Zielzellen fungieren.In the work presented here a model system which provides new insights into the interaction mechanisms of cell-cell adhesion is established. The main achievement was the characterisation of specific interactions mediated by a receptor-ligand pair of weak affinity and their interplay with unspecific interactions both in thermodynamic equilibrium and under the influence of an external disturbance. The receptor-ligand pair used (the membrane protein E-selectin and the glycolipid Sialyl-LewisX-lipid) plays an important role, among other things, in the migration of leukocytes during immune response. The model system consists of unilamellar giant vesicles with recostituted ligands which mimic model cells and solid substrates with adhered receptors which mimic target cells
Development of a fast digital imaging software and interferometric 2 λ-microscopic technique
No full textMikrooptische Methoden in Kombination mit schneller Bildverarbeitung werden in der biophysikalischen Forschung immer wichtiger. Im technischen Teil dieser Arbeit wurde ein speziell auf die Bedürfnisse der Biophysik zugeschnittenes Bildverarbeitungsprogramm entwickelt. Zur Messung absoluter Abstände im Nanometerbereich zwischen Substraten und Objekten wurde erstmals die Reflexions-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie mit zwei Wellenlängen realisiert. Mit Hilfe dieser Techniken konnten verschiedene Zellmodelle untersucht werden: Vesikel aus Lipidmembranen mit Zusatzkomponenten als Modell für eine geschlossene Zellhülle, spezifisch an eine Membran gekoppelte Hyaluronsäuremoleküle als Modell für die extrazelluläre Matrix und Aktinnetzwerke als Modell für das Zytoskelett.Microptic methods in combination with fast image processing, is becoming ever more important in the field of biophysical research. In the technical part of this work, an image processing software designed to the needs of biophysics was developed. For the measurement of absolute distances between substrates and objects in the nanometer range, the reflection interference microscopy with two wavelengths was realised for the first time. With the help of these techniques, different cell models could be examined: Vesicles made of lipid membranes with additives as models for a closed cell membrane, hyluronan coupled specifically to a membrane as a model for the extracellular matrix and actin networks as a model of the cytoskelleton
Modellierung der Zelladhäsion und ihrer Kontrollmechanismen mit einem Vesikle-Substrate-System
No full textA discrete model for vesicles adhering to flat substrates by formation of ligand-receptor bonds has been developed resulting in equilibrium number of formed bonds and the effective adhesion strength produced by these bonds. This discrete model is a foundation for modeling the adhesion control mechanisms. The first one studied is the unbinding of vesicles by antagonist competing with ligands for receptors. Two unbinding mechanisms are identified and characterized both theoretically and by analysis of experimental data. The second control mechanism studied is the influence of the external force. Tethered shapes of strongly adhered vesicles and the deformation of weakly adhered vesicles are calculated with continuum techniques. The effective adhesion strength obtained from the discrete model for a given size of the contact zone is found to be an input parameter for the continuous models. The unbinding process of strongly and weakly adhered vesicles is determined and, for the case of weak adhesion successfully compared with experimental data.In dieser Arbeit wurde ein diskretes, analytisches Modell der Vesikeladhäsion auf planaren Substraten entwickelt. Die Adhäsion wird mittels spezifischer Liganden-Rezeptor Bindungen vermittelt. Es wurde die im Gleichgewicht gebildete Anzahl der Verbindungen, und damit die effektive Adhäsionskraft, berechnet. Dieses Modell wurde angepasst um das Ablösen der Vesikel durch Verdrängung durch Antagonisten, die im Wettbewerb mit den Liganden stehen, zu beschreiben. Zwei Ablösemechanismen wurden identifiziert und sowohl theoretisch als auch experimentell untersucht. Um die Deformation, insbesondere die von stärk adhärierten, tethered Vesikeln, unter dem Einfluss externer Kräfte berechnen zu können mussten Kontinumstechniken verwendet werden. Nur die Kombination des Kontinuumansatzes mit dem diskreten analytischen Modells erlaubte es den Ablöseprozess dieser Vesikel zu charakterisieren. Die Ergebnisse wurden für den Fall von schwacher Adhäsion erfolgreich mit experimentellen Daten verglichen
static and dynamic lightscattering on solutions of f-actin
No full textUnter geeigneten Bedingungen polymerisiert das Zytoskelettprotein Aktin zu Filamenten. Aufgrund der außerordentlichen Konturlängen dieser Polymere (bis in den 100 µm Bereich) sind Lösungen dieser Polymere äußerst fruchtbare Modellsysteme für die Polymerphysik. Insbesondere die Effekte einer endlichen Kettensteifheit können an diesen Lösungen studiert werden, da Aktinfilamente eine Persistenzlänge von ca. 20 µm aufweisen. In dieser Arbeit wurden Aktinlösungen mit Hilfe der Lichtstreuung untersucht. Diese Technik erlaubt eine störungsfreie Messung an homogenen, isotropen Aktinnetzwerken. Aktinkonzentrationen variierten von 7 bis 24 µM, was mittleren Abständen zwischen den Filamenten von 0,27 µm bis 0,50 µm entspricht. Es wurden Streuvektoren im Bereich von 12 µm-1 bis 30 µm-1 verwendet, d.h. die Polymerlösung wurde auf der Längenskala der Abstände zwischen benachbarten Filamenten untersucht. Auf dieser Längenskala findet der bisher unverstandene und für die theoretische Beschreibung des Systems fundamental wichtige Übergang vom Einzelfilamentverhalten zum Kontinuumsverhalten statt. Die Struktur der Lösungen wurde mittels statischer Streuung erforscht. Es wurde hier erstmals eine Positionskorrelation zwischen nächsten Nachbarn gefunden, analog zur Dichtekorrelationsfunktion in einer Flüssigkeit. Diese Korrelation wird ausgeprägter mit steigender Dichte des Netzwerks. Dynamische Lichtstreuung erlaubte die Messung der Dichtefluktuationen des Netzwerks auf einer Zeitskala von 100 nsec bis zu einer halben Stunde. In diesen Experimenten wurde ein zweistufiger Zerfall der Autokorrelationsfunktionen der Streulichtinensität gefunden. Auf kurzen Zeiten (bis zu ca 0.1 sec) liegt ein gestreckt exponentieller Zerfall der Autokorrelationsfunktion vor, bei längeren Zeiten wurde ein wesentlich langsamerer Prozess gefunden, der durch einen näherungsweisen logarithmischen Zerfall der Autokorrelationsfunktionen gekennzeichnet ist. Der relative Anteil des gestreckt exponentiellen Zerfalls nimmt mit sinkender Dichte und wachsenden Streuvektoren zu. Der gestreckt exponentielle Zerfall konnte erfolgreich mit einer Theorie für die Dynamik isolierter, semiflexibler Polymere beschrieben werden. Der im Experiment gefundene Exponent von 0,72±0,02 stimmt hervorragend mit dem Theoriewert von 3/4 überein. Eine Auswertung der charakteristischen Zeiten lieferte Werte für die Persistenzlänge, die im Rahmen der mit alternativen Techniken bestimmten Ergebnisse liegen. Der äußerst langsame, logarithmische Zerfallsprozess wurde in dieser Arbeit erstmals beschrieben. Er konnte kollektiven Netzwerkmoden auf der Längenskala der Abstände zwischen benachbarten Polymeren zugeordnet werden. Aus den Amplituden dieser kollektiven Moden konnten die dynamischen Lokalisierungslängen des Netzwerks berechnet werden. Diese sind überraschenderweise wesentlich kleiner als die mittleren Abstände zwischen den Filamenten. Die hier gefundenen kollektiven Moden können nur im Rahmen einer Theorie beschrieben werden, die den Übergang von Einzelfilamenteigenschaften zu kollektiven Netzwerkeigenschaften korrekt beschreibt. Da genau dieser Übergang ein zentrales Problem der Polymerphysik ist, wird intensiv an solchen Theorien geforscht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Messdaten erlauben es diese Theorien kritisch zu überprüfen und sind daher eine wichtige Leitschnur für die weitere Entwicklung.It is possible with, Actin in its biopolymer form to polymerise very long filaments (of up to 100 mm in length). The polymer system models in Actin solution form allows for very easy and precise measurement. The effect of a finite tortion stiffness could be studied because the persistence length is in the range of about 20 mm. In this thesis solutions of actin networks were studied with the aid of static, and dynamic light scattering techniques. These techniques allow measurements on homogenious and isotropic networks without markers. The actin concentration (varied between 7 and 24 mM) corresponds to mean distances of the filaments between 0.27 mm and 0.5 mm. The scattered vector varied between 12 mm-1 and 30 mm-1. At these length scales the important and for theoretical predictions fundamental crossover between single filament dynamics and motion of the network could be measured. It is the first time that a correlation between neighbour filaments was found to be analogous to the density correlation function of a solution. The structure of the network was studied with static light scattering technique. Dynamic light scattering was used to measure the density fluctuations of networks within a timescale between 100 msec and 30 minutes. In these experiments a twofold decay of the intensity correlation function was found. With short timescales a stretched exponential decay was measured, with longer timescales a logarithmic decay of the intensity correlation function was found. The higher the concentration of the actin, and the smaller the scattering angle: the higher the relative part of the logarithmic decay, in the intensity correlation function. This extremely slow logarithmic decay is described in this work for the first time. It is related to collective modes, of the motion, of the network. The resulting exponent of 0.72 is typical an exponential value of single filament theory. The theoretical value is predicted to 0.75
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
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