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Biosuperfici per lo studio del fattore di forma e dell'orientamento spaziale di biomolecole tramite Microscopia a Forza Atomica
No full textMolte funzioni cruciali per la vita cellulare sono strettamente connesse alla struttura delle biomolecole coinvolte. Ciò spiega l’accresciuto interesse in questi ultimi anni per la comprensione della correlazione tra struttura e funzione di una biomolecola. In queste indagini sono coinvolte differenti metodiche analitiche, che spaziano dalla cristallografia a raggi X all’NMR, alle tecniche di microscopia elettronica SEM e TEM. In molti casi, però, per comprendere alcune proprietà ed alcuni aspetti della funzione di una biomolecola può essere sufficiente conoscerne il fattore di forma e le dimensioni, e non necessariamente la sua struttura atomica dettagliata. La Microscopia a Forza Atomica (AFM) consente di ottenere immagini tridimensionali di biomolecole in ambiente fisiologico, coniugando rapidità d’indagine a semplicità di preparazione del campione. Tale metodica consente di ottenere “bioimmagini”, cioè visualizzazioni dirette della forma, delle dimensioni, della disposizione e dell’orientamento spaziale di molecole d’interesse biologico. Questa prerogativa non è esclusiva dell’AFM, ma questa è l’unica microscopia che permette di operare senza modifiche irreversibili del campione, in ambiente fisiologico, in tempi brevi e con estrema sensibilità. Buone immagini AFM possono essere ottenute solo se la biomolecola è opportunamente ancorata ad una superficie piana. L’immobilizzazione di biomolecole su superfici è un’area di ricerca molto attiva: le strategie perseguite prevedono in genere l’introduzione di gruppi reattivi sulla superficie stessa in grado di formare legami covalenti con la biomolecola. Infatti, l’adsorbimento fisico delle biomolecole alla superficie, pur se facilmente realizzabile, non è un processo controllabile e porta facilmente alla denaturazione delle biomolecole stesse per interazione col supporto; ad esso quindi si preferisce un legame specifico biomolecola–superficie, che sia stabile nel tempo, che garantisca il mantenimento della conformazione molecolare e che sia controllabile modulando le condizioni di reazione. L’ottenimento di adeguate “biosuperfici”, cioè di supporti estremamente piatti e chimicamente suscettibili all’interazione con specifiche biomolecole, costituisce un problema biotecnologico che si configura come il prerequisito fondamentale per lo studio mediante AFM delle caratteristiche strutturali e morfologiche delle molecole biologiche stesse.
A tal fine è stato depositato un film sottile d’oro, mediante la tecnica di gold sputtering, su supporti di vetro silanizzato. Lo spessore dello strato metallico depositato in funzione del tempo di sputtering è stato verificato tramite AFM, mentre la stabilità dello strato d’oro nelle condizioni sperimentali normalmente impiegate per l’immobilizzazione di biomolecole è stata confermata tramite indagini con microscopia ottica. Su questi supporti sono stati quindi costruiti dei self assembling monolayers (SAMs) di tioli organici, contenenti gruppi S-H o S-S, su cui immobilizzare in modo controllato e specifico delle biomolecole. La versatilità di tali SAMs come biosuperfici è da ricondurre alla possibilità di creare monostrati autoassemblanti misti, cioè a due o più componenti, in cui almeno uno dei componenti contenga un gruppo funzionale utilizzabile per promuovere interazioni specifiche con biomolecole presenti in soluzione. Come componente caratterizzante della biosuperficie è stata utilizzata la biotina, una piccola molecola organica del peso pari a 244 Dalton che, inserita tramite legame covalente in una molecola biologicamente attiva, non ne altera l’attività biologica. Sono stati preparati SAMs misti di acido 3-mercapto-proprionico e di una biotina modificata contenente un gruppo S-S, a diversi rapporti di concentrazione relativa per ottenere una biosuperficie con un numero controllato di molecole di biotina, cioè di siti di ancoraggio specifici per l’immobilizzazione successiva della Streptavidina. Successivamente si è verificata la formazione del complesso biotina–streptavidina, complesso comunemente utilizzato in biochimica ed in molti ambiti immunodiagnostici per la sua elevata specificità e stabilità in diverse condizioni sperimentali. Utilizzando soluzioni a concentrazione variabile di streptavidina è stato dimostrato come il numero di molecole di proteina fissate alla biosuperficie dipenda direttamente dal numero di molecole di biotina inserite nel SAM misto.
Il supporto così ottenuto, costituito da superfici silanizzate e dorate ed attivate mediante l’impiego di SAMs a reattività “controllata”, può essere proficuamente impiegato per l’immobilizzazione di biomolecole che possono essere visualizzate tramite la Microscopia a Forza Atomica a livello di singola molecola
Gli ω-amminosilani nella preparazione di superfici piatte e chimicamente attive: caratterizzazione mediante AFM e fluorescenza
No full textL’applicazione della Microscopia a Forza Atomica per lo studio delle “biosuperfici”, intese come superfici inorganiche modificate con biomolecole variamente ancorate, sta aprendo la strada alla comprensione dei fenomeni d’interazione tra macromolecole. Una promettente applicazione sembra essere quella relativa all’impiego dell’AFM nella ricerca genica, per la visualizzazione dei cambiamenti e delle variazioni conformazionali degli acidi nucleici in funzione delle caratteristiche dell’ambiente e delle interazioni con le proteine. Per ottenere questi risultati è necessario disporre di supporti ai quali sia possibile legare stabilmente e specificamente le molecole biologiche d’interesse, privi di contaminazioni superficiali che potrebbero inficiare i risultati. Con entrambe le procedure presentate sono stati realizzati supporti solidi piatti, puliti e caratterizzati da un controllato e riproducibile numero di gruppi funzionali disponibili. Queste procedure sono state ottimizzate per ottenere allo stesso tempo la superficie con la minor rugosità e la più elevata densità superficiale di gruppi –NH2, valutando al contempo quale fosse il miglior amminosilano per la reazione considerata. I supporti così preparati costituiscono un buon biomateriale di partenza per la successiva immobilizzazione di molecole biologiche sia in forma di film sottili sia, mediante l’introduzione di gruppi specifici superficiali, come molecole isolat
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Kinetic and morphological characterization of Glucose Oxidase thin layers
No full textImmobilization of enzymes on solid surfaces has become a fundamental technique for the preparation of enzyme-based biosensors. One of the most used oxide-reductase in this field is the Glucose Oxidase enzyme (GOD). Thin layers of Glucose Oxidase have been covalently and non-covalently bound to functionalized glass cover slips. A new method for the determination of the number of immobilized GOD molecules, based on the amperometric determination of Flavin Adenine Dinucleotide (FAD), was developed.
Kinetic parameters (Km, kc, and kc/Km) were measured for the immobilized GOD and compared with the unbound enzyme. Atomic Force Microscopy (AFM) images were obtain in aqueous solution for the covalently and non-covalently bound enzyme, and revealed a homogeneous coverage of the glass support by the covalently bound GOD
Determination of Glucose Oxidase immobilised as monolayer onto a flat surface
No full textAn assay to estimate the amount of glucose oxidase immobilised as a monolayer onto a flat surface is reported. This method is based on the electrochemical detection of the flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor released by the immobilised enzyme in acid solutions. FAD concentration in the acid solution was measured by amperometry, using a flow injection analysis (FIA) system equipped with a wall-jet electrode, and with a sensitivity of (9.2+/-2.0)x10(-2) nA/nM. By this method, the amount of glucose oxidase molecules present in a monolayer deposited on a silanised glass slide was easily detected, in which the detection limit is more than one order of magnitude lower than the maximum loading of the surface with an ordered monolayer of glucose oxidase
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
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