1,721,188 research outputs found
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Caracterização biológica, bioquímica e molecular em isolados de Leishmania infantum obtidos de cães naturalmente infectados : uma busca racional de biomarcadores de virulência e patogenicidade.
No full textNo Brasil, a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é causada por Leishmania infantum e os cães tem sido considerados como os principais responsáveis pela dispersão da doença. A LVC pode se manifestar com diferentes formas clínicas, variando desde uma infecção de caráter assintomático até uma forma sintomática grave, a qual na maioria das vezes culmina com a morte dos animais. O presente estudo empregou ferramentas biotecnológicas para avaliar características biológicas, bioquímicas e genéticas em dez cepas de Leishmania spp. isoladas de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas (assintomática ou sintomática) da LVC, buscando identificar fenótipos de virulência e patogenicidade. Todos os isolados obtidos foram submetidos às seguintes avaliações: (i) comportamento em meio de cultivo (LIT); (ii) infectividade e patogenicidade mediante infecção experimental no modelo hamster (Mesocricetus auratus); (iii) análise bioquímica por meio de perfil de isoenzimas; (iv) identificação da espécie de Leishmania por PCR-RFLP; (v) RAPD-PCR para identificação de possíveis polimorfismos genéticos. Os resultados demonstram que os isolados de Leishmania obtidos de cães com ambas formas clínicas, apresentam fenótipos de crescimento diferenciados. Apesar da baixa taxa de infectividade obtida pela infecção experimental em hamster, foi possível selecionar dois isolados (I-3 e I-8), com diferentes potencias de infectividade quando comparados aos demais isolados e a cepa de referência L. infantum (MHOM/BR/74/PP75). As análises dos perfis enzimáticos (G6PD, IDH, GDH, MDH, ME e 6PGD), demonstraram que os isolados obtidos tanto de cães sintomáticos como assintomáticos apresentam padrões similares em relação ao número e migração das bandas eletroforética quando comparados com a cepa de referência de L. infantum. A PCR-RFLP demonstrou que nove isolados apresentaram perfil idêntico ao observado para cepa de referência de L. infantum, enquanto um isolado apresentou perfil semelhante ao da espécie L. amazonensis. Com o intuito de identificar características genéticas entre os isolados, que pudessem ser associadas com as formas clínicas da LVC foi empregada a técnica de PCR-RAPD. Os resultados obtidos permitiram a construção de um fenograma consenso gerado pelos iniciadores (M13-40F, QG1, L15995, K7, P53-1), demonstraram que maioria dos isolados apresentavam perfil genético semelhante ao da cepa de referência de L. infantum, sem diferenças significativas entre isolados obtidos de cães sintomáticos e assintomáticos. O conjunto de resultados obtidos no presente estudo vem contribuindo para um melhor entendimento das características biológicas, bioquímicas e genéticas de cepas de L. infantum oriundas de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas da LVC.In Brazil, Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is caused by Leishmania infantum parasites and infected dogs have been the ones responsible for the spread of the disease in large Brazilian cities. CVL manifests itself as a broad clinical spectrum ranging from asymptomatic infection to patent severe disease, which mostly culminates on death. The main goal of this work was the employment of biotechnological tools to evaluate biochemical and genetic profiles of ten Leishmania spp. strains, isolated from naturally-infected dogs presenting the asymptomatic and symptomatic clinical forms of the disease. Our major focus was the identification of phenotypes associated to virulence and pathogenicity. To accomplish this goal all isolates underwent the following assessments: (i) evaluation of parasite growth in culture medium (LIT); (ii) measurement of parasite infectivity and pathogenicity in the hamster model; (iii) determination of the iso-enzymatic profile; (iv) PCR-RFLP for species identification, and (v) RAPD-PCR for identification of possible genetic polymorphisms. Our results revealed that all isolates from both asymptomatic and symptomatic groups exhibited different in vitro growth curves. Despite the low rate of infectivity in the experimental hamster model of infection, we have selected two strains (I-3 and I-8) with differing potential for infection when compared to the reference L. infantum (MHOM/BR/74/PP75) and to other isolates. Analyses of the enzymatic systems (G6PD, IDH, GDH, MDH, ME and 6PGD) employed herein demonstrated that the isolates from symptomatic and asymptomatic dogs presented similar patterns in respect to the number of bands and electrophoretic profile when compared to the L. infantum reference strain. The PCR- RFLP technique revealed that nine out of ten isolates presented a RFLP profile identical to the L. infantum reference strain. For the remaining isolate, a RFLP profile similar to the L. amazonensis species was obtained. At last, RAPD-PCR analyses of the isolates enabled the construction of a consensus phenetic tree generated using five primers (M13-40F, QG1, L15995, K7, P53-1). In this experiment we demonstrated that most isolates displayed genetic profiles similar to the L. infantum reference strain, with no meaningful distinction between the isolates from symptomatic and asymptomatic dogs. The data obtained in this study have contributed to a better understanding of the biological, biochemical and genetic profiles of L. infantum strains isolated from naturally-infected dogs with different clinical forms of CVL
Avaliação de uma vacina terapêutica (LBMPL) no tratamento da leishmaniose visceral utilizando o cão naturalmente infectado com Leishmania infantum como modelo experimental.
No full textPrograma de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto.A leishmaniose visceral (LV) é uma das doenças mais negligenciadas no mundo, que afeta principalmente os países mais pobres. Epidemias urbanas de LV são observadas em várias cidades do Brasil e a doença tem sido verificada como infecção oportunista em pacientes com AIDS. Estima-se que a infecção HIV/L. infantum aumenta o risco em 100 a 2.320 vezes de se desenvolver uma LV grave. Atualmente, diversos são os relatos do surgimento de cepas resistentes do parasito aos fármacos convencionais. Sendo assim, o desenvolvimento de novas estratégias profiláticas/terapêuticas (imunofármacos) contra a doença se faz necessário e urgente. Neste contexto, muitos modelos animais experimentais já foram avaliados e o cão, se destaca como um dos melhores modelos experimentais para o estudo da LV humana (LVH) bem como seu emprego em ensaios pré-clínicos, pois apresenta características clínico-patológicas e uma história natural de doença extremamente semelhantes à LVH ativa e grave. Dessa forma, nosso estudo buscou avaliar a estratégia de tratamento empregando uma vacina terapêutica composta por antígenos totais de L. braziliensis associada ao adjuvante MPL (vacina LBMPL) para LVH empregando cães sintomáticos, naturalmente infectados por L. infantum. Assim, 16 cães infectados foram subdivididos em dois grupos experimentais: um grupo que recebeu como imunoterapia o adjuvante monofosforil lipídeo A apenas, sendo considerado grupo controle (MPL; n=6) e outro que recebeu como imunoterapia a vacina composta por antígenos de L. braziliensis associada ao adjuvante MPL (LBMPL n=10). Os animais foram submetidos a um esquema imunoterapêutico composto por 3 séries de tratamento, cada série de 10 doses com concentrações crescentes do antígeno vacinal (60μg – 300μg de antígeno protéico + 5μg - 25μg de MPL (dias 1-5) e / 300μg Ag + 25μg MPL (dias 6-10) 1ª série / 300μg Ag + 25μg MPL 2ª e 3ª séries) sob a via subcutânea com intervalo de 10 dias de descanso entre cada série. Os cães foram avaliados antes de serem tratados (T0) e após 15 (T15), 30 (T30) e 90 (T90) dias do tratamento sob os aspectos hemato-bioquímicos, imunológicos, clínicos e parasitológicos. Nossos principais resultados revelaram que a imunoterapia com a vacina LBMPL foi capaz de restabelecer e normalizar as principais alterações hematológicas (eritrócitos, hemoglobina, hematócrito e plaquetas) e bioquímicas (uréia, AST ou TGO, fosfatase alcalina, bilirrubina, e proteína total) decorrentes da LVC e presentes antes do tratamento. Além disso, cães imunotratados com a vacina LBMPL responderam na avaliação ex vivo, com aumento de linfócitos T CD3+ e suas subpopulações (T CD4+ e T CD8+), redução de linfócitos B CD21+, redução na razão T CD4+/T CD8+, aumento da razão LT/LB, aumento de células NK CD5-CD16+ e aumento de monócitos CD14+ circulantes como principais biomarcadores celulares de sucesso terapêutico no sangue periférico. Já no contexto das avaliações in vitro, animais submetidos à vacinoterapia com LBMPL desenvolveram forte memória imunológica antígeno-específica, capaz de induzir elevada atividade linfoproliferativa frente ao estímulo com antígeno solúvel de L. infantum (ASLi) acompanhado por reconhecimento preferencial de células T CD4+ e T CD8+-ASLi específicas. Interessantemente, foi também observado aumento tanto de linfócitos T CD4+IFN-+ e T CD8+IFN-+ bem como redução de linfócitos T CD4+ IL-4+ e T CD8+ IL-4+ após estimulação com ASLi e aumento na produção/secreção de citocinas pró-inflamatórias como TNF- e redução na produção de citocinas imunomodulatórias como IL-10 por células mononucleares do sangue periférico (CMSP); citocina esta, responsável pela imunopatogênese da LV grave. Estes achados caracterizam perfil de resistência a infecção por Leishmania e resposta positiva ao tratamento nos cães imunotratados com a vacina terapêutica LBMPL. De forma surpreendente, em relação aos sinais clínicos sugestivos de LVC, os animais imunotratados com LBMPL apresentaram redução drástica na intensidade e na quantidade de sinais/sintomas clínicos da LV, aumento da massa corporal além de redução da esplenomegalia avaliada clinicamente e por ultrassom, fatores estes intimamente associados ao sucesso terapêutico na doença humana. Somado-se a isso, a vacina LBMPL promoveu ainda uma redução da carga parasitária, avaliada aqui pela PCR em Tempo Real (qPCR), na medula óssea, baço e pele nos cães infectados, sendo até mesmo possível observar em alguns animais ausência de parasitismo nestes órgãos. Os resultados obtidos no presente estudo, confirmam e reafirmam a indicação do cão naturalmente infectado com L. infantum, como modelo experimental pré-clínico de altíssimo valor na leishmaniose visceral. Além disto, nossos resultados permitem também sugerir o uso da imunoterapia com a vacina terapêutica LBMPL como uma potencial proposta de tratamento na leishmaniose visceral canina e/ou humana.Visceral leishmaniasis (VL) is one of the most neglected diseases in the world, affecting mostly the poorest countries. Urban epidemics of VL are observed in several cities in Brazil and the disease has been seen as an opportunistic infection in HIV patients. It is estimated that, HIV/L. infantum co-infection increases the risk by 100-2320 times to develop a severe VL. Currently, several studies have addressed the rise of resistant strains of the parasite to conventional drugs. Thus the development of new prophylactic/therapeutic (immunological agents) strategies against the disease is necessary and urgent. In this context, many animal models have been evaluated, and the dog stands as one of the best experimental models for the study of human VL (HVL) as well as in preclinical trials, since dogs present clinical and pathological characteristics and natural history of the disease extremely similar to the active and severe HVL. Thus, our study aimed to evaluate the treatment strategy employing a therapeutic vaccine composed by antigens of L. braziliensis associated with MPL adjuvant (LBMPL vaccine) for HVL using symptomatic dogs naturally infected by L. infantum. Thus, 16 infected dogs were divided into two experimental groups: a group that received immunotherapy only with monophosphoryl lipid A adjuvant, considered the control group (MPL, n=6) and another group that received immunotherapy using the vaccine composed by antigens of L. braziliensis associated with MPL as adjuvant (LBMPL, n=10). The animals were subjected to an immunotherapeutic scheme consisting of 3 treatment series, each series composed of 10 doses with increasing concentrations of the vaccine antigen (60μg - 300μg antigen protein + 5μg - 25μg of MPL (day 1-5) and 300μg of LB antigen + 25μg of MPL (day 6-10) 1st series / 300μg antigen protein + 25μg of MPL 2nd and 3rd series) by subcutaneous route and a 10-day interval between each series. The dogs were evaluated before treatment (T0) and 15 (T15), 30 (T30) and 90 (T90) days after treatment under the hematological, biochemical, immunological, clinical and parasitological aspects. Our major results showed that immunotherapy with LBMPL vaccine was able to restore and normalize main hematological (erythrocytes, hemoglobin, hematocrit and platelets) and biochemical (urea, AST or SGOT, alkaline phosphatase , bilirubin , and total protein ) parameters resulting from CVL present before treatment. In addition, in ex vivo analysis, immunotreated dogs with LBMPL vaccine responded with increased CD3+ T lymphocytes and their subpopulations (T CD4+ and T CD8+), reduction of CD21+ B lymphocytes and in the T CD4+/T CD8+ ratio, increased TL/BL ratio, NK cells (CD5-CD16+) and CD14+ monocytes as the main cellular biomarkers of therapeutic success in peripheral blood. In the in vitro context, animals subjected to LBMPL vaccinetherapy developed a strong antigen-specific immunologic memory, able to induce a high lymphoproliferative activity against L. infantum soluble antigen (ASLi) followed by a preferential recognition of ASLi-specific T CD4+ and T CD8+. Interestingly, an increase in both T CD4+IFN-+ and T CD8+IFN-+ lymphocytes was also observed as well as reduction of T CD4+IL-4+ and T CD8+IL-4+ lymphocytes after ASLi stimulation and increased production/secretion of pro inflammatory cytokines such as TNF- and reduced production of immunomodulatory cytokines such as IL-10 by peripheral blood mononuclear cells (PBMC). This cytokine (IL-10) is responsible for the severe VL immunopathogenesis. These findings characterize a resistante profile to Leishmania infection and positive response in dogs immunotreated with LBMPL therapeutic vaccine. Interestingly, concerning clinical signs of CVL, animals submitted to LBMPL vaccinetherapy showed drastic reduction in the intensity and number of clinical signs/symptoms of VL, increased body mass as well as reduction of splenomegaly assessed clinically and by ultrasound, factors closely associated with success in the treatment of human disease. In addition, the LBMPL vaccine also promoted a reduction in parasite burden, assessed by Real Time PCR (qPCR) in bone marrow, spleen and skin of infected dogs, being even possible to observe some animals with no parasitism in these organs. The results obtained in this study confirm and reaffirm the statement that naturally infected dogs with L. infantum are the most important experimental preclinical model in visceral leishmaniasis. Furthermore, our results also allow recommending the use of immunotherapy with the LBMPL therapeutic vaccine proposed as a potential treatment for visceral leishmaniasis in both the canine and human disease
Estudo das relações entre imunidade humoral e carga parasitária em cães naturalmente infectados por Leishmania (leishmania) infantum chagasi.
No full textNo presente estudo foi avaliado um grupo de 45 cães composto de animais não infectados e naturalmente infectados por L. infantum chagasi (identificação através da PCR-RFLP). Após avaliação clínica os animais foram divididos em três grupos: Cães controle (CC), cães assintomáticos (CA) e cães sintomáticos (CS). Foi avaliada a carga parasitária nas amostras de pele e baço destes animais através da técnica de quantificação “Leishman Donovan Units” (LDU). De acordo com densidade parasitária separamos os animais nos seguintes grupos: baixo parasitismo (BP), médio parasitismo (MP) e alto parasitismo (AP). Neste contexto estudamos o índice de positividade da PCR em diferentes amostras clínicas, o perfil da resposta humoral (IgG e suas subclasses IgG1 e IgG2) e a avidez de IgGtotal com relação à forma clínica e ao parasitismo apresentado pelo cão. A análise dos resultados da PCR mostrou que não houve diferença estatística na positividade da reação entre os grupos com diferentes formas clínicas. Os animais foram positivos em pelo menos dois tecidos avaliados e as amostras clínicas com melhor desempenho seguiram a seguinte ordem: baço, linfonodo, pele, medula óssea, fígado e sangue. Com relação ao parasitismo tecidual foi observada diferença estatística significante na carga parasitária das amostras de pele ao compararmos os grupos CA e CS (p=0,0011). Em ambos tecidos onde foi avaliada a carga parasitária observou-se que no grupo CA houve um maior número de animais com baixo parasitismo, já no grupo CS a maioria dos animais apresentava alto parasitismo. A avaliação do perfil de Ig mostrou que os níveis séricos de IgG1 apresentavam-se mais elevados nos animais assintomáticos, sugerindo uma possível associação com mecanismos imunoprotetores da infecção, por outro lado os níveis séricos de IgG2 parecem estar associados com a presença de sintomas na LVC. Correlacionando o perfil de Ig com a carga parasitária, foi constatado que à medida que aumentava a intensidade parasitária (baço e pele) os valores de IgG e IgG2 também subiam. Observamos também uma correlação negativa entre os valores de IgG1 e a densidade parasitária no baço. O índice de avidez (IA) de IgGtotal nos animais sintomáticos foi mais alto quando comparado ao IA dos animais assintomáticos. Além disso, animais mais parasitados tanto no baço quanto na pele possuem maior IA que os animais com baixo parasitismo. Com base nestes achados sugerimos que a LVC se inicia a partir de uma forma clínica assintomática, com baixo parasitismo, alta produção de IgG1 e baixa afinidade das moléculas de IgGtotal evoluindo para uma forma clínica sintomática, com maior densidade parasitária, níveis de IgG2 mais elevados e alta afinidade de IgGtotal. Além disso, confirmamos a eficácia da PCR como ferramenta no diagnóstico da LVC ressaltando sua importância do ponto de vista epidemiológico devido à sua capacidade na detecção de animais assintomáticos.In the present study, a group of 45 dogs composed of uninfected and naturally infected animals with L. infantum chagasi (identification by means of PCR-RFLP) was evaluated. Following clinical evaluation, the animals were divided into three groups: Uninfected dogs (UD), asymptomatic dogs (AD), and symptomatic dogs (SD). The parasitary burden was assessed taken into account samples of the skin and spleen of those animals, by using the quantification technique “Leishman Donovan Units” (LDU). According to the parasitary burden, the animals were separated into the following groups: low parasitism (LP), median parasitism (MP), and high parasitism (HP). In this context, we studied the positivity index of PCR using different clinical samples, the profile of the humoral response (IgG and its sub-classes IgG1 and IgG2), as well as the IgGtotal avidity in relation to the clinical form and the parasitism presented by the dog. Analysis of the results obtained by means of PCR showed that there was no significant statistical difference related to the reaction positivity among the groups with different clinical forms. The animals were found to be positive in at least two of the evaluated tissues, and the clinical samples showing the best results were as follows: spleen, lymph node, skin, bone marrow, liver and blood, respectively. In relation to the tecidual parasitism, a significant statistical difference could be observed in the parasitary burden of the skin samples, when the groups AD and SD were compared (p = 0.0011). In both tissues used to evaluate the parasitary burden, it could be observed that in the group AD there was a higher number of animals with low parasitism, whereas in the group SD the great majority of the animals presented high parasitism. Evaluation of the Ig profile showed that the seric levels of IgG1 were higher in the asymptomatic animals, suggesting a possible association with immunoprotector mechanisms of the infection. On the other hand, the seric levels of IgG2 seem to be associated with the presence of symptoms in the Canine Visceral Leishmaniasis (CVL). Correlating the Ig profile with the parasitary burden, it was observed that the more intense the parasitary burden was (spleen and skin), higher were the IgG and IgG2 values too. We also observed a negative correlation between the IgG1 values and the parasitary density in the spleen as well. The avidity index (AI) of IgGtotal in the symptomatic animals was higher, when compared with the AI of the asymptomatic animals. Moreover, the animals with a higher parasitary burden either in the spleen or skin showed a higher avidity index than the animals with lower parasitism. Based on these findings, we suggest that CVL commences with an asymptomatic clinical form with low parasitism, high production of IgG1 and low affinity of the IgGtotal molecules, evolving to a symptomatic clinical form, with higher parasitism intensity, higher IgG2 levels, and high affinity of IgGtotal. Furthermore, we confirmed the efficacy of PCR as a tool for the CVL diagnosis, emphasizing its importance under the epidemiological viewpoint, due to its performance concerning the detection of asymptomatic animals
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Avaliação da imunogenicidade de dois novos Imunobiológicos candidatos a vacina contra Leishmaniose visceral canina.
No full textConsiderando a importância de estratégias imunoprofiláticas para o controle da leishmaniose visceral, a inexistência de drogas capazes de curar cães infectados e o aumento de casos de resistência aos antimoniais pentavalentes, o presente trabalho buscou avaliar a imunogenicidade de dois novos imunobiológicos candidatos a vacina contra leishmaniose visceral canina (LVC). Observa-se uma lacuna em estudos que buscam avaliar a imunogenicidade pós-vacinal de imunobiológicos anti-LVC. Assim, o presente estudo propôs uma análise detalhada da imunogenicidade considerando diversos biomarcadores da resposta imune celular e humoral após as três doses das diferentes estratégias vacinais. Trinta e cinco cães sem raça definida foram subdivididos em sete grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle C (n = 10) que recebeu 1 mL de salina estéril a 0,9%; (ii) grupo LB (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de Leishmania braziliensis em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iii) grupo Sap (n = 5) que recebeu 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (iv) grupo LBSap (n = 5) que recebeu 600 μg de proteína de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (v) grupo Sal (n = 5) que recebeu extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis (SGE) equivalente ao conteúdo de 5 ácinos da glândula salivar em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vi) grupo LBSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%; (vii) grupo LBSapSal (n = 5) que recebeu 600 μg de promastigotas de L. braziliensis associado a 1 mg de saponina e ao SGE em 1 mL de salina estéril a 0,9%. Cada animal recebeu três aplicações subcutâneas no flanco esquerdo em intervalos de quatro semanas. Os resultados indicam que a saponina quando presente (Sap, LBSap, LBSapSal) induziu em alguns cães a formação de edema ou de pequeno nódulo local, sem apresentar lesões ulceradas ou outras alterações adversas. A avaliação da inocuidade e toxicidade das diferentes vacinas não revelou contra-indicações para utilização. A avaliação da resposta humoral revelou que os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-Leishmania, sugerindo um perfil de resposta imune misto Th1/Th2. De forma semelhante, no grupo LBSapSal foi observado aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2 anti-SGE, que tem sido previamente relacionado ao estabelecimento de uma resposta imune protetora anti- Leishmania. Além disto, experimentos utilizando Western blot para avaliar a reatividade de anticorpos caninos anti-proteínas do SGE evidenciaram o predomínio de proteínas com peso molecular de 35, 45 e 75 KDa, particularmente no grupo LBSapSal, sendo relacionado a um padrão de resistência contra infecção por Leishmania. A avaliação da resposta celular contou com o estudo imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e revelou aumento do número de linfócitos B CD21+, linfócitos T CD5+ e das subpopulações T (CD4+ e T CD8+), indicando o estabelecimento de imunidade protetora contra infecção por Leishmania como previamente relatado na LVC. Além disto, foi observada pela análise in vitro redução do índice de proliferação utilizando VSA (vaccine soluble antigen) ou SLcA (soluble Leishmania chagasi antigen) nos grupos LB e Sal, enquanto os grupos LBSap e LBSapSal apresentaram aumento da atividade linfoproliferativa na presença de ambos os estímulos. De forma interessante, foi demonstrado no grupo Sal correlação negativa entre a atividade linfoproliferativa e linfócitos T CD4+ ou monócitos CD14+. Estes resultados permitem especular que a imunização realizada no grupo Sal poderia inibir a atividade de monócitos CD14+ em ativar linfócitos T CD4+ e assim reduzir a atividade linfoproliferativa. Por outro lado, PBMC cultivados in vitro com SLcA do grupo LBSap e com VSA ou SLcA no grupo LBSapSal apresentaram aumento da atividade XI linfoproliferativa acompanhada pela indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos. Estes resultados sustentam a hipótese de que a vacinação com LBSap e LBSapSal estimularia o desenvolvimento de mecanismos imunoprotetores relacionados ao controle do parasitismo por Leishmania considerando a indução de linfócitos T CD8+ antígeno-específicos para proteínas relacionadas ao agente etiológico da LVC. A avaliação de potenciais células apresentadoras de antígenos (APC) revelou aumento do número de monócitos CD14+ circulantes nos grupos LBSap e LBSapSal. Além disto, altas contagens de APC foram associadas ao aumento da expressão de linfócitos MHC-I no grupo LBSap e de linfócitos CD80 e MHC-I no grupo LBSapSal, sugerindo que esta associação poderia representar a interação entre as respostas imunes inata e adaptativa, refletindo no aumento do perfil de ativação durante as imunizações. Os resultados obtidos pelas análises dos níveis de óxido nítrico (NO) pela avaliação dos níveis de nitrito no sobrenadante de cultura estimuladas com SLcA no grupo LBSap e no soro do grupo LBSapSal confirmam a hipótese de que estas vacinas induzem um perfil associado a resistência contra a infecção por Leishmania. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que o potencial imunoprotetor induzido pelas vacinas LBSap e LBSapSal são compatíveis com o controle do agente etiológico da LVC.Considering the importance of immunoprophylactic strategies for the control of visceral leishmaniasis, and the lack of studies concerning the cellular and humoral events that occur during vaccination in dogs, we have attempted to evaluate the immune response of a promising new vaccines candidate against canine visceral leishmaniasis (CVL). Thirty five mongrel dogs were treated within seven experimental groups as follow: (i) control group C (n = 10) received 1 ml of sterile 0.9% saline; (ii) LB group (n = 5) received 600 μg of Leishmania braziliensis promastigote protein in 1 ml sterile 0.9% saline; (iii) Sap group (n = 5) received 1 mg of saponin in 1 ml sterile 0.9% saline; (iv) LBSap group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein and 1 mg of saponin in 1 ml sterile 0.9% saline; (v) Sal group (n = 5) received sand fly gland extract (SGE) prepared from 5 acini of salivary glands of Lutzomyia longipalpis in 1 mL sterile 0.9% saline; (vi) LBSal group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein plus SGE in 1 mL sterile 0.9% saline; and (vii) the LBSapSal group (n = 5) received 600 μg of L. braziliensis promastigote protein plus 1 mg of saponin together with SGE in 1 mL sterile 0.9% saline. Each animal received three subcutaneous injections in the right flank at intervals of 4 weeks. The results obtained indicate that some dogs exhibit local swelling or mild local induration reactions, but no ulcerated lesions or other adverse reactions, after receiving saponin as an adjuvant (Sap, LBSap or LBSapSal groups). The overall tolerance of the candidate vaccines in dogs appeared to be adequate. The evaluation of immunogenicity revealed that animals treated with LBSap and LBSapSal presented higher (P < 0.05) amounts of anti- Leishmania total IgG that were associated with increased (P < 0.05) levels of IgG1 and IgG2, suggesting a mixed Th1/Th2 immune response. Likewise, LBSapSal elicited the production of elevated levels of anti-SGE total IgG, IgG1 and IgG2, that was previously associated in establishing an anti-immune L. chagasi response in human. Additionally, anti-SGE Western blot experiments showed predominance in the recognition of seric proteins with molecular weights of 35, 45 and 71 kDa, particularly following LBSapSal vaccination, and were related to the resistance pattern against Leishmania infection. The immunophenotypic evaluation in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) reveal in the LBSap and LBSapSal increased (P < 0.05) counts of circulating CD21+ B-cells, CD5+ T-cells and CD4+ and CD8+ T-cell subset, suggesting protective immunity against Leishmania infection as has been suggested previously for CVL. Whilst lower stimulation index by either VSA (vaccine soluble antigen) or SLcA (soluble Leishmania chagasi antigen) were recorded for the LB and Sal groups, higher cell reactivities in the presence of both stumuli were related to LBSap and LBSapSal groups. Interestingly, a negative association was demonstrated between cell reactivity and CD4+ T-lymphocytes or CD14+ monocytes following in vitro stimulation in the Sal group. These data support the hypothesis that Sal treatment inhibits CD14+ monocytes in the promotion of CD4+ T-lymphocyte activation and the induction of cell proliferation. In contrast, when in vitro cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated with SLcA in the LBSap treatment and VSA or SLcA in the LBSapSal group, increased lymphoproliferation activity was accompanied by a higher frequency of antigen-specific CD8+ T-cells. These results support the hypothesis that induction of CD8+ T-cells may play a protective role in the mechanism of control of parasitism by Leishmania after LBSap and LBSapSal treatment associated with the antigen-specific immune response to antigens from the etiological agent of CVL. The evaluation of potential antigen presenting cells (APC) revealed increased numbers of circulating CD14+ monocytes in the LBSap and LBSapSal groups. Furthermore, the largest APC counts were associated XIII with the highest expression of MHC-I in lymphocytes in the LBSap and CD80 and MHC-I in lymphocytes in the LBSapSal, suggesting that this association could represent interaction between the innate and adaptive immune responses, reflecting an improvement in activation status during immunization. The results obtained from the analysis of nitric oxide (NO) levels (determined as nitrite) in culture supernatants stimulated by SLcA in the LBSap and in the serum of the LBSapSal confirmed the hypothesis that these vaccines induce a potential resistance profile against Leishmania infection. Our data suggested that the potential resistance profile elicited by LBSap and LBSapSal were compatible with effective control of the etiological agent of CVL
Perfil cinético de classes e subclasses de imunoglobulinas em cães infectados com formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi submetidos ou não à imunossupressão.
No full textNo presente trabalho o perfil cinético das classes de imunoglobulinas anti-T. cruzi IgG, IgM, IgA e IgE e subclasses IgG1 e IgG2 foi avaliado em cães infectados com as formas tripomastigotas metacíclicas ou sangüíneas da cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi semanalmente até o 35º dia após a infecção. Foram utilizados 24 cães sem raça definida imunossuprimidos ou não com azatioprina. Estes cães foram subdivididos em seis grupos de quatro animais: controle (C), infectado com formas tripomastigotas sangüíneas (TS), infectado com formas tripomastigotas metacíclicas (TM), controle imunossuprimido (CIMS), imunossuprimido infectados com formas tripomastigotas sangüíneas (TSIMS) e imunossuprimido infectados com formas tripomastigotas metacíclicas (TMIMS). Foi avaliada a cinética dos níveis de imunoglobulinas nos dias zero, sete, 14, 21, 28 e 35 e suas correlações com a curva de parasitemia e os percentuais de células mononucleares do sangue periférico (Thy-1 + CD4 + , CD8 + , CD21 + e CD14 + ). Os resultados mostram que a forma infectante interfere na cinética do perfil de resposta humoral em cães imunocompetentes, sendo que animais infectados com as formas TS apresentam maiores níveis de imunoglobulinas em relação aos animais infectados com as formas TM. Cães infectados com as formas TS, tiveram aumento nos níveis de IgG e IgM, manutenção dos níveis basais de IgG1, IgG2 e IgA ao longo do tempo e aumento de IgE seguido de decréscimo. Por outro lado os cães infectados com as formas TM apresentaram aumento nos níveis de IgG, IgG2, IgM e IgA e manutenção dos níveis basais de IgG1 e IgE. A imunossupressão com azatioprina interfere no perfil de resposta humoral reduzindo os níveis de IgG, IgG1, IgG2, IgA e IgE em praticamente todos os animais. Entretanto, IgA e IgE o grupo TMIMS foi significativamente maior que no grupo TM. Por outro lado, os níveis de IgM foram ascendentes a partir do 21 o dia após a infecção. Durante a fase aguda da infecção não foi encontrada correlação entre os perfis de classes e subclasses de imunoglobulinas com a parasitemia. Entretanto, a análise de correlação entre os perfis cinéticos de imunoglobulinas e os fenótipos celulares permitiu detectar inúmeras correlações, destacando-se as seguintes: no grupo TS correlações negativas de IgG e IgM com linfócitos T CD4 + e positivas com linfócitos T CD8 + , enquanto em TM destacam-se as correlações positivas de IgG com linfócitos T CD8 + e de IgG1 com linfócitos B CD21 + . Nos animais imunossuprimidos de ambos os grupos destacam-se as correlações negativas de IgG e IgM com linfócitos B CD21 + , enquanto as correlações positivas foram de IgG e IgM com linfócitos T CD8 + no grupo infectado com TS e com linfócitos T CD4 + no grupo infectado com TM. Assim, estes distintos perfis permitem hipotetizar que a infecção pelas formas tripomastigotas metacíclicas é capaz de induzir uma atividade policlonal de linfócitos B mais diversificada que pode ser responsável pelo maior período pré-patente neste grupo sugerindo um equilíbrio na relação parasito/hospedeiro. Além disso, o comprometimento da resposta celular nos cães imunossuprimidos interfere na interação célula T – B prejudicando a síntese de anticorpos em ambos os grupos. Finalmente, a mortalidade de 50% observada apenas no grupo imunossuprimido infectado com as formas tripomastigotas metacíclicas pode ser devido ao somatório destas alterações, mais pronunciadas neste grupo.In the present work a detailed follow-up investigation of the profile of anti- T. cruzi immunoglobulins (IgG, IgG1, IgG2, IgM, IgA and IgE), was evaluated in dogs infected with metacyclic (MT) and blood (BT) trypomastigotes of Trypanosoma cruzi strain Berenice-78, typifying vectorial and transfusional transmission of human Chagas disease, during 35 days of the acute phase of the infection, submitted or not to immunossupresion (Azatioprine). The animals (24) were subdivided in six experimental groups with four animals in each one: uninfected control, infected with blood trypomastigotes, infected with metacyclic trypomastigotes, uninfected immunossupressed, infected with blood trypomastigotes immunossupressed and infected with metacyclic trypomastigotes immunossupressed. The kinetics of immunoglobulin levels was evaluated in zero, seven, 14, 21, 28 and 35 days after infections and their correlations with the parasitemia curve and the percentile of peripheral blood mononuclear cells (Thy-1 + , CD4 + , CD8 + , CD21 + and CD14 + ) were performed. The results show that the infective forms interfere in the kinetics of the humoral response profile in immunocompetent dogs, and dogs infected with BT showed higher immunoglobulins levels in relation to MT group. Dogs infected with BT presented an increase of IgG and IgM levels, maintenance of IgG1, IgG2 and IgA levels along the time and an increase of IgE followed by a decrease. On the other hand, dogs infected with forms MT presented an increase of IgG, IgG2, IgM and IgA levels and maintenance of IgG1 and IgE levels. Independent of the infective forms, the profile of humoral response presented reduced levels of IgG, IgG1, IgG2, IgA and IgE levels in practically all animals immunossupressed. However, in dogs immunossupressed infected with TM presented na increase IgA and IgE in relation to immunocompetent. During the acute phase of the infection it was not found a correlation between the profiles of immunoglobulins and parasitemia. However, the correlation analysis between kinetic profiles of immunoglobulin and cellular phenotypes allowed to detect countless correlations, drawing special attention to the following ones: i) in the BT group, negative correlations of IgG and IgM with T CD4 + lymphocytes and positive with T CD8 + lymphocytes were observed, ii) in MT the positive correlations of IgG with T CD8 + lymphocytes and IgG1 with B CD21 + lymphocytes were observed. Dogs immunossupressed of both groups presented negative correlations of IgG and IgM with B CD21 + lymphocytes; positive correlations of IgG and IgM with T CD8 + lymphocytes were observed in the group infected with TS and with T CD4 + lymphocytes in the group infected with MT. In conclusion, these different profiles raise the hypothesis that the infection using metacyclic trypomastigotes forms of T. cruzi is capable to induce a more diversified polyclonal activated B cells that can be responsible for the largest period pre-patent in this group, suggesting a balance in the relationship parasite/host. Besides, the failure of the cellular response in immunossupressed dogs interferes with the interaction T - B cells, thus damaging the synthesis of antibodies in both groups. At last, the 50% of mortality observed only in the immunossupressed group infected with metacyclic trypomastigotes forms can be due to the sum of these alterations, more pronounced in this group
Imunogenicidade e eficácia da vacina LBSap em cães após desafio intradérmico com Leishmania chagasi e extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis.
No full textMedidas de controle na infecção em cães por L. chagasi/L. infantum são fundamentais para interromper o avanço atual da leishmaniose visceral humana. Recentemente têm sido desenvolvidos inúmeros candidatos a vacinas contra leishmaniose visceral canina (LVC), sendo que, a compreensão dos mecanismos imunes envolvidos na imunogenicidade pós vacinação e pós desafio são cruciais para definir um padrão de resposta associado à proteção contra infecção por Leishmania. Assim, neste trabalho foi investigada a imunogenicidade e o efeito protetor da vacina LBSap em cães após o desafio intradérmico com L. chagasi. Vinte cães sem raça definida foram subdivididos em quatro grupos experimentais: i) controle (n = 5) receberam 1 mL de solução salina estéril 0,9%, ii) Sap (n = 5) receberam 1 mg de saponina em 1 mL de solução salina estéril 0,9%; iii) LB (n = 5) receberam 600 g de proteína de L. braziliensis em 1mL de solução salina estéril 0,9%; iv) LBSap (n = 5) receberam 600 g de proteína de L. braziliensis associado a 1mg de saponina em 1mL de solução salina estéril 0,9%. O protocolo vacinal constou de três imunizações pela via subcutânea em intervalos de 4 semanas. Posteriormente, os cães foram infectados por via intradérmica com 1 × 107 promastigotas de Leishmania (L.) chagasi em fase estacionária de crescimento associado a extrato de glândula salivar de Lutzomyia longipalpis e acompanhados por um período de 435 dias pós desafio (435Dpd). A análise da resposta imune humoral mostrou que antes e durante o acompanhamento longitudinal após o desafio, o grupo LBSap mostrou aumento dos níveis de IgG total, IgG1 e IgG2, sugerindo uma possível resposta imune mista (tipo I e II). A análise inicial da resposta imune celular revelou aumento da freqüência de linfócitos e monócitos no grupo LBSap. A Avaliação do perfil imunofenotípico de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) mostrou aumento no número absoluto de linfócitos T CD4+ e linfócitos B CD21+ , bem como contagens elevadas de monócitos CD14+ circulantes no grupo LBSap. Além disso, elevados níveis de linfócitos T CD5+ e LT CD8+ circulantes, foram diretamente correlacionados com a alta expressão de MHC-II em linfócitos no grupo LBSap. Estes resultados mostram que cães imunizados com a vacina LBSap apresentam variações em diversos biomarcadores imunológicos criando um padrão de memória imunológica favorável a uma vacina protetora através de uma maior capacidade na apresentação de antígenos e ativação celular. Além disso, o grupo de cães vacinados com LBSap apresentaram aumento da atividade linfoproliferativa in vitro após estímulo antigênico com VSA (antígeno solúvel vacinal) ou SLcA (antígeno solúvel de L. chagasi), bem como aumento na frequência de linfócitos T CD4+ . O perfil de ativação linfocitária in vitro foi marcado pelo aumento da expressão de linfócitos SLcA-MHC-II específicos ao lado de uma correlação positiva entre as células T CD4+ -SLcA/VSA e a expressão de MHC-II em linfócitos no grupo LBSap. A análise clínica de possíveis alterações sugestivas de LVC revelou que todos os animais permaneceram assintomáticos durante o período de acompanhamento (435Dpd). Finalmente, o estudo da investigação parasitológica realizada através da análise de amostras de medula óssea em cultura (parasitológico em NNN/LIT e análise de esfregaços por microscopia) além de abordagens moleculares (PCR), demonstrou somente PCR+ em um cão do grupo Sap no final do acompanhamento longitudinal (435Dpd). Assim, os resultados obtidos neste estudo indicam que a vacina LBSap induz um perfil de resposta imune compatível com proteção frente ao agente etiológico da LVC. Estes resultados indicam que a via intradérmica de infecção experimental apresenta um curso longo de duração para iniciar as manifestações clínicas e consequentemente a detecção do parasito, necessitando, portanto de um período maior de acompanhamento.The control of L. chagasi/L. infantum infection in dogs is essential to interrupt the current spread of human visceral leishmaniasis. Most recently, various potentials candidates to vaccines against canine visceral leishmaniasis (CVL) have been developed. To obtain a successful vaccine, the understanding of those immunogenicity mechanisms involved after vaccination and challenge is crucial to define the protective responses associated against Leishmania infection. Thus, in this work it was investigated the immunogenicity and protective effect of LBSap vaccination in dogs after challenge. Twenty mongrel dogs were categorized into four groups: i) control (n = 5) received 1 mL of sterile saline 0.9%; ii) Sap (n = 5) received 1 mg of saponin in 1 mL of sterile saline 0.9%; iii) LB (n = 5) received 600 g of L. braziliensis promastigote protein in 1ml sterile 0.9% saline; iv) LBSap (n = 5) received 600 g of L. braziliensis promastigote protein plus 1mg of saponin in 1ml sterile 0.9% saline. The immunization protocol consisted of three subcutaneous injections at intervals of 4 weeks. Afterwards, the dogs were intradermally infected with 1×107 late-log-phase promastigotes of Leishmania (L.) chagasi in the presence of sand fly saliva of Lutzomyia longipalpis and accompanied by a follow-up of 435 days post challenge (435dpc). Analysis of the humoral immune response showed that before and during the longitudinal follow-up after the challenge, the LBSap group showed increased levels of total IgG, IgG1 and IgG2, suggesting a possible mixed immune response (type I and II) after vaccination. Analysis of the cellular immune response revealed increased frequency of lymphocytes and monocytes in the LBSap group. The investigation based on the immunophenotypic profile of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) showed an augment in the absolute number of both CD4+ and CD21+ lymphocytes as well as higher counts of circulating CD14+ monocytes in the LBSap group. Moreover, high counts of circulating CD5+ T and CD8+ T lymphocytes were directly correlated with high expression of MHC-II on lymphocytes in the LBSap group. These findings show that LBSap immunized dogs exhibit changes in several immunological biomarkers that may create a pattern of immunological memory favorable to an effective vaccine through a higher ability in antigen presentation and cell activation. In addition, the LBSap group exhibited increased lymphoproliferative activity upon in vitro antigenic stimuli with VSA (vaccine soluble antigen) or SLcA (soluble L. chagasi antigen) as well as increaded frequency of CD4+ -lymphocytes. The in vitro profile of lymphocytic activation was marked by increased SLcA-specific MHC-II-expression alongside a positive correlation between CD4+ T-SLcA/VSA and MHC-II expression in the LBSap group. The clinical evaluation regarding suggestive signs of CVL showed that all animals remained asymptomatic during the all follow-up. Finally, the protection study performed by analysis of bone marrow samples by parasitological (culture in NNN/LIT medium and microscopical investigation) and molecular approaches (PCR) revealed positivity in PCR+ in only one dog of Sap group at the end of the follow-up (435dpc). Thus, this study indicated that the LBSap vaccine presents a profile consistent with immune protection against the etiological agent of CVL. These results showed that the intradermal route of experimental infection has a long course to start the clinical manifestations and therefore the detection of the parasite, and therefore requiring a longer period of follow-up
Desenvolvimento de um protótipo de kit para diagnóstico da leishmaniose visceral canina empregando a citometria de fluxo.
No full textA leishmaniose visceral encontra-se em expansão em alguns centros urbanos sendo importante destacar o papel dos cães como reservatório da doença. Assim, o controle da leishmaniose visceral canina (LVC) torna-se relevante, sendo as ações preconizadas pelo ministério da saúde baseadas num tripé de ações que sugerem o tratamento dos casos humanos, combate ao vetor e a eutanásia dos cães soropositivos. No entanto, devido à limitação na eficiência dos testes de diagnósticos atualmente empregados (RIFI e ELISA), a eliminação destes cães torna-se cada vez mais difícil e questionável. Neste contexto, o presente projeto propôs desenvolver e validar um protótipo de kit de diagnóstico pela pesquisa de anticorpos anti-Leishmania fixada através da técnica de citometria de fluxo. Para cumprir com o objetivo, foram utilizados soros de cães naturalmente infectados, portadores de diferentes formas clínicas, provenientes da área endêmica de Belo Horizonte, e soros de cães não infectados do Centro de Ciência Animal (CCA) da UFOP. Na primeira etapa deste projeto, houve a produção de promastigotas de L. infantum que, em seguida, foram preservadas em diferentes conservantes (Fenol 0.35%, Formol 0.5%, Thimerosal 0.01% e controle PBS) e em diferentes condições de temperatura (25°C, 4°C e -20°C). Na etapa seguinte, a etapa de validação dos antígenos, foram realizadas avaliações mensais das condições de rendimento reacional, aspectos morfológicos e microbiológicos das diferentes preparações antigênicas. Estas análises revelaram que a condição ideal de preservação dos antígenos de L. infantum a serem empregados no protótipo de kit é a fixação por formol 0,5% e acondicionamento em geladeira. A última etapa deste estudo avaliou os índices de desempenho do protótipo empregando o suporte antigênico conservado em formol 0,5% e estocado em geladeira. Os resultados observados revelaram um excelente potencial do protótipo no diagnóstico da LVC, com valores de sensibilidade igual a 95%, especificidade de 100%, valor preditivo positivo de 100%, valor preditivo negativo igual a 83,3% e a acurácia do teste foi estimada em 96%. Desta forma, a partir deste trabalho, torna-se disponível uma nova alternativa para o diagnóstico sorológico da LVC, que poderá ser empregada em campanhas de controle da doença no Brasil.Visceral leishmaniasis is expanding in some urban centers and it is important to highlight the role of dogs as reservoirs of the disease. Therefore, the control of Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) is important, and the Brazilian Ministry of Health established three pivotal actions that include the treatment of the human cases of the disease, vector control and the euthanasia of seropositive dogs. However, due to the limited efficiency of the diagnosis tests commonly used in serological trails (RIFI and ELISA), the elimination of these dogs becoming increasingly difficult and questionable. So, this project proposed the development and validation of a new diagnosis prototype kit employing the flow cytometry anti-fixed Leishmania infantum promastigotes as a novel serological device for laboratorial diagnosis of CVL. To achieve this goal, sera of naturally infected dogs that have different clinical forms from the endemic area of Belo Horizonte were used. In addition to these, sera of non-infected dogs maintained in the UFOP Animal Facilities were included as a control group. In the first step of this study, promastigotes of L. infantum were produced and kept in different preservative solutions (Phenol 0,35%, Formaldehyde 0,5%, Thimerosal 0,01% and PBS) and stored at different temperatures (25°C, 4°C e -20°C). Then, in the next stage to validate these antigens, evaluations of reaction yield, so as the morfologic and microbiologic features, were conduced monthly. These assessment showed that the best condition to preserve the antigenic support of the prototype was obtained when the promastigotes forms are put in Formaldehyde 0,5% at the refrigerator temperature (4°C). Lastly, the performance of the prototype was evaluated when those antigens were used. The results demonstrated an excellent potencial os this new method in the diagnosis of CVL. It is possible to observe great values of sensibility (95%), specificity (100%), positive and negative predictive values (100% and 83,3% respectively) so as de accuracy (96%). In conclusion, from this work, one alternative methodology is available for the CVL immunodiagnosis. The prototype may contribute
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