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Myelofibrosis model development : study of the mechanism and identification of therapeutic targets
No full textLa myélofibrose primaire (MFP), la thrombocytémie essentielle (TE) et la polyglobulie de Vaquez (PV) font partie des néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) BCR-ABL négatifs et sont caractérisés par une hyperprolifération des lignages myéloïdes incluant les mégacaryocytes (MKs). Cette hyperprolifération due, dans environ 50% des cas, à la mutation JAK2V617F, peut conduire à une hématopoïèse extramédullaire (HEM) et au développement d'une myélofibrose (MF), dont les acteurs majeurs sont les MKs. Même si l'utilisation d'inhibiteurs de JAK2 tels que le ruxolitinib ou le fédratinib diminue les symptômes de la MF, ils n'ont de réel effet ni sur la progression, ni sur la résorption de la MF. Le seul traitement efficace est la greffe allogénique de moelle osseuse (MO). Les objectifs de ce travail étaient d'analyser le rôle du MK dans le développement de la MF en contexte Jak2V617F, puis de proposer un modèle murin avec un développement rapide de la MF afin de tester des traitements préventifs. Récemment, il a été montré que dans les progéniteurs hématopoïétiques de souris Jak2V617F, l'expression et l'activité de CDK6 sont augmentées et que, dans le modèle murin, la perte de CDK6 entraîne une correction du phénotype NMP. Notre laboratoire a montré précédemment que l'inhibiteur de la voie CDK4/6, p19INK4D régule le cycle des MKs par l'arrêt des endomitoses et que son absence, chez les souris, induit une fibrose et une splénomégalie avec l'âge. Nous avons donc analysé la ploïdie et l'expression de p19 dans les MKs de souris Jak2V617F et de patients atteints de TE mutés pour JAK2V617F. Nous avons montré que, dans les deux cas, l'augmentation de la ploïdie des MKs est corrélée à une diminution de l'expression de p19. Nous nous sommes donc focalisés sur cet axe p19/CDK4/6 dans le développement de la MF.Pour étudier l'impact de la diminution de l'expression de p19 sur la MF, nous avons croisé deux modèles murins, les souris KO constitutif pour p19 avec les souris KI Jak2V617F conditionnel. Ces souris sont appelées « KOKI ». Nous avons montré que les souris uniquement Jak2V617F développent une fibrose relativement tardive due à l'amplification et l'activation des MKs, présentant un taux de ploïdie augmenté et par conséquent, une concentration médullaire de TGF-β1 sécrété, plus élevée. Ce phénotype est accentué par l'absence totale de p19 chez les souris KOKI qui développent rapidement une MF de grade 1, dès 3 semaines post-induction de Jak2V617F et de grade 3 à 8 semaines. Le modèle KOKI permet donc d'étudier le développement de la MF et de réaliser des tests précliniques. Du fait du développement de la fibrose, ces souris présentent également une hypocellularité de la MO et une splénomégalie, conséquence de l'HEM. Pour savoir si l'axe p19/CDK4/CDK6 peut représenter une nouvelle cible thérapeutique dans la MF, nous avons utilisé le palbociclib (PB), inhibiteur spécifique de CDK4/6. Le traitement des souris Jak2V617F et KOKI avec le PB corrige le syndrome myéloprolifératif, conduit à une diminution de la ploïdie et de la taille des MKs, ainsi que de la concentration de TGF-β1 actif ; il réduit en outre fortement le développement de l'HEM et, uniquement chez les KOKI, inhibe l'apparition de la MF. L'effet de PB sur la MF dans le contexte KI n'a pas pu être observé en raison de la longue période d'apparition de la MF chez ces souris. En traitant des souris, ayant subi une greffe compétitive (75% de cellules WT + 25% de Jak2V617F) avec le PB, nous avons montré que cette drogue cible spécifiquement le clone Jak2V617F depuis les cellules souches de la MO et jusqu'aux cellules matures du sang. En conclusion, dans ce modèle KOKI, la dérégulation de p19/CDK4/6 dans les MKs est suffisante au développement d'une MF sévère, suggérant que les inhibiteurs de CDK4/6 pourraient être un enjeu thérapeutique prometteur pour les patients atteints de MF.Primary myelofibrosis (PMF), Essential Thrombocythemia (ET) and Polycythemia Vera (PV) are part of BCR-ABL negative myeloproliferative neoplasms (MPN) and are characterized by a hyperproliferation of myeloid lineages, including megakaryocytes (MKs). This hyperproliferation, due about 50% of cases to the JAK2V617F mutation, can lead to Extramedullary Hematopoiesis (EMH) and myelofibrosis (MF) development, that MKs are the major players. Although, the use of JAK2 inhibitors, such as ruxolitinib or fedratinib, decreases the symptoms of MF, they have no real effect neither on progression nor on reduction of MF. The only effective treatment is bone marrow (BM) allogeneic transplantation. The aims of this work were to analyze the role of MKs in MF development in Jak2V617F context, and then to propose a mouse model with a rapid MF development to test preventive treatments. Recently, it has been shown that in hematopoietic progenitors from Jak2V617F mice, the CDK6 expression and activity are increased and, in mice model, the loss of CDK6 leads to a correction of MPN phenotype. In the past, our lab has shown that the CDK4/6 inhibitor, p19INK4D regulates MKs cell cycle and stops endomitosis; its knock-out in mice, induces fibrosis and splenomegaly with age. Thus, we analyzed ploidy and p19 expression in MKs from Jak2V617F mice and ET patients with JAK2V617F mutation. Our results showed that in both cases, the MKs ploidy is increased and correlated with a decrease of p19 expression. The purpose of our work is to study the role of p19 and CDK4/6 in the MF development and to evaluate this axis as a therapeutic target. To study the impact of decreased p19 expression on MF, we crossed two mice models, the constitutive KO p19 mice and the conditional KI Jak2V617F mice. These mice are called "KOKI". We showed that Jak2V617F mice develop a late fibrosis due to an amplification and activation of MKs with increased ploidy and consequently a higher medullary secreted TGF-β1 concentration. This phenotype is exacerbated by the total absence of p19 in KOKI mice which develop an early MF of grade 1 from 3 weeks post Jak2V617F induction and grade 3 at 8 weeks. The KOKI model allows the study of the development of MF and to perform preclinical essays. Due to the fibrosis development, these mice present also a hypocellularity in the BM and splenomegaly, as consequence of EMH. To know if the p19/CDK4/CDK6 axis could represent a therapeutic target in MF, we used palbociclib (PB), a CDK4/CDK6 specific inhibitor. The treatment of Jak2V617F and KOKI mice with PB repairs the myeloproliferative syndrome, leads to a decrease in ploidy and in size of MKs, as well as active TGF-β1 concentration; further it significantly reduces the EMH, and only in KOKI, inhibits the MF occurrence. The effect of PB on MF in KI context could not be observed due to the long period of MF appearance in these mice. We showed that this drug specifically targets the Jak2V617F clone from the BM stem cells to mature blood cells by treating competitive transplanted mice (75% of WT cells + 25% of Jak2V617F) with PB. To conclude, with this KOKI model, we have shown that the deregulation of p19/CDK4/6 in MKs is sufficient for the development of severe MF, suggesting that CDK4/6 inhibitors could be a promising therapeutic tool for patients suffering from MF
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Study of the mechanisms leading to the pre-leukemic state of FPD/AML patients
No full textLa thrombopénie familiale avec prédisposition à la leucémie aiguë myéloïde (FPD/AML) est une pathologie rare caractérisée par une thrombocytopénie. La FPD/AML est causée par des mutations germinales dans le gène codant le facteur de transcription RUNX1. Ces mutations sont de type dominant négatif (DN), associées à un risque plus élevé de développer une leucémie, ou de type haploinsuffisance (HI) induisant une thrombocytopénie seule. Nous avons démontré une diminution presque complète de l’expression du répresseur transcriptionnel ZBTB1 dans les progéniteurs hématopoïétiques des patients porteurs de mutations DN. Le gène ZBTB1 pourrait être une cible directe de RUNX1, et pourrait contribuer à la dérégulation de la lymphopoïèse T conduisant à une prédisposition à la LAL-T.Nous avons identifié dans les cellules lymphocytaires murines le site de fixation de RUNX1 sur un enhanceur localisé à 270 kb en amont du promoteur de Zbtb1, et ce aux stades doubles négatifs pour les marqueurs CD4/CD8. Dans les stades plus matures (CD4+CD48+), cette fixation n’est pas observée. En utilisant des lignées lymphocytaires humaines représentant les différents stades doubles négatifs CD4/CD8 de la différenciation lymphocytaire, nous ne sommes pas arrivés à démontrer cette liaison suggérant qu’elle a lieu à un stade très précis et transitoire difficilement identifiable. Les souris KO Runx1 et KO Zbtb1 montrent un blocage de la lymphopoïèse T dès les stades les plus précoces de la maturation thymique. Nous voulions démontrer que la surexpression de Zbtb1 dans un contexte KO Runx1 aboutirait à un sauvetage du phénotype lymphocytaire. Pour cela, nous avons utilisé un modèle in vitro (culture des progéniteurs hématopoïétiques sur des lobes thymiques) et in vivo reposant sur la greffe de souris irradiées par des progéniteurs hématopoïétiques de souris KO Runx1 surexprimant Zbtb1. Le KO Runx1 incomplet et une quasi-absence de la prise de greffe dans les conditions de KO Runx1 ne nous ont pas permis de valider notre hypothèse. Cependant nous avons pu observer que ZBTB1 régule négativement le compartiment des cellules souches et la prise de greffe.Nous nous sommes aussi intéressés au phénotype mégacaryocytaire des souris KO Zbtb1. De manière intéressante, ces souris montrent in vivo un défaut du cycle cellulaire des mégacaryocytes, tandis que in vitro une diminution drastique de la différenciation mégacaryocytaire est observée suggérant ainsi une compensation du microenvironnement in vivo. De plus, nous avons montré une régulation négative directe de ZBTB1 par RUNX1 dans les mégacaryocytes humains. Dans la deuxième partie de ma thèse nous nous sommes intéressés au mécanisme d’induction de la leucémie chez un patient FPD/AML porteur de mutation de type DN (RUNX1R174Q), nous avons identifié une mutation additionnelle à une fréquence de 1% dans le gène TET2 ayant contribué à l’amplification du clone pré-leucémique. Actuellement nous étudions la coopération entre la mutation de RUNX1R174Q et le shTET2 in vivo en greffant des souris NSG avec des cellules progénitrices humaines CD34+ portant la mutation RUNX1 et le shTET2 qui mime la mutation perte de fonction de TET2P1962T observée chez le patient. Des résultats prometteurs montrent une prise de greffe primaire et secondaire plus importante dans les conditions RUNX1R174Q/shTET2 et shTET2 seul. Les expériences in vitro réalisées en parallèle montrent que la mutation de RUNX1R174Q induit des dommages à l’ADN alors que la diminution de l’expression de TET2 par shARN induit une prolifération augmentée des progéniteurs hématopoïétiques. L’addition des deux mutations pourrait ainsi conduire à l’acquisition de mutations additionnelles et à une transformation leucémique.Familial platelet disorder with predisposition to acute myeloid leukaemia (FPD/AML) is a rare condition characterized by thrombocytopenia. FPD/AML is caused by germline mutations in the gene coding for the transcription factor RUNX1. These mutations are devided on dominant-negative (DN) mutations associated with a higher risk of developing leukaemia or haploinsufficiency (HI) mutations inducing thrombocytopenia alone.We have demonstrated an almost complete decrease in the expression of the transcriptional repressor ZBTB1 in hematopoietic progenitors of patients with DN-type mutations. ZBTB1 could be a direct target of RUNX1, and could contribute to deregulation of T lymphopoiesis, leading to a predisposition to T-ALL.In murine immature T lymphocytes (CD4-CD8- stages), we demonstrated a fixation of RUNX1 on an enhancer at 270 kb upstream of Zbtb1 promoter. This fixation is no longer observed in the more mature stages (CD4+CD8+). Using human lymphocyte cell lines representing the different CD4-CD8- differentiation stages, we have not been able to demonstrate this binding suggesting that it takes place at a very precise and transitory stage that is difficult to identify.The KO Runx1 and KO Zbtb1 mice show a blockade of T lymphopoiesis in the earliest stages of thymic maturation. We wanted to demonstrate that the overexpression of Zbtb1 in a KO Runx1 context would result at least in a partial rescue of the lymphocyte phenotype. For this we used an in vitro model (culture of hematopoietic progenitors on thymic lobes) and in vivo based on the grafting of irradiated mice with hematopoietic progenitors of KO Runx1 overexpressing Zbtb1. The incomplete KO Runx1 and the almost complete absence of engraftment in the KO Runx1 conditions did not allow us to validate our hypothesis. However, we observed that ZBTB1 negatively regulates the stem cell compartment and the engraftment capacity.We also studied the megakaryocytic phenotype of KO Zbtb1 mice. Interestingly, these mice show, in vivo, a megakaryocyte cell cycle defect; while in vitro a drastic decrease in megakaryocytic differentiation is observed suggesting an in vivo micro-environmental compensation. We also showed a direct negative regulation of ZBTB1 by RUNX1 in human megakaryoycytes.In the second part of my thesis, we investigated the mechanism of induction of leukemia in an FPD/AML patient with a DN-type mutation (RUNX1R174Q). We demonstrated an additional mutation at a frequency of 1% in TET2 gene, which contribute to the amplification of a preleucemic clone.Currently we are studying the cooperation between the RUNX1R174Q mutation and the shTET2 in vivo by grafting NSG mice with human CD34+ progenitor cells carrying RUNX1R174Q mutation and an shTET2, which mimics the loss of function of TET2 observed in the patient. Promising results show greater primary and secondary graft under RUNX1R174Q /shTET2 and shTET2 conditions. The in vitro experiments carried out, show that the mutation of RUNX1R174Q induces DNA damages, whereas the decrease in the expression of TET2 by shRNA induces an increased proliferation of hematopoietic progenitors. The addition of the two mutations could thus lead to the acquisition of additional mutations and to a leukemic transformation
Mécanismes physiopathologiques conduisant à deux thrombopénies congénitales, thrombocytopénie amégacaryocytaire congénitale (CAMT) et thrombocytopénie 2 (THC2)
No full textÀ ce jour, des altérations de plus de 40 gènes régulant la mégacaryo(MK)poïèse ont été associées aux thrombocytopénies héréditaires (TH). Au cours de ma thèse, j'ai exploré les mécanismes responsables de deux formes de TH, CAMT et THC2, causées par des mutations affectant la principale voie de signalisation régulant la MKpoïèse, l'axe thrombopoïétine (TPO)/MPL. Des mutations dans le gène codant pour le récepteur de la TPO, MPL, sont responsables de la CAMT, une thrombocytopénie sévère à transmission autosomique récessive qui progresse rapidement vers une insuffisance médullaire. Un nouveau variant MPLR464G a été récemment découvert chez les enfants d'une famille consanguine. En utilisant les lignées cellulaires dans lesquels j'ai introduit la mutation d'intérêt, j'ai pu déterminer que MPLR464G génère un récepteur immature qui est retenu dans le RE et est faiblement exprimé à la surface cellulaire, avec un impact sur la signalisation et la prolifération médiée par la TPO, ou son mimétique Eltrombopag (ELT), ou les deux combinés. La surexpression d'un mutant CALR trouvé dans les NMP n'a pas restauré l'expression de surface du récepteur ni la signalisation, alors qu'en la combinant avec ELT la signalisation et la prolifération ont été corrigées. De plus, la surexpression de CALRmut et l'ELT ont permis de restaurer complètement la maturation MK d'un patient CAMT in vitro suggérant que la présence de CALRmut favorise l'activation de MPLR464G par ELT, mais pas par TPO. La THC2 est causée par des mutations dans la région 5'UTR du gène ANKRD26; les patients présentent une thrombocytopénie et un risque augmenté de développer une leucémie myéloïde. Des études antérieures du laboratoire ont montré que RUNX1 et FLI1 inhibent l'expression d'ANKRD26 lors de la MKpoïèse normale, et que les mutations trouvées chez les patients empêchent leur fixation conduisant à une expression persistante d'ANKRD26. Cela conduit à une activation accrue de la voie MAPK liée au défaut de formation des proplaquettes. ANKRD26 serait donc nécessaire lors des premières étapes de la MKpoïèse, mais son expression doit être diminuée à la fin de maturation. Au cours de ma thèse, j'ai participé au travail montrant que la surexpression d'ANKRD26 empêche l'internalisation de MPL entraînant une activation plus forte des voies JAK/STAT, PI3K et MAPK, une prolifération et une hypersensibilité accrues à la TPO et à son analogue, l'ELT. Puisque certains patients présentent la leucocytose ou erythrocytose, et que EPOR et G-CSFR appartiennent à la même famille de récepteurs de cytokines que MPL, avec des caractéristiques structurelles communes, nous avons supposé que ANKRD26 peut interagir avec ces récepteurs et moduler leur activité. En utilisant des lignées cellulaires, nous avons confirmé que ANKRD26 interagit avec ces trois récepteurs et montré que l'expression soutenue d'ANKRD26 conduit à une signalisation accrue également en réponse aux EPO et G-CSF. En utilisant des cellules primaires, nous avons confirmé que la modulation d'ANKRD26 affecte la prolifération et la maturation des lignages granulocytaire et érythroïde. Ces travaux ont établi un rôle crucial d'ANKRD26 en tant que nouveau modulateur de la signalisation médiée par les cytokines dans l'hématopoïèse. En effet, dans l'hématopoïèse normale, ANKRD26 est fortement exprimée lors des étapes précoces de la différenciation érythroïde, MK et granulocytaire pour préserver une forte signalisation cytokine/récepteur de type I qui mettra l'amplification du lignage, puis est progressivement diminuée, afin de réduire la signalisation et permettre une maturation correcte. Par conséquent, les niveaux d'expression anormaux d'ANKRD26 détectés chez les patients THC2 augmentent la signalisation médiée par les 3 récepteurs homodimériques de type I MPL, G-CSFR et EPOR, et impactent la prolifération/différenciation de ces trois lignées myéloïdes conduisant donc à une thrombocytopénie, une érythrocytose et prédisposition à la leucémie.To this day, alterations in more than 40 genes have been associated with inherited thrombocytopenias (IT), due to the impact on important regulators of all phases of megakaryopoiesis, from the early commitment to the platelet release. During my PhD, I explored the mechanisms that underlie two IT forms caused by mutations that affect the thrombopoietin (TPO)/MPL signaling axis, one of the main regulators of megakaryopoiesis. Mutations in the gene encoding TPO receptor MPL are responsible for CAMT, a rare disorder that presents in early infancy with severe thrombocytopenia and rapid progression towards bone marrow failure. Here I describe the pathophysiology of a newly reported MPL R464G variant detected in the children of a consanguineous family. By using cell line models in which I introduced the mutation of interest, I was able to determine that MPLR464G generates an immature receptor that is retained in the ER and is weakly expressed at the cell surface, with consequent impact on signaling and proliferation mediated by TPO, or its mimetic Eltrombopag (ELT), or both combined. The overexpression of a CALR mutant found in MPN was not able to restore the surface expression of the receptor. Interestingly, however, the combination of CALRmut and ELT was able to completely restore the signaling and proliferation. Moreover, overexpression of CALRmut in patient-derived cells cultured in presence of ELT allowed to completely restore the MK maturation. We conclude that the presence of CALRmut favors the activation of MPLR464G by ELT, but not by TPO. THC2 is caused by mutations in the 5'UTR region of the ANKRD26 gene; patients present mild thrombocytopenia and an increased risk to develop myeloid leukemia. Previous studies from the lab showed that RUNX1 and FLI1 downregulate the expression of ANKRD26 during normal MKpoiesis, while the mutations found in patients disrupt their binding site and lead to a persistent expression of ANKRD26. This in turn leads to a stronger activation of the MAPK signaling pathway in patient megakaryocytes linked to the defect in proplatelet formation. This suggests that ANKRD26 is required in the first steps of MKpoiesis, but its expression must be decreased in the late phases. During my PhD, I have participated to a work showing that ANKRD26 overexpression prevents MPL internalization resulting in a stronger activation of JAK/STATs, PI3K and MAPK pathways, increased proliferation and hypersensitivity to TPO and its analog, ELT. Since EPOR and G-CSFR belong to the same cytokine receptor family as MPL, with common structural features, and some patients present with leukocytosis or erythrocytosis, we hypothesized that ANKRD26 may interact with these receptors and modulate their activity. We confirmed by co-immunoprecipitation assays that ANKRD26 interacts with all the three receptors and demonstrated that sustained ANKRD26 expression leads to an increased signaling also in erythroid and granulocytic lineage. Using primary cells we have shown that the modulation of ANKRD26 level affects the proliferation and maturation of both granulocytic and erythroid lineages. This work established a crucial role of ANKRD26 as a new modulator of the cytokine-mediated cell signaling in hematopoiesis. Indeed, in normal hematopoiesis, ANKRD26 is highly expressed in the early steps of erythroid, megakaryocyte and granulocyte differentiation to preserve a strong cytokine/receptor type-I signaling, and then is progressively silenced, in order to decrease the signaling and achieve a correct final maturation for all the three myeloid lineages. Consequently, abnormal ANKRD26 expression levels detected in THC2 patients upregulate the signaling mediated by the 3 type I homodimeric receptors MPL, G-CSFR and EPOR by preventing their internalization and impact the proliferation/differentiation of these three myeloid lineages leading therefore to thrombocytopenia, erythrocytosis and predisposition to leukemia
Variations on the Author
Get PDF“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Get PDFWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Get PDFWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
koamabayili/VECTRON-author-checklist: VECTRON author checklist
No full textWe have done our best to complete the author checklist relating to the use of animals in the hut study. Note that the objective for the hut study was to evaluate the IRS treatment applications for residual efficacy against Anopheles mosquitoes, including the local An. coluzzii mosquito population. Cows were only used to attract mosquitoes into the huts and no tests were carried out directly on the cows. The author checklist is intended for use with studies where experiments are carried out on animals, which is why we have had such difficulty in completing this for the hut study, as many of the questions do not relate to how the cows were used
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