387 research outputs found
Rezension von: Steuer, Peter (Bearb.), Vorderösterreichische Regierung und Kammer 1753-1805, Oberamt Altdorf
No full textDie grosse Mutter Lieb und Trew deß ewigen Sohnes Gottes/ gegen seine Rechtgläubige Kirche
No full textFulciniini Ehrmann & Roy 2002
No full textKey to known Australian Fulciniini genera <p> 1 Overall body colour greenish, rarely brown; pronotum with a pair of obvious raised tubercles posteromedially; female abdomen with small to large dorsomedian projections; male genitalia with pda rounded and usually bifurcate, with afa elongate to kidney-shaped............................................................................ <i>Calofulcinia</i> Giglio-Tos</p> <p>- Overall body colour brown or grey; pronotum with or without obvious raised tubercles; female abdomen with small dorsomedian projections only or without dorsomedian projections; male genitalia not as above................................... 2</p> <p> 2 Form slender; pronotum elongate and more than 2.2 times as long as wide (Figure 1A–B, 6A–B); female abdomen without dorsomedian projections; male genitalia with pda a single robust spine (Figure 1C–D, 6C–D)................ <i>Ima</i> Tindale</p> <p> - Form robust; pronotum roughly diamond-shaped and approximately 2.0 times as long as wide (Figure 10A–B); female abdomen with small dorsomedian projections; male genitalia with pda bifurcate (Figure 10C–D)........... <i>Inimia</i> Connors <b>gen. nov.</b></p>Published as part of <i>Connors, Matthew G., Yeeles, Peter, Lach, Lori & Rentz, David C. F., 2023, A revision of the genus Ima Tindale (Mantodea: Nanomantidae: Fulciniinae) with the description of a new genus, pp. 201-226 in Zootaxa 5380 (3)</i> on page 202, DOI: 10.11646/zootaxa.5380.3.1, <a href="http://zenodo.org/record/10224417">http://zenodo.org/record/10224417</a>
GDP Data Revisions and Forward-Looking Monetary Policy in Switzerland
No full textThis paper analyzes forward-looking rules for Swiss monetary policy in a small structural VAR model consisting of four variables taking into account data revisions for GDP. First, the paper develops an analytical method to analyze the effect of data revision errors in GDP on the ex ante or conditional inflation-output-growth volatility trade-off and applies it to Swiss data. Second, the effects of different targets in a forward-looking monetary policy on ex post or unconditional volatility of inflation and output growth is explored by a simulation exercise. In general, the results obtained suggest that focusing monetary policy on GDP growth instead on inflation may lead to an inefficient policy with both increased medium term inflation and GDP growth volatility in the presence of GDP data revisions.Structural VAR, forward-looking monetary policy, efficiency frontier, GDP data revisions
Auf Diäten und Fasten basierende Interventionen als neue Ansätze um die Effizienz von Krebs-Behandlungen zu steigern
No full textKurzzeitiges Fasten (STS) schützt normale Zellen, Mäuse und potenziell auch Patienten vor den schädlichen Nebenwirkungen einer Chemotherapie. In dieser Dissertation demonstriere ich, dass fasten-ähnliche Zellkulturkonditionen das Überleben von Nagetier- und menschlichen Krebszellen reduziert und diese gleichzeitig gegenüber chemotherapeutischen Interventionen sensitiviert. In vivo sind Fastenzyklen für manche Krebszellen ähnlich effektiv wie die verwendete Chemotherapie und reduzieren das Tumorwachstum. In Tierversuchsmodellen für Melanome, Gliome und Brustkrebs konnte die Effektivität der verwendeten Chemotherapeutika und auch Strahlentherapie in Kombination mit Fasten erhöht werden. In Mausmodellen für Neuroblastome resultierte die Chemotherapie zusammen mit Fasten in einem langzeitigen Überleben der Mäuse, während die einzelnen Therapien erfolglos blieben. In dem 4T1 Maus Brustkrebs-Modell resultierte STS in einer erhöhten Phosphorylierung der Stress sensitivierenden Kinasen AKT und S6, erhöhtem oxidativen Zellstress, Spaltung der Caspase-3, DNS-Schäden, Apoptose und der gleichzeitig reduzierten Expression von Transkriptions-Faktoren (z.B. NFkB) die eine Rolle im Widerstand gegen Zellstress spielen. Interessanterweise konnten diese Veränderungen in normalen Zellen nicht aufgefunden werden. Mehrere dieser intrazellulären Effekte stehen mit der Aktivität des Enzyms heme oxygenase-1 in Verbindung, dessen Regulierung eine zentrale Rolle in der durch das Fasten bedingten Sensitivierung von 4T1 Brustkrebs spielt. Unsere Studien deuten darauf hin, das Fasten eine differentielle Stress-Sensitivierung in einer Vielzahl von Tumoren auslösen kann, die Effektivität von Chemotherapeutika erhöhen kann und somit möglicherweise eine Alternative zu Chemotherapie darstellt.
Um Alternativen zum Fasten zu finden, evaluiere ich in dieser Dissertation zusätzlich noch die Effekte von kalorienreduzierten (CR), und Nährstoff (Eiweiß, Fett und Kohlenhydrate) definierten, Nahrungsmitteln hinsichtlich ihrer Effektivität im Schutz gegen akut hohe Chemotherapie und Tumorprogression. Eine kurzzeitige 50% Reduzierung der konsumierten Kalorien, auch in Zusammenhang mit Proteindefiziten oder ketogenen Diäten, erhöhte die Resistenz gegenüber der Chemotherapie, blieb jedoch weniger effektiv als Fasten per se. Eine Diät mit hohem Proteingehalt reversierte die positiven Effekte der CR. In subkutan implantierten Gliomen blieb die Ernährung mit auf niedrigem Eiweiß basierten Kalorien (4%) in der Maus nach mehr als 20 Tagen ohne Effekt auf das bereits etablierte Tumorwachstum. Zyklen in denen die Kalorien auf 50% reduziert wurden hatten, im Gegenteil zu Fasten, keine additive Wirkung auf die Behandlung von Brustkrebszellen mit Cisplatin in der Maus. Die präsentierten Ergebnisse belegen dass Fasten, jedoch nicht kurzeitige CR oder die Modifizierung der konsumierten Nährstoffe, vor der Toxizität von Chemotherapeutika schützt und gleichzeitig Krebszellen zu einer Vielzahl von Chemotherapien sensitiviert.Short-term starvation (STS or fasting) protects normal cells, mice and potentially humans from the harmful side-effects of chemotherapeutic drugs. In this dissertation, I demonstrate that fasting-like cell culture conditions reduce cancer cell survival and sensitize human and murine cancer cell lines to chemotherapy. In vivo, cycles of STS were as effective as chemotherapeutics in delaying the progression of specific tumors and increased the effectiveness of these drugs and radiotherapy against melanoma, glioma, and breast cancer cells. In mouse models of neuroblastoma, STS cycles in combination with chemotherapy, but not either treatment alone, resulted in long-term cancer-free survival. In 4T1 breast cancer cells, STS led to increased phosphorylation of the stress-sensitizing AKT and S6 kinases, increased oxidative stress, caspase-3 activation, DNA damage, apoptosis, and reduced expression of the stress resistance transcription factor NFkB; all changes were not observed in normal tissues. Several of these effects are linked to the activity of the stress-responsive enzyme heme oxygenase-1, whose modulation was central in regulating chemotherapy-dependent cell death in breast cancer cells. These studies suggest that multiple cycles of STS promote differential stress sensitization in a wide range of tumors and could potentially replace or augment the efficacy of some toxic chemotherapy drugs in the treatment of various cancers.
In addition, we evaluated the contribution of calorie restricted (CR) diets and defined macronutrient (carbohydrate, protein, fat) ratios for their effects on stress sensitization markers and protection in mice treated with high-dose chemotherapy. Short-term 50% CR, combined with either severe protein-deficient or ketogenic diets, improved chemotoxicity resistance similarly to the standard 50% CR, but did not result in the high protection caused by STS. Notably, a high protein diet reversed the beneficial effects of short-term CR. In a subcutaneous mouse model of glioma, feeding a low protein diet (4% calories from protein vs. 18% in the control) for more than 20 days did not delay tumor progression once the tumor became palpable. Also, cycles of short-term (3 days) 50% CR did not augment the chemotherapy efficacy of cisplatin in a murine breast cancer model. These results indicate that the protection from chemotoxicity and retardation of tumor progression achieved with fasting could not be obtained with short-term calorie and/or macronutrient restriction
Structural and Biochemical Characterization of the Human Serine Protease HtrA1
No full textHtrA1 gehört zur Familie der HtrA (High temperature requirement) Serin-Proteasen, einer Gruppe hochkonservierter Proteasen, die sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Mitglieder umfasst.
Gemeinsames Merkmal dieser Serin-Proteasen ist das Vorhandensein einer hoch-konservierten Trypsin-ähnlichen Domäne und mindestens einer C-Terminalen PDZ-Domäne. HtrA1 wurde ursprünglich als weniger exprimiertes Gen in SV40-transfomierten Fibroblasten identifiziert und wird
außerdem mit verschiedenen Krankheitsbildern, wie Arthritis, altersbedingter Makuladegeneration oder der Alzheimerschen Krankheit in Verbindung gebracht.
In dieser Arbeit werden drei Kristallstrukturen von HtrA1 präsentiert. Sie zeigen die Protease Domäne in der inaktiven und aktiven Konformation. Beide Konformation weisen vergleichbare strukturelle Gegebenheiten im Vergleich mit anderen HtrA Familienmitgliedern auf. Zugleich werden aber signifikante Besonderheiten für HtrA1 deutlich.
Interessanterweise ist die Bindung des Peptid-Inhibitors in das aktive Zentrum der Protease Domäne ausreichend, um konformationelle Änderungen hervorzurufen, die durch Reorientierung der Schleifen, die das aktive Zentrum gestalten, von einer inaktiven zu einer aktiven Konformation
führen. Schleife L3, die in der inaktiven Konformation ungeordnet ist, zeigt jetzt eine geordnete Konformation und definierte Interaktionen mit dem Inhibitormolekül. Diese Erkenntnis ist unterschiedlich zu vergleichbaren bekannten HtrA Strukturen in denen L3 eine geordnete Konformation durch spezifische Interaktionen mit der PDZ Domäne einnimmt.
Im zweiten Teil der Arbeit stand die Entwicklung eines Aktivitäts-Assays und die Messung der enzymatichen Aktivität verschiedener verkürzter Versionen von HtrA1 im Vordergrund. Es wurden Inhibitoren und Peptide auf die Fähigkeit hin getestet, an HtrA1 zu binden und die enzymatische Aktivität zu regulieren. Dabei sollte vor allem die Rolle der PDZ Domäne untersucht werden.
Die PDZ Domänen der bakteriellen HtrAs sind wichtig für die Erfassung von Protein Faltungsstress, sie sind Bindungsstellen für Substrate und regulieren die enzymatische Aktivität. Für das humane HtrA1 konnte gezeigt werden, dass die PDZ Domäne entbehrlich für die katalytische Aktivität ist, aber eine Rolle für die allosterische Regulation von HtrA1 spielt. Außerdem beeinflusst die PDZ Domäne die Produktlänge von geschnittenen Substraten.
Vor allem interessant ist, daß die Daten auch auf die Möglichkeit hindeuten, daß die Protease durch einen konservierten Mechanismus der Oligomerisierung reguliert wird. Dieser Mechanismus der Regulation durch Oligomerisierung wurde zuerst für das bakterielle Familienmitglied DegP beschrieben (Krojer et al. 2008), konnte aber nicht für bakterielles DegS oder humanes HtrA2 gezeigt werden. Es ist daher spannend zu spekulieren, dass HtrA1 analog zu DegP ein Molekül darstellt, das in der Lage ist ungefaltete oder fehlgefaltete Proteine zu sequestrieren, um sie der Rückfaltung oder dem Abbau zuzuführen. Damit könnte es ein Teil der Stressantwort auf ungefaltete Proteine in der ECM sein, ein Qualitäts-Kontrollsystem das noch nicht sehr charakterisiert ist.
Obwohl die hier präsentierten Kristallstrukturen von HtrA1 und die biochemischen Analysen unser Wissen über HtrA1 erweitern, ist die Zahl der offenen Fragen immer noch immens. Die dargestellten Ergebnisse können somit die Grundlage für wichtige Experimente in der Zukunft bilden, die einen weiterführenden Einblick in den Mechanismus der Aktivierung der humanen Serin-Protease HtrA1 ermöglichen.The HtrA (high temperature requirement) family represents a new class of oligomeric serine proteases in which a catalytic domain is combined with one or more C-terminal PDZ (protein-protein interaction) domains. These proteins are widely conserved and found in most organisms from bacteria to mammals.
In this thesis, studies were performed to obtain an understanding of the structural properties of human HtrA1 and the regulation of its proteolytic activity.
Crystallization and subsequent structure solution consisted of several consecutive steps, beginning with the establishment of an efficient and reproducible protein purification procedure, followed by N-terminal sequencing, mass spectrometry, size-exclusion chromatography and dynamic light scattering in order to detect any unwanted post-translational modifications, to elucidate the molecular weight of the oligomer in solution and the homogeneity of the sample. The crystallization of the protein was performed by employing the widely used sparse-matrix screening methods. After production of diffraction quality crystals, the crystal structure of HtrA1 was solved by molecular replacement (MR).
To access the structural properties of HtrA1 different deletion constructs of the proteolytic active and inactive form of HtrA1 were applied for crystallization. Finally three crystal structures are presented for human HtrA1. One crystal structure shows the protease domain in the inactive conformation and two showing the protease plus PDZ-domain in the inactive and active conformation. To get the active conformation, HtrA1 was co-crystallized with a peptide inhibitor which was shown to abolish the proteolytic activity.
With the crystal structures it was possible to elucidate the organization of the oligomer and the structural determinants of the active site.
The active and inactive states both share common structural features with other members of the HtrA family. But they also show striking mechanistic differences.
Interestingly, binding of the peptide inhibitor to the active site of the protease domain alone leads to conformational changes of all active site loops setting up the active conformation showing defined interactions with the peptide inhibitor. This observation is different to known HtrA structures where the active site becomes ordered by specific interactions with the PDZ domain or to a stress peptide bound to the PDZ domain.
In the second part of the study, the development of an activity assay and the measurement of enzymatic activity of different deletion constructs was the main focus. Furthermore inhibitors, peptides and substrates were tested for the ability to bind to HtrA1 and to regulate the enzymatic activity. The role of the PDZ domains in human HtrA1 was one of the leading questions.
While in bacterial HtrAs the PDZ domains function as sensors of protein folding stress, binding sites for substrates, regulators of the enzymatic activity and are required for oligomerization, it could be shown that in human HtrA1 they are dispensable for proteolytic activity but are involved in allosteric regulation. Furthermore they influence the product size of cleaved substrates.
Most interestingly these data also suggest that human HtrA1 could be regulated by a conserved mechanism of activation by oligomerization which was first described for bacterial DegP (Krojer et al. 2008). It could not be shown for DegS or human HtrA2. It is therefore exciting to speculate that in analog to DegP HtrA1 establishes a packaging device that is able to sequester unfolded proteins for partitioning between refolding and degradation pathways.
Although the crystal structures of HtrA1 and biochemical analysis have enlarged our knowledge about HtrA1, there are still a great number of open questions regarding the regulation of this family member. Therefore the presented results could be the guide for future experiments that will allow a detailed view into the activation mechanism of human HtrA1
Binding Partners of Parvulin Proteins using the High-Throughput Screening Methods such as Yeast two-hybrid and Phage Display
No full textPeptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIases) are the enzymes that increase the rate of isomerization of the peptide bond N-terminal to the proline substrate. Parvulin14 (Par14) and its isoform Par17 belong to the Parvulin family which is the third family of PPIases. Par14 was shown to bind the DNA. Par14 was also proposed to be a part from the pre-ribosomal ribonucleoprotien complexes and an RNA processing factor that is involved in ribosome biogenesis. The longer isoform Par17 was shown to be expressed only in the Hominidae, and is targeted to the mitochondria. In order to find binding partners for Par14/17 (peptides or proteins), we applied the high through-put screening methods, the yeast two-hybrid (Y2H) and the phage display (Ph.D.). In our Y2H study we show a target-unrelated protein that may confuse a number of Y2H results. In our Ph.D. screening against PinA of Cenarchaeum symbiosum we selected a peptide that binds PinA with low affinity; however we used this peptide to map PinA putative PPIase active site, and to show a flexible region of PinA. The flexibility of this region is probably a general feature of the peptidyl prolyl cis/trans isomerization. Furthermore, we panned 7 and 12-mer peptide libraries against Par17. One consensus sequence was enriched from both libraries, XHSXVHØ, where X can be any amino acid and Ø is a hydrophobic amino acid. We demonstrate the binding of this motif to Par14/17 with phage ELISA and NMR spectroscopy where we could show that this motif is binding to the PPIase domain of Par14/17. Moreover, using these peptides we map the PPIase active site of Par14/17. Our peptides can be used to design peptides to study the PPIase activity of Par14/17, and to elucidate the motif that Par14/17 recognizes in vivo.Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (PPIasen) sind Enzyme, die cis/trans-Isomerisierung von Peptidyl-Prolyl-Bindungen (Xaa-Pro-Bindungen) katalysieren. Parvulin 14 (Par14) und seine Isoform Par17 gehören zu der Familie der Parvuline, einer Untergruppe der PPIasen. Für Par14 wurde gezeigt, dass es an DNA bindet. In einer anderen Studie wurde gezeigt, dass Par14 Teil des preribosomalen Ribonukleoprotein-Komplexes ist und ein RNA-Prozessierungsfaktor sei, welcher in der Ribosomenbiogenese involviert ist. Par17 kommt nur in Hominidae vor und ist in den Mitochondrien lokalisiert. Um Bindungspartner für Par14/17 (Peptide oder Proteine) zu finden, wurden Hochdurchsatz-Screening-Verfahren, das Yeast-two-Hybrid-System (Y2H) und das Phagen-Display (Ph.D.) verwendet. In der Y2H-Studie wurde ein target-unrelated-protein (TUP) gefunden. Im Ph.D. Screening gegen PinA von Cenarchaeum symbiosum wurde ein Peptid gefunden, das PinA mit niedriger Affinität bindet. Mithilfe des Peptids konnte ein vermutliches aktives Zentrum der PPIase PinA zugeordnet werden. Ebenfalls wurden eine 7 und 12-mer Peptidbibliothek gegen Par17 entwickelt. Die Konsensus-Sequenz XHSXVHØ wurde aus beiden Bibliotheken angereichert, wobei X eine beliebige Aminosäure und Ø eine hydrophobe Aminosäure darstellt. Die Bindung dieses Motivs an Par14/17 wurde über Phagen-ELISA und NMR-Spektroskopie untersucht, wobei gezeigt werden konnte, dass dieses Motiv an die Par14/17 PPIase Domäne bindet. Mithilfe dieser Peptide wurde das putative aktive Zentrum von Par14/17 in den NMR-Strukturen zugeordnet. Desweiteren können besagte Peptide zukünftig dazu verwendet werden, potentielle Bindungspartner von Par14/17 zu finden
Error Estimation of 3D-Eye-Models in Eye-Tracking Protocols
No full textAn error estimation of 3D-eye-models in eye-tracking protocols – undetected eye movements and the use of standards for cardinal points
Peter Wagner, Klaus Ehrmann, Fabian Conrad, Ravi Bakaraju
Brien Holden Vision Institute, Australia
University of New South Wales, Australia
[email protected]
Background / Purpose
Virtual and augmented reality applications rely on ocular vergence measurements to determine fixation point location and distance in 3D space. 3D-eye-models in eye tracking achieve lateral accuracies of 1.5-2° on a 2D plain, which is insufficient for clinically meaningful vergence measurements.
Methods
We compared 3D-eye-models with optometric schematic eyes with regard to location of cardinal points (the pupil- and eye rotation- center); their movements, and resulting effects during detection. We then modelled identified disparities to estimate influence on gaze and vergence measurements.
Results
Blink related retraction into the orbita account for up to 2° in monocular gaze errors, resulting in twice the error for vergence measurement. Common absolute pupil center shifts during constriction of 0.1 mm relate to 0.5° in gaze or 1° vergence error, respectively. 3D eye modeling assumes a pupil rotation sphere to calculate gaze direction. Dislocation between the true and assumed sphere center has multiple implications on gaze and vergence measurements (Figure 1).
Figure 1 A) Principle of distortion of gaze angle B) influence on field of gaze right eye (OD).
Empirical observation of recordings support the effect of blink related retraction and pupil shift during constriction on vergence measurements.
Discussion
To reliably measure vergence and derive focus point distances, undesired blink-related eye movements need to be compensated for. Furthermore, customized determination of cardinal points in eye tracking protocols will improve the accuracy of such measurements
Neue Inhibitoren für die Protease Taspase1
No full textAbstract
The threonine protease Taspase1 is of high interest as new target for cancer therapeutics, due to its implication in leukemias and solid tumors. Although Taspase is not an oncogene itself, it is crucially required for the proteolytic activation of the MLL oncogene as well as MLL fusion
proteins generated by chromosomal translocations. Hence, MLL‐dependent cells can successfully be targeted by inhibition of Taspase activity. However, Taspase is insensitive to inhibition by
general serine, cysteine or metalloprotease inhibitors. Furthermore, the limited number of available Taspase inhibitors display either low inhibitory potential or broad bioactivity. Thus, novel Taspase inhibitors are still urgently required.
In a first step, detailed characterization revealed for the first time that recombinant Taspase and protein overexpressed in eukaryotic cells are comparable with respect to their catalytic parameters.
Moreover, the specific catalytic activity (0.03 U/mg) was determined, as well as a 20‐fold higher efficiency regarding cleavage of the CS2 cleavage site of MLL over CS1. Regarding stability,
Taspase rapidly loses its catalytic activity (half‐life < 3 h), unless it is stabilized by high concentrations of NaCl (≥ 450 mM). Additionally, the autocatalytic processing event required for catalytic competence was found to occur on a time scale of 2‐3 days. The flexible loop region
between glycine 178 and aspartate 233 generated by this activation event is not resolved in the crystal structure. Hence, NMR and CD spectroscopy were applied and the results suggest a helixturn‐helix structure. Furthermore, analytical gel filtration pinpointed that Taspase is active as a
hetero‐tetramer in solution. With these data, a fluorogenic in vitro assay was optimized for initial inhibitor tests.
While the controversially discussed bisarsonic inhibitor NSC48300 and compounds derived from virtual docking exhibited no inhibitory effect, both silica nanoparticles and succinimide peptides were discovered as novel Taspase inhibitors. In fact, silica nanoparticles are known to bind
proteins, albeit nanoparticle‐mediated inhibition of enzyme activity is scarcely described.
Surprisingly, IC50 values in the nanomolar and picomolar range indicate high affinity binding, which was observed in vitro and in cells. In addition, comparison of nanoparticles with different diameters (8‐125 nm) suggests a positive correlation of size and affinity. Subsequent analyses
characterized the inhibition type as noncompetitive and pinpointed that Taspase does not change its structure upon binding. Importantly, inhibition by nanoparticles is no general feature, as three
other enzymes (lactate dehydrogenase, chymotrypsin, and proteinase K) showed no or only weak inhibition by silica nanoparticles.
Another approach for Taspase inhibition exploited the cleavage sequence and the proposed mechanism to design substrate analog peptides with a succinimide moiety at the cleavage site.
The most promising compound exhibited a Ki value of 400 ± 88 nM and displays thus a tenfold better inhibitory potential than the best reported Taspase inhibitor. Moreover, the competitive
inhibition type and the resistance against Taspase cleavage were verified. However, degradation by other proteases and/or limited cellular uptake as well as competition with chloride ions prevents the in vivo inhibition of Taspase.
Altogether, these findings demonstrate the potential of silica nanoparticles as well as succinimide peptides as Taspase inhibitors and tools for subsequent studies.Abstract
Die Threonin‐Protease Taspase1 stellt aufgrund ihrer Beteiligung an Leukämien und soliden Tumoren einen wichtigen neuen Ansatzpunkt für Krebsmedikamente dar. Obwohl Taspase selbst
Onkogen ist, ist sie unabdingbar für die proteolytische Aktivierung des Onkogens MLL und der durch Translokationen entstandenen MLL‐Fusionsproteine. Deshalb reagieren MLLabhängige
Zellen besonders sensitiv auf Taspase‐Inhibition. Allerdings sind sämtliche allgemeinen Serin‐, Cystein‐ und Metalloprotease‐Inhibitoren unwirksam gegen Taspase, und auch die wenigen verfügbaren Taspase‐Inhibitoren besitzen entweder nur geringes Inhibitorpotential
oder ein breites Wirkspektrum. Daher sind neue Taspase‐Inhibitoren nach wie vor von hoherRelevanz.
Ein Vergleich rekombinanter Taspase mit in eukaryotischen Zellen überexprimiertem Protein zeigte eine vergleichbare spezifische katalytische Aktivität (0.03 U/mg). Weiterhin konnte eine
20‐fach höhere Effizienz hinsichtlich der Spaltung der CS2‐Schnittstelle von MLL gegenüber der CS1‐Schnittstelle festgestellt werden. Bei Betrachtung der Proteinstabilität fiel auf, dass Taspase
sehr schnell an Aktivität verliert (Halbwertszeit < 3 h), sofern das Protein nicht durch hohe Salzkonzentrationen (≥ 450 mM NaCl) stabilisiert wird. Zudem wurde für die autokatalytische Prozessierung des Proenzyms, welche wichtig zur Erlangung katalytischer Kompetenz ist, eine
Zeitspanne von 2‐3 Tagen ermittelt. Der dabei entstehende flexible Bereich zwischen Glycin 178 und Aspartat 233 ist in der Kristallstruktur ungeordnet, konnte aber dank NMR‐ und CDSpektroskopie
als potentielles Helix‐Turn‐Helix‐Motiv identifiziert werden. Des Weiteren
belegten analytische Gelfiltrationen die Aktivität von Taspase als Hetero‐Tetramer. Mithilfe dieser Informationen wurde ein in vitro Assay optimiert und für Inhibitortests verwendet.
Während der kontrovers diskutierte Inhibitor NSC48300 und die mittels virtuellen Dockings ermittelten Substanzen keine Inhibition zeigten, konnten Silikatnanopartikel und Succinimid‐Peptide als neue Taspase‐Inhibitoren identifiziert werden. Obwohl Proteinbindung an
Nanopartikel bekannt ist, ist eine durch diese vermittelte Enzyminhibition kaum beschrieben.
Umso überraschender sind die IC50‐Werte im nano‐ und picomolaren Bereich, die sowohl in vitro als auch in Zellen beobachtet wurden. Weiterhin konnte mit verschiedenen Nanopartikelgrößen
eine positive Korrelation von Durchmesser und Affinität belegt werden. Weitere Analysen ergaben eine nichtkompetitive Inhibition und keine Strukturänderung bei Bindung.
Bemerkenswerterweise stellt Enzyminhibition keine generelle Eigenschaft von Nanopartikeln dar, da drei Kontrollenzyme (Lactatdehydrogenase, Chymotrypsin und Proteinase K) kaum durch Nanopartikel inhibiert wurden.
In einem anderen Ansatz wurde die Taspase‐Schnittsequenz und der vermutete Mechanismus für das Design peptidischer Substratanaloga mit Succinimid‐Motiv an der Schnittstelle genutzt. Die beste Verbindung zeigte einen Ki‐Wert von 400 ± 88 nM und ist damit ein zehnfach besserer
Hemmstoff als der beste zuvor beschriebene Taspase‐Inhibitor. Des Weiteren konnte die kompetitive Hemmung und die Stabilität gegenüber Abbau durch Taspase gezeigt werden.
Allerdings verhindern schlechte Zellaufnahme und/oder Abbau durch andere Proteasen sowie Kompetition mit Chlorid‐Ionen eine Inhibition in vivo.
Insgesamt belegen diese Ergebnisse das Potential von Silikatnanopartikel sowie Succinimid‐Peptiden als Taspase‐Inhibitoren und Werkzeuge für nachfolgende Studien
Epigenetic regulation of the highly conserved serine protease HtrA1
No full textHtrA1 gehört zu der HtrA (High temperature requirement)-Familie der Serin-Proteasen, einer
Gruppe hochkonservierter Proteasen, die sowohl eukaryotische, als auch prokaryotische
Mitglieder umfasst. Gemeinsames Merkmal dieser Serinproteasen ist das Vorhandensein
einer hoch-konservierten Trypsin-ähnlichen Domäne und mindestens einer PDZ-Domäne am
C-Terminus. HtrA1 wurde ursprünglich als herunter reguliertes Gen in SV40-transfomierten
Fibroblasten identifiziert und wurde seitdem mit verschiedenen Krankheitsbildern, wie z.B.
Arthritis, altersbedingter Makuladegeneration und der Alzheimerschen Krankheit, in
Verbindung gebracht.
HtrA1 ist außerdem für einige Krebsarten, wie z.B. Ovarialkarzinome, Melanome und
Mesotheliome, von Bedeutung. Die Expression von HtrA1 ist in diesen Tumoren herunter
reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Mechanismus, der für die aberrante
Verminderung der HtrA1-Expression in Tumorzellen verantwortlich ist, identifiziert. Der
HtrA1-Promotor enthält eine CpG island, die in Kolonkarzinomzelllinien und Darmpolypen
von APCMin/+-Mäusen hypermethyliert ist. Diese Hypermethylierung korreliert mit der
Inhibition der HtrA1-Expression. Damit konnte HtrA1 erstmals mit der Entstehung des
Kolonkarzinoms in Verbindung gebracht werden. Durch Behandlung mit epigenetischen
Pharmazeutika kann die Expression von HtrA1 in Zelllinien, die einen hypermethylierten
HtrA1-Promotor aufweisen, wiederhergestellt werden. Demzufolge ist die DNA-Methylierung
reversibel.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass durch die Suppression von MBD2, einem Mitglied
der MBD-Proteinfamilie, die HtrA1-Expression in Zellen mit einem hypermethylierten HtrA1-
Promotor gesteigert werden kann. In Zellen mit einem unmethylierten HtrA1-Promotor hat die
MBD2-Suppression hingegen keinen Effekt. Demnach bindet MBD2 methylierungsabhängig
an den Promotor und inhibiert die Transkription von HtrA1.
Aufgrund der Fähigkeit an die Promotoren von Tumorsuppressorgenen zu binden und der
Tatsache, dass der Verlust von MBD2 in APCMin/+-Mäusen die Tumorigenese stark
vermindert, wird MBD2 als interessanter potentieller Angriffspunkt für die Etablierung neuer
Therapiestrategien zur Behandlung von Krebserkrankungen angesehen.
Zusätzlich wurde die Interaktion von rekombinant hergestelltem MBD2b und DNA mit einem
EMSA analysiert. Mit Hilfe des EMSAs konnte eine methylierungsabhängige Bindung des
gereinigten MBD2s an DNA-Oligonucleotide nachgewiesen werden. Außerdem wurden
Substanzen hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Interaktion von MBD2b mit methylierter DNA zu vielversprechender Angriffspunkt diskutiert. Therapeutisch interessant wären Substanzen,
die die Interaktion von MBD2 mit der methylierten DNA oder dem rekrutierten
Transkriptionsrepressorkomplex hemmen. Mittels eines weiteren HTS (High Troughput
Screen), bei dem eine andere Substanzbibliothek getestet wird, könnten solche Substanzen
identifiziert werden. Diese könnten dann biochemisch, zellbiologisch und in vivo analysiert
werden.
Für MBD2 sind bisher keine Strukturinformationen verfügbar. Diese würden jedoch helfen,
die Interaktion von MBD2 mit der DNA und dem Transkriptionsrepressorkomplex genau zu
verstehen. Mit Hilfe dieser Informationen wäre es möglich Moleküle zu modellieren, die die
Interaktion spezifisch stören.
MBD2 stellt ferner ein in vitro Substrat von HtrA1 dar. In der Vergangenheit wurde außerdem
gezeigt, dass HtrA1 zum Teil im Zellkern lokalisiert ist (Clawson et al. 2008). Da MBD2
ebenfalls innerhalb des Zellkerns vorliegt, könnte es demnach potentiell in vivo von HtrA1
proteolysiert werden. Diese Fragestellung sollte in Zukunft genauer untersucht werden, um
eine potentielle Bedeutung von HtrA1 für die Regulation der MBD2-Homöostase zu klären.
Eine solche Funktion hätte dramatische Folgen für die Tumorprogression in Zellen, in denen
die HtrA1-Expression abgeschaltet ist. Nach Verlust von HtrA1 würde MBD2 nicht mehr
proteolysiert werden. Dementsprechend würde die Konzentration von MBD2 in der Zelle
stark ansteigen und es könnte häufiger an die methylierten Promotoren von
Tumorsuppressorgenen, u.a. von HtrA1, binden und deren Expression inhibieren. Diese
Kaskade würde die Tumorprogression erheblich fördern. Aus diesem Grund ist es von
großer Bedeutung diese potentielle Funktion von HtrA1 in Zukunft näher zu analysieren
- …
