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Caracterización del rol de C3 y C1q en la internalización de esporas de Clostridium difficile en células de epitelio intestinal
No full textTesis (Doctor en Biociencias Moleculares)Este trabajo fue financiado por los siguientes fondos: Fondecyt Regular Folio: 1151025 y 11105069 Beca de Doctorado Nacional Conicyt Folio: 21130830Clostridium difficile es una bacteria Gram-positiva, patógena intestinal, causante de episodios recurrentes de diarrea, disrupción de la barrera epitelial y formación de pseudo membrana. El sistema del complemento actúa como barrera temprana del sistema inmune que modula tanto inmunidad innata como adaptativa. La relación de C. difficile con el complemento no ha sido estudiada, pero se ha reportado quela expresión de C3en el intestino se incrementa hasta 6 veces en respuesta a las toxinas de C. difficile sugiriendo un potencial rol en la patogénesis. Esta tesis se focalizó en estudiar la espora de C. difficiley el sistema del complemento ya que ha sido previamente reportado que BclA una proteína ortóloga encontrada en esporas de Bacillus anthracis captura moléculas del complemento para promover internalización en células del hospedero. En este estudio se encontró queC3y C1qse unena las esporas de C. difficile y además las esporas de la cepa R20291 activan C3 lo que promueve su unión a las esporas in vitro. La proteína tipo colágeno BclA3 participa en la unión de C3 y C1q a las esporas de la cepa hiper virulenta R20291 in vitro. En la cepa 630∆ermBclA1, BclA2 y BclA3 participan de la unión de C1q a las esporas in vitro. Ensayos de infección realizados con esporas incubadas en sueros de pletados de C1q y C3 mostraron que la internalización de esporas en células epiteliales intestinales Caco-2 disminuye respecto a la condición con suero humano normal (SHN). Al reconstituir estas moléculas la internalización de las esporas se restableció a niveles similares a la condición con SHN sugiriendo un posible mecanismo de internalización de esporas de C. difficile mediado por las moléculas delcomplementoC1q y C3que deberá ser explorado más en profundidad en futuros estudios.Clostridium difficileis a Gram-positive bacterium, intestinal pathogen, causing of recurrent episodes of diarrhea, the disruption of the epithelial barrier andtheformation of pseudomembrane. The complement system acts as an early barrierofthe immune system that modulates both innate and adaptive immunity. The relationship of C. difficileto complement has not been studied, but it has been reported that C3 expression in the gut increases up to 6 times in response to C. difficiletoxins suggesting a potential role in pathogenesis. This thesisfocused on studying the C. difficilespore and complement system as it has beenpreviouslyreported thatBclA an orthologue protein founded inBacillus anthracisspores capture complement molecules to promote internalization in host cells. In this study it was found that C3 and C1q bind to C. difficilespores in additionthe spores of R20291 strain activated C3 that could promote the binding of C3 to the spores in vitro.The collagen-like protein BclA3 is involved in the binding of C3 and C1q in the hypervirulent strainR20291in vitro.In the 630∆ermstrain BclA1, BclA2 and BclA3 are involved in the binding of C1q to the sporesbut remains unclear in the case of C3. Infection assays performed with sporesincubatedin C3 and C1qdepleted sera showed that the internalization of spores in theintestinal epithelial cellsCaco-2drops with respect to the condition with normal human serum (SHN). By reconstituting these molecules,the internalization of the spores was restored to similar observed inthe condition with SHN. These data suggest a mechanism ofinternalization ofC. difficilesporesmediated by the complement proteins C3 y C1qthat should be explored further in future studies
Sporulation dynamics, germination and protein composition
No full textTesis (Doctor en Biociencias Moleculares)The intestinal microbiota community has a wide diversity of commensal bacteria, whose 50-60% of the bacterial genus contain spore-forming species. Ruminococcus spp., is one of the most abundant species in the human gut-microbiota. It makes to Ruminococcuscrucial for the degradation and fermentation of polysaccharides like cellobiose and starch. Currently, most of Ruminococcusstudies have focus on thesedegradation processes; however, still exist a deep unknowing on this bacteria’s transmission mechanism on humans. Despite that the literature reveals that Ruminococcuscan develop spores, the sporulation process and its properties have not been characterized yet; therefore, this research address the Ruminococcussp.DSM 102803 sporulation process, analyzing its sporulation-dynamic, morphotypes, stability, spores’ germination and ultra-structure protein composition.Results showed a late initiation of Ruminococcusspores compared to Bacillusand Clostridium with presence of four different Ruminococcusmorphotypes during the process: i) phase-dark structure (vegetative cells), ii) division cell, iii) phase-gray structure (intermediary), and iv) phase-bright structure (spore). According to TEM observations, phase-bright structure presents an ultra-structure different than canonical spores; however, it was not possible to see the exosporium, coat, and cortex. Additionally, results indicated that phase-bright structures are structurally stable to lysozyme, ethanol, and heat. At the same time, results reveled that phase-bright structure R.sp.DSM 102803 only are able of initiates germination in presences of sodium taurocholate, some amino acids, and salts; however, these componentsare not sufficient to carry out the process in a canonical way as in other spore-forming species. Finally, the protein analysis concluded that only Spo0J, McsA, Jag, dapG, SpoVS, SpoVK, SpoVAD, SpoVD, and alr2 proteins are specific to one sporulation stage, while no proteins participate on the germination process. These results conclude that the bright phase structures formed by R.sp.DSM 102803 are similar to spores of other spore-forming species. However, the sporulation and germination process must be characterized in greater depth in order to understand the genes and different processes that are involved in germination and sporulation.La microbiota intestinal tiene una amplia diversidad de bacterias comensales, de la cualel 50-60% de los génerosbacterianoscontiene especies formadoras de esporas. Ruminococcus sp., es una de las especies más abundantes en la microbiota intestinal humana. Ruminococcuses crucial para la degradación y fermentación de polisacáridos como celobiosa y almidón. Actualmente, la mayoría de los estudios de Ruminococcusse enfocan en estos procesos de degradación; sin embargo, todavía existe un profundo desconocimiento sobre el mecanismo de transmisión de esta bacteria en humanos. A pesar de que la literatura revela que Ruminococcuspuede desarrollar esporas, el proceso de esporulación y sus propiedades aún no se han caracterizado; por lo tanto, esta investigación aborda el proceso de esporulación de RuminococcusDSM 102803, analizando la dinámica de esporulación, morfotipos, estabilidad, germinación de esporas y composición de proteínas.Los resultados mostraron un inicio tardíode las esporas de R. sp. DSM102803 en comparación con Bacillusy Clostridiumcon presencia de cuatro morfotipos diferentes de Ruminococcusdurante el proceso: i) estructura de fase oscura (células vegetativas), ii) célula en división, iii) estructura de fase gris (intermediario), y iv) estructura de fase brillante (espora). Según las observaciones de TEM, la estructura de fase brillante presenta una ultraestructura diferente a las esporas canónicas; ya que, no fue posible ver el exosporium,cubieray corteza. Además, los resultados indicaron que las estructuras de fase brillante son estructuralmente estables a lisozima, etanol y calor. Al mismo tiempo, los resultados revelaron que la estructura de fase brillante de R.sp.DSM 102803 solo puede iniciar la germinación en presencia de taurocolato de sodio, algunos aminoácidos y sales; sin embargo, estos componentes no son suficientes para llevar a cabo el proceso de manera canónica como en otras especies formadoras de esporas. Finalmente, el análisis de proteínas concluyó que solo las proteínas Spo0J, McsA, Jag, dapG, SpoVS, SpoVK, SpoVAD, SpoVD y alr2 son específicas de esporulación, mientras queno se encontró ninguna proteína que participe en el proceso de germinación.Estos resultados concluyen que las estructuras de fase brillante formadas por R.sp.DSM 102803 son similares a las esporas de otras especies formadoras de esporas. Sin embargo, el proceso de esporulación y germinación debe caracterizarse con mayor profundidad para comprender los genes y los diferentes procesos que intervienen en la germinación y esporulación
Role of Clostridioides difficile spore surface proteins and toxins in spore interaction with the intestinal mucosa and recurrence of the disease
No full textTesis (Doctor en Biotecnología)Recurrence of Clostridioides diffici/e infections (R-CDI) occurs in ~20% of
successfully treated patients, representing a major clinical challenge due to the
increasing severity and mortality rates after subsequent R-CDI episodes. C. difficile
infection (CDI) is considered a nosocomial infection. Antibiotics use is the main risk
factor. C. difficile produces spores that are crucial for transmission and R-CDI, and toxins
that generate the clinical symptoms. Understanding the molecular and cellular
mechanisms used by C. diffici/e spores to cause R-CDI is critica! to the design of
therapies. We recently showed that C. difficile spores internalize into intestinal epithelial
cells in the presence of fibronectin (Fn) and vitronectin (Vn). Besides, administration of
drugs that inhibit spore entry in vitro to an R-CDI animal model showed to reduce the
R-CDI rates.
This work aimed to identify C. difficile spore exosporium proteins involved in the
spore interaction with the intestinal mucosa and evaluate its role in R-CDI, also identify
the role of C. difficile toxins TcdA and TcdB in the spore interaction with intestinal
epithelial cells in vitro and in vivo and to test the use of FDA-approved drugs in the
inhibition of spore interaction with the intestinal mucosa. We used confocal image
analysis of intestinal mucosa using a ligated ileal/colonic loop mouse model to
accomplish this aim. We showed that the insertional mutants of C. difficile spores for
morphogenic spore factors CdeC (cdeC) and perhaps CdeM (cdeM) exhibited reduced
adherence to the intestinal mucosa. Afterward, using animal models of R-CDI, we
observed that cdeC but not cdeM mutant spores shown an increased severity during R CDI. Using the intestinal ligated loop model, we observed that bc/A3 isogenic mutant
exhibited a reduced adherence in the intestinal mucosa. Also, by confocal microscopy,
we showed that C. diffici/e toxins TcdA and TcdB produce a rearrangement of the ileum
mucosa, increasing the luminal accessibility of the proteins required for the entry of C.
difficile spores, such as Fn, Vn, and the integrins as and av. Besides, TcdA and TcdB
increase the secretion of Fn and Vn, that bind to C. diffici/e spores. These toxins also
contribute to spore adherence and internalization to intestinal epithelial cells. On the
other hand, we observed that TcdB alone produces a rearrangement of the ileum
mucosa that affects the accessibility of Fn and Vn and favors spore interaction with the
intestinal mucosa. However, blocking TcdB with bezlotoxumab tends to decrease the
spore adherence in the ileum mucosa.
Finally, we tested the therapeutic potential of the FDA-approved nonsteroidal
anti-inflammatory drug, indomethacin in a R-CDI animal model. Unexpectedly, we
observed that indomethacin increases CDI severity. Also, we tested the FDA-approved
antifungal nystatin and we observed that tends to reduce the spore interaction with the
intestinal mucosa.
These findings give additional knowledge for the design of novel therapies that
consider the importance of the spore interaction with the intestinal mucosa during C.
diffici/e infection treatment. Our results provide new insight for nystatin as an inhibitor
of spore interaction with the intestinal mucosa with potential to reduce the R-CDI rates.Las infecciones recurrentes por Clostridioides difficile (R-CDI) ocurren en ~20%
de los pacientes tratados con éxito lo cual representa un desafío clínico importante
debido al aumento en las tasas de severidad y mortalidad en episodios subsecuentes de
R-CDI. La infección por C. dífficile (CDI) es considerada una enfermedad nosocomial. El
uso de antibióticos es el principal factor de riesgo. C. diffici/e produce esporas que son
cruciales para la transmisión y la R-CDI, y produce toxinas, que generan los síntomas
clínicos. Por lo cual, comprender los mecanismos moleculares que utilizan las esporas
de C. difficí/e para causar una R-CDI es clave para el diseño de terapias. Recientemente
demostramos que las esporas de C. difficile son capaces de entrar en las células
epiteliales intestinales en presencia de fibronectina (Fn) y vitronectina (Vn). Además,
que la administración de medicamentos que inhiben la entrada de esporas in vitro, en
modelo animal de R-CDI mostró que su administración reduce las tasas de R-CDI .
El objetivo de este trabajo fue identificar proteínas del exosporium de la espora
de C. diffici!e involucradas en la interacción con la mucosa intestinal y evaluar su rol en
la R-CDI, también identificar el papel de las toxinas de C. difficile TcdA and TcdB en la
interacción de las esporas con células epiteliales intestinales in vitro e in vivo y evaluar
el uso de medicamentos aprobados por la FDA en la inhibición de la interacción de las
esporas con la mucosa intestinal. Para lograr este objetivo, realizamos análisis de
imágenes de microscopía confocal de la mucosa intestinal utilizando un modelo de asa
ligada de íleo y colon en ratones. Observamos que mutantes de inserción de C. diffíci/e
para los factores morfogénicos de las esporas CdeC ( CdeC) y tal vez CdeM (CdeM)
presentaron una adherencia reducida en la mucosa intestinal. Posteriormente con el uso
de modelos animales de R-CDI, observamos que las esporas mutantes de cdeC pero no
de cdeM mostraron una mayor severidad durante la R-CDI. Usando modelo de asa ligada
intestinal, observamos que el mutante isogénico bc/A3 exhibió una adherencia reducida
en la mucosa intestinal. Además, mediante microscopía confocal, mostramos que las
toxinas de C. diffici/e TcdA y TcdB producen un reordenamiento de la mucosa del íleo.
Este reordenamiento aumenta la accesibilidad luminal de las proteínas necesarias para
la entrada de las esporas de C. diffícile tales como Fn, Vn y las integrinas as y av.
También las toxinas TcdA y TcdB aumenta la secreción de Fn y Vn, que se unen a las
esporas de C. diffici/e. Estas toxinas también contribuyen con la adherencia y entrada
de las esporas a células epiteliales intestinales. Por otro lado, observamos que TcdB por si sola produce un reordenamiento de la mucosa del íleo que afecta la accesibilidad de
Fn y Vn y favorece la interacción con la mucosa intestinal. Sin embargo, el bloqueo de
TcdB con bezlotoxumab tiende a reducir la adherencia de las esporas en la mucosa del
íleo.
Finalmente probamos el potencial terapéutico de indometacina, un
antinflamatorio no esteroideo aprobado por la FDA, en un modelo de R-CDI. De forma
inesperada observamos que en modelos animales la indometacina aumenta la gravedad
de la CDI. Además, probamos el antifúngico aprobado por la FDA, nistatina y
observamos que tiende a reducir la interacción de la espora en la mucosa intestinal.
Estos hallazgos otorgan conocimiento adicional para el diseño de terapias
novedosas que consideran la importancia de la interacción de las esporas con la mucosa
intestintal durante el tratamiento de la infección por C. díffící/e. Nuestros resultados
entregan una nueva perspectiva sobre el uso de la nistatina como inhibidor de la
interacción con la mucosa intestinal con potencial para reducir las tasas de R-CDI
Identificación de factores involucrados en la adherencia de esporas de Clostridium difficile a células epiteliales in vitro
No full textTesis (Bioquímico, Magíster en Bioquímica)Esta Tesis se realizó en el Laboratorio de Mecanismos de Patogénesis Bacteriana de la
Facultada de Ciencias Biológicas de la Universidad Andrés Bello y fue financiada por el
proyecto FONDECYT N°1110569. Titulado "Adherence of Clostridium djfJIcile spores to the
intestinal mucosa".Clostridium difficile es una bacteria Gram positivo vinculada a varias infecciones
intrahospitalarias. Estas infecciones asociadas a C. difficile (IACD) pueden generar tanto
diarreas leves así como, colitis pseudomembranosa. C difffcile es capaz de esporular,
siendo su espora el morfotipo de transmisión, infección y persistencia. La aparición de una
cepa hipervirulenta capaz de sintetizar 10 veces más toxinas y genera mayor prevalencia
provocó en el 2012 un aumento en las IACD de un 717 % en nuestro país.
La espora es esencial para el ciclo infectivo, adhiriéndose al epitelio del intestino
grueso. Se ha reportado que, transcurrido una hora de infección el 60 % de las esporas
permanecen adheridas a las células epiteliales in vitro. Por otro lado, se tiene conocimiento
que la célula vegetativa de C. difficile se adhiere a células epiteliales Caco-2 y a la vez
interacciona con proteínas de la matriz extracelular, así como con mucina. Esto se debe a
que las células vegetativas secretan toxinas, tales como TcdA y TcdB, las que generan daño
en este mismo tejido. TcdA y TcdB interrumpen las uniones estrechas, provocando la
polarización, dando como resultado una posible apoptosis celular. Durante su ciclo
infectivo C. difficile genera daño del tejido epitelial permitiendo la infiltración de esporas y
células vegetativas. No obstante lo descrito anteriormente, no se tiene mayores
conocimientos sobre los procesos de infección, adhesión y persistencia de las esporas. Por
lo tanto, el objetivo de esta tesis fue determinar sí la adherencia a células epiteliales
intestinales está sujeta a factores propios pertenecientes al ambiente intestinal (receptores
celulares, mucina y/o proteínas de la matriz extracelular) o si son propios de la estructura
externa de la espora (exosporium). Nuestros resultados muestran que las esporas son capaces de adherirse a células
epiteliales Caco-2 (diferenciadas 2 y 8 días) y células epiteliales de riñón, alcanzando una
adherencia aproximada de 100 % a las 3 h de incubación. Nuestros resultados, además,
muestran que el SFB, un componente de los medios de cultivo, genera una disminución en
la adherencia. Por último, observamos que, cuando las proteínas superficiales de células
Caco-2 son removidas con un tratamiento suave con tripsina, la unión de la espora
disminuye solamente en células diferenciadas 8 días. Por lo tanto, en este trabajo
mostramos que la adherencia estaría mediada por algunas proteínas de la superficie de las
células y que está regulada por factores estructurales de la espora, ya que experimentos con
esporas deficientes en su exosporium mostraron un aumento de la adherencia de un 20 al 40
%. En conclusión, nuestros resultados revelan que la adherencia de las esporas de C.
diffcile es dependiente tanto de su propia estructura como de los factores presentes en la
mucosa colónica.Clostridium diffcile is a Gram-positive bacterium that is linked to several nosocomial
diseases. Clostridium dffcile infections (CDI) can cause mild diarrhea, which can reach
more serious illnesses such as pseudomembranous colitis. C. difficile is able to sporulate,
and its spore transmission morphotype, and persistent infection. In Chile, studies performed
in 2012 shows clearly an increase in nearly 717% in CDI cases, which are likely to be
associated to the appearance óf a hypervirulent strain.
The spore is essential for the persistence of infection due to its ability to adhere to the
colonic epithelium. Indeed, 60 % of the spores remain attached to epithelial cells in vitro
after 1 hour of infection. The vegetative cell secretes TcdB TcdA toxin. TcdB and TcdB
produce epithelial damage, disruption of tight junctions and apoptosis. Furthermore, the
vegetative cell of C diffcile adhere to epithelial cells Caco-2 and interacts with
extracellular matrix proteins and mucins. During its infectious cycle, C d(fficile produce
damage to the epithelial mucosa, allowing infiltration of spores and vegetative cells.
However, very little is known on the interactions between C. dffcile spores and the host, in
particularly on how the spore adheres and persists in the host. Therefore, the aim of this
thesis was to determine whether adherence to intestinal epithelial cells is mediated by
factors belonging to the colonic environment (cellular receptors, mucin and/or extracellular
matrix proteins) or specific to the external structure of the spore (exosporium).
Our results show that spores are able to adhere to Caco-2 epithelial cells (differentiated
2 to 8 days) and kidney epithelial cell, reaching approximately 100 % at 3 hours of
incubation. The fetal bovine serum, which is a common component of culture media,
produced a decrease in the adhesion. Further, when the surface proteins of Caco-2 cells are
removed with gentle trypsin treatment, spore binding decreases only in differentiated cells
8 days. Therefore, in this study we show that the adhesion would be mediated by some
proteins on the surface of cells and also note that it is regulated by structural factors of the
spores. Notably, experiments with spores with a deficient exosporium showed increased
adhesion 20 to 40 %, suggesting that the exosporium negatively regulates adherence of C.
spores. In conclusion, adherence of C. spores is dependent on both its
structure and the factors present in the colonic mucosa
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Molecular mechanism of germination of Clostridium perfringens spores
Get PDFClostridium perfringens is the causative agent of a wide variety of diseases in animals and humans. C. perfringens can produce more than 15 toxins. However, individual strains produce a subset of these toxins. Although a small percentage of C. perfringens isolates (mostly belonging to type A) produce C. perfringens enterotoxin (CPE), these are very important human gastrointestinal (GI) pathogens, causing C. perfringens type A food poisoning (FP) and nonfood-borne GI diseases (NFBGID). Due to its anaerobic nature and the ability to form extremely resistant spores found ubiquitously in the environment, to cause the wide array of C. perfringens-associated diseases (CPAD), these C. perfringens spores must germinate, release the nascent cell, grow and produce their toxins. Therefore, germination of C. perfringens spores is the initial and perhaps most important step for the progression of diseases in animals and humans. Although extensive research has been conducted on the mechanism of spore germination of Bacillus species, very few studies of spore germination have been conducted in Clostridium species mainly due to the lack of molecular genetic tools. Genomic comparisons reveal significant differences in the backbone of the germination apparatus between Bacillus and Clostridium species. Consequently, a detail understanding of the molecular mechanism of germination of C. perfringens spores is essential for the development of novel preventive strategies for CPAD as well as diseases caused by other pathogenic Clostridium species.
The first focus of this work was to identify and characterize the germinants and the receptors involved in C. perfringens spore germination. Result from these studies found differential germination requirements between spores of FP and NFBGID isolates in that: (i) while a mixture of L-asparagine and KCl was a good germinant for spores of FP and NFBGID isolates, KCl and, to a lesser extent, L-asparagine triggered spore germination in FP isolates only; and ii) L-alanine and L-valine induced significant germination of spores of NFBGID but not FP isolates. In contrast to B. subtilis, C. perfrinegns genomes sequenced to date possess no tricistronic gerA-like operon, but has a monocistronic gerAA that is far from a gerK locus. The gerK locus contains a bicistronic gerKA-gerKC operon and a monocistronic gerKB upstream and in the opposite orientation to gerKA-gerKC. Consequently, through the construction of mutations into strain SM101, a C. perfringens FP isolate, the role of gerAA, gerKA-gerKC and gerKB genes in C. perfringens spore germination were investigated. Results indicated that KCl, L-asparagine and Ca-DPA required GerKA and/or GerKC receptors, while GerAA and GerKB played an auxiliary role in germination. Lack of GerKA and/or GerKC, and GerKB significantly reduced spores colony forming efficiency, indicating a role in spore viability.
The fact that C. perfringens spores lacking the main germinant receptor(s) proteins, GerKA and/or GerKC, are still able to germinate albeit poorly compared to wild-type, and that C. perfringens spores germinate with K+ ions alone, raises the hypothesis that GrmA-like antiporters might also play some role in C. perfringens spore germination. Two putative GrmA-like antiporters (i.e., GerO and GerQ) are encoded in the genome of all C. perfringens sequenced to date. This study shows that gerO and gerQ genes are expressed uniquely during sporulation and the mother cell compartment of the sporulating cell. Complementation studies of K+ uptake and Na+ sensitive E. coli mutants indicate that while GerO is capable of translocating K+ and Na+, GerQ is only capable of translocating, to a small extent, Na+ ions. Spores lacking GerO had defective germination in rich medium, KCl, L-asparagine, and Ca-DPA, but not with dodecylamine, defect that might be prior to DPA release during germination. In contrast, loss of GerQ had a much smaller effect on spore germination. Two adjacent Asp residues, important in ion transcloation of the E. coli Na+/H+ antiporter NhaA were also present in GerO, but not GerQ, and replacement of these residues for Asn reduced the protein’s ability to complement gerO spores. Although results from this study indicate that putative antiporters have some role on C. perfringens spore germination, it is unclear whether their role is direct or during spore formation.
C. perfringens type A FP spores are capable of germinating with K+ ions, an intrinsic mineral of meats commonly associated with FP. Inorganic phosphate (Pi) is also intrinsically found in meat products. Consequently, we hypothesized that FP spores are capable of germinating in presence of Pi. Results from this study show that spores of the majority of FP, but not NFBGID isolates, are able to germinate in presence of Pi. Pi-induced germination of FP spores is primarily through the GerKA and/or GerKC protein, while GerAA and to a much lesser extent, GerKB, play auxiliary roles. The putative Na+/K+-H+ antiporter, GerO, is also required for normal Pi-induced germination. These results suggest that the differential germination phenotypes between spores of FP and NFGID isolates is tightly regulated by their adaptation to different environmental niches.
A second focus of this work was to investigate the mechanism of signal transduction between the germinant receptors and the downstream effectors. In B. subtilis, the SpoVA proteins have been associated with Ca-DPA uptake and subsequent release during sporulation and germination, respectively. In addition, Ca-DPA acts as a signal molecule for cortex hydrolysis during B. subtilis spore germination, activating the cortex lytic enzyme (CLE) CwlJ. Results from this study show that in contrast to B. subtilis spoVA mutants, where spores lyse quickly during purification, C. perfringens spoVA spores were stable and germinated similarly as wild-type spores. These results suggest major differences in the regulation of the germination pathway between C. perfringens and B. subtilis, and suggest that activation of CLEs in C. perfringens might be through a different pathway than the Ca-DPA pathway of B. subtilis.
A third focus of this work was to investigate the in vivo role of the CLE involved in peptidoglycan (PG) spore cortex hydrolysis during C. perfringens spore germination. Two C. perfringens CLEs (i.e., SleC and SleM) degrade PG spore cortex hydrolysis in vitro, however, due to lack of genetic tools, their in vivo role in spore germination remains unclear. Results from this study show that C. perfringens sleC spores released their DPA slower than wild-type and were not able to germinate with nutrients and non-nutrient germinants. In contrast, sleM spores germinated similar as wild type in presence of nutrient and non-nutrient germinants, indicating that while SleC is essential for cortex hydrolysis and viability of C. perfringens spores, SleM although can degrade cortex PG in vitro, is not essential.
A fourth focus of this work was to investigate the in vivo role of the Csp proteases in the initiation of cortex hydrolysis. In vitro work has shown that Csp proteins process the inactive proSleC into the mature enzyme, SleC. However, the in vivo role of the Csp proteins has not been established. In this study, spores a C. perfringens cspB mutant exhibited significantly less viability than wild-type spores, and were unable to germinate with either rich medium or Ca-DPA. Germination of cspB spores was blocked prior to DPA release and cortex hydrolysis. Results from this study indicate that CspB is essential to generate active SleC and allow cortex hydrolysis early in C. perfringens spore germination. In contrast to B. subtilis, Ca-DPA did not activate the CLEs during spore germination present in cspB spores supporting previous results that Ca-DPA acts trough the GerKA and/or GerKC receptor.
A final focus of this work was to develop a strategy to inactivate C. perfringens spores in meat products. C. perfringens spores posses high heat and pressure resistance, however, they loss their resistance properties during early stages of germination. In contrast to B. subtilis spores, germination of C. perfringens spores could not be triggered with low pressures. However, they germinated efficiently when heat activated in presence of L-asparagine and KCl at temperatures lethal for vegetative cells, and these germinated spores were efficiently inactivated by subsequent treatment with pressure assisted thermal processing (586 MPa at 73ºC for 10 min). This study shows the feasibility of a novel strategy to inactivate C. perfringens spores in meat products formulated with germinants.
Collectively, the present study contributes to the understanding of the mechanism of spore germination in the pathogenic bacterium C. perfringens, and developed an alternative and novel strategy to inactivate C. perfringens spores in meat products
Caracterización de la formación y germinación de las esporas de Turicibacter sanguinis K031
No full textTesis (Magíster en Biotecnología y Ciencias de la Vida)El estudio de la microbiota intestinal ha revelado en el último tiempo que un gran número
de complicaciones en la salud humana se deben a desbalances en ésta. El balance entre los
microrganismos presentes en la microbiota y el hospedero ha sido reconocido como un elemento
esencial de los seres vivos, ya que cumple funciones que el hospedero no puede realizar, tales
como: metabolismo de algunos nutrientes, síntesis de algunas vitaminas y modulación específica
del sistema inmune.
La microbiota intestinal se compone principalmente de bacterias, donde la mayor parte de
estas son bacterias anaeróbicas. Aun cuando se ha visto que la microbiota intestinal es de gran
importancia para los hospederos, mucho se desconoce de ésta, desde cómo es la interacción entre
las bacterias intestinales hasta cómo estas transitan entre los distintos hospederos. Respecto a lo
último una de las hipótesis más aceptadas es que las bacterias de la microbiota intestinal utilizan
un mecanismo de supervivencia conocido como esporulación, donde éstas forman una estructura
resistente a condiciones adversas (espora bacteriana), que les permiten sobrevivir al ambiente
exterior del intestino permitiendo así la colonizando de nuevos hospederos.
Estudios recientes han revelado que aproximadamente un 30% de las bacterias de la
microbiota intestinal poseen genes relacionados con el mecanismo de esporulación y en algunos
casos se han podido identificar mediante microscopía estructuras que se han sugerido como
posibles esporas bacterianas. A pesar de estos resultados, se desconoce si es que el mecanismo de
esporulación presentado por estas bacterias de la microbiota es similar al mecanismo conocido hoy
en día o si este deriva de los cánones establecidos. Una de estas bacterias es Turicibacter sanguinis,
la cual es una bacteria poco conocida donde se identificó una estructura tipo espora que no se
encuentra caracterizada. Por lo que se levanta la pregunta: ¿Es realmente la estructura encontrada en T. sanguinis una espora bacteriana similar a las formadas mediante el proceso de esporulación
canónico?
Para responder a esta pregunta se obtuvo, a partir de una nueva cepa aislada (T. sanguinis
K031), estas estructuras descritas y se caracterizó sus cualidades fenotípicas básicas, su estructura
y cómo es el proceso de formación de estas presuntas esporas bacterianas presentes en T. sanguinis
K031. Además, se evaluó si en contacto con los medios de cultivo YCFA, BHIS y 70:30, las
estructuras tenían la capacidad de poder revertir su morfotipo a una célula vegetativa y cómo era
su comportamiento de germinación dentro del proceso. Los resultados de este trabajo sugieren
fuertemente que la estructura encontrada para T. sanguinis K031 si es una espora bacteriana similar
a las ya caracterizadas con cualidades, tanto fisiológicas como estructurales, que se presentan en
esporas bacterianas canónicas.In recent years research about the intestinal microbiota has revealed that many complications
in human health are caused by imbalances within it. The balance between the microorganisms
present in the human gut and the host has been recognized as an essential element of living beings,
since it fulfills functions that the host cannot perform, such as: metabolism of some nutrients,
synthesis of some vitamins and specific modulation of the immune system.
The intestinal microbiota is composed mainly of bacteria, where most of these are anaerobic
bacteria. Although it has been seen that the intestinal microbiota is of great importance for the
hosts, much is unknown about it, from how is the interaction between intestinal bacteria to how
these bacteria transmit between different hosts. Regarding the latter, one of the most accepted
hypotheses is that the intestinal microbiota bacteria use a survival mechanism known as
sporulation, where a structure resistant to adverse conditions (bacterial spore) is formed, which allows them to survive the external environment of the intestine, thus allowing the colonization of
new hosts.
Recent studies revealed that approximately 30% of the bacteria of the intestinal microbiota
possess genes related to the canonical sporulation mechanism and, in some cases, it has been
possible to identify by microscopy structures that have been suggested as possible bacterial spores.
Despite these results, it is not known if the sporulation mechanism presented by these microbiota
bacteria is similar to the mechanism known today or if it deviates from established canons. One of
these bacteria is Turicibacter sanguinis, which is a seemingly unknown bacterium where a spore
type structure was identified that is not characterized. So, the question arises: Is the structure found
in T. sanguinis really a bacterial spore similar to those formed by the process of canonical
sporulation?
To answer this question, we obtained, from a new isolated strain (T. sanguinis K031), these
described structures and characterized their basic phenotypic qualities, their structure and how the
process of formation of these presumed bacterial spores present in T. sanguinis K031 is. In addition,
it was evaluated if in contact with the culture media YCFA, BHIS and 70:30, the structures had the
capacity to revert their morphotype to a vegetative cell and how their germination behavior was
within the process. The results of this work strongly suggest that the structure found for T. sanguinis
K031 is a bacterial spore similar to those already characterized with qualities, both physiological
and structural, that are presented in canonical bacterial spores
Desarrollo de un tratamiento para episodios de segundas recurrencias de la infección causada por Clostridioides difficile en modelo murino
No full textTesis (Magíster en Biotecnología y Ciencias de la Vida)Esta Tesis se realizó en el espacio del grupo Microbiota-Host Interactions and Clostridia Research
Group, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Nacional Andrés Bello, y fue financiada por el
Fondo de Fomento al Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDEF ID|10038).Clostridioides difficile, es un bacilo Gram-positivo, anaerobio estricto y formador de endosporas
causante de la infección por C. difficile (ICD). En la actualidad, el tratamiento de elección es la
monoterapia con vancomicina o metronidazol, sin ser efectivo en todos los pacientes, ya que un 25 %
puede presentar nuevamente los síntomas de la infección o recurrencia por C. difficile (ICD-R). A
pesar de la aparición de nuevas terapias dirigidas a la ICD, estos tratamientos no consideran los
mecanismos utilizados por las esporas para persistir en el epitelio intestinal. Debido a esto, en nuestro
laboratorio se caracterizó que las recurrencias se deben a la capacidad de adhesión e internalización
de las esporas en las células y que dicha internalización puede inhibirse con el uso de nistatina. En
este sentido, se generó una formulación farmacológica, con distintos mecanismos de acción el cual
mostró efectividad en un primer episodio de ICD-R, compuesto por nistatina (inhibidor de la
endocitosis mediada por caveolina), taurocolato (germinador de la espora de C. difficile a célula
vegetativa), vancomicina y ramoplanina (antibióticos). Basándonos en estos antecedentes, nos
propusimos evaluar al formulado farmacológico en la germinación de esporas de C. difficile y su
efecto como tratamiento de un segundo episodio de recurrencia (2º ICD-R) en modelo murino. En una
primera instancia, evaluamos el formulado farmacológico in vitro, sugiriendo nuestros resultados, que
la presencia de taurocolato, vancomicina y ramoplanina, no afectan ni positiva ni negativamente la
germinación de las esporas. En una segunda instancia, caracterizamos el efecto del formulado
farmacológico y su contribución en la reducción de los signos de una segunda recurrencia por C.
difficile, generado por monoterapia con vancomicina. Para esto, evaluamos el formulado
farmacológico en un modelo murino, partiendo de un número de 30 animales, de los cuales solo 15
cumplieron con los criterios de inclusión, esto puede explicarse por lo detallado por Chen et al, 2008,
en donde se indica que a pesar de una exposición repetida a la infección, los animales pueden no
desarrollar enfermedades recurrentes, sugiriendo que esto puede deberde a la adquisición de
inmunidad, como se ha observado en seres humanos. Al evaluar la pérdida de peso en los animales, como resultado, observamos una significativa pérdida
de peso durante la ICD e ICD-R. No obstante, aunque durante la 2º ICD-R ambos grupos de animales,
tratados con vancomicina como control o tratados con el formulado farmacológico, no presentaron
pérdida de peso, si presentaron otros síntomas referentes a la infección por C. difficile, como la diarrea,
presencia de esporas en deposiciones y citotoxicidad en cultivo celular.
Durante el inicio de la segunda recurrencia los síntomas fueron más leves en los animales tratados con
el formulado farmacológico, respecto al control con vancomicina . Además, se detectó que un 100 %
de los animales tratados con vancomicina presentaron diarrea (n=7/7), respecto a un 62 % de los
animales tratados con el formulado farmacológico (n=5/8). Al evaluar la persistencia de las esporas
en tejido colónico, los animales tratados con vancomicina presentaron cargas cercanas al límite de
detección, siendo significativo en el colon medio, respecto a los tratados con el formulado
farmacológico. No obstante, ambos grupos de animales presentaron citotoxicidad en el contenido
cecal, característico de la cepa ribotipo 027. En conclusión, aunque son necesarias mayores
evaluaciones, este trabajo nos permite sugerir que la administración de una terapia que combina
diferentes mecanismos de acción, podría utilizarse como tratamiento alternativo a las monoterapias
actuales, para tratar episodios de recurrencia por infección con cepas hipervirulentas de C. difficile
Localización y caracterización de proteínas en esporas de Clostridium difficile
No full textTesis (Bioquímico, Magíster en Bioquímica)Esta Tesis se realizó en el Laboratorio Gut Microbiota and Gastrointestinal Pathologies
Research Group de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Andrés Bello y
fue financiada por el proyecto FONDECYT N°1110569 "Adherence of C. docile spores
to the intestinal mucosa".Clostridium dtfflcile es un importante patógeno nosocomial que ha llegado a ser la mayor
causa de diarrea asociada a antibióticos. Las esporas de C dfflcile son esenciales para la
patogénesis, infección y persistencia de esta enfermedad. El exosporium es la capa más
externa de las esporas de C. djfflcile, y juega un rol en la interacción temprana entre la
espora y el hospedero como lo es la adherencia a células epiteliales del intestino. Se ha
identificado una proteína rica en cisteinas (CdeC), la cual es un factor morfogenético del
exosporium requerida para su correcto ensamblaje. En este estudio, usando fusiones
traduccionales en proteínas del exosporium, hemos demostrado que las proteínas del
exosporium BelAl, BclA2, BclA3, CdeA, CdeB, CdeM y el factor morfogenético CdeC
están únicamente localizadas en el exosporium de esporas de C. dfficile.
Sorprendentemente, cerca del 20% y 30% de los niveles totales de las proteínas
previamente descritas en la superficie de las esporas (CotA y CotB respectivamente), están
localizadas en el exospouuuu y la mayoría está localizada en la cubierta. CdeC está
involucrado en la formación del complejo de alto peso molecular (> 110 kDa) de BclAl y
BclA3, y también en el complejo de bajo peso molecular (<20 kDa) de CdeA. En la
ausencia de CdeC, las proteínas BclAs están presenten como especies de 48,3 kDa. Este
factor también juega un rol en la localización en el exosporium de la proteína CotB, pero
no de COLA y CdeB. Sorpresivamente, en ausencia de CdeC, se observó mayor cantidad de
proteínas CdeA, CdeM, BclAl y Bc1A2 en las esporas de C. dfficile. Conjuntamente, este
trabajo proporciona una primera aproximación del mecanismo asociado al ensamblaje del
exosporium de esporas de C. djfficile.Clostridium docile is an important nosocomial pathogen that has become a major cause
of antibiotic-associated diarrhea. C. docile spores are essential for C. difficile
pathogenesis, infection and persistence of the disease. The exosporium is the outermost
layer of C. docile spores plays roles in early host-spore interactions such as spore
adherence to intestinal epithelium cells. We have identified a cysteine rich exosporium
morphogenetic factor required for correct exosporium assembly. In this study, by using
translational fusions of exosporium proteins, we first demonstrate that the exosporium
proteins Bc1A1, Bc1A2, BclA3, CdeA and CdeB and the exosporium morphogenetic
factors CdeC and CdeM are uniquely localised, in the exosporium layer of C. docile
spores. Strikingly, nearly 20 and 30% of total levels of previously described spore surface
proteins CotA and CotB, respectively, were localized in the exosporium layer and the
majority was coat-located. CdeC is involved in formation of high molecular mass complex
(>120 kDa) of BclAl and BclA3, also is involved in formation of low molecular mass
complex (<20 kDa) In absence of CdeC, Bc1As proteins are present as 48,3 kDa species.
CdeC also plays a role exosporium localization of CotB, but not CotA and CdeB.
Surprisingly, increased amount is observed for CdeA, CdeM, BclAI and BclA2 in absence
of CdeC. Collectively, this work provides for the first approach of the mechanisms
associated in the assembly of the exosporium layer of C. docile spores
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
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