1,720,982 research outputs found
Identificação e caracterização dos mecanismos de resistência ao antimônio em isolados clínicos de Leishmania braziliensis obtidos de lesões atípicas
No full textAs leishmanioses cutâneas (LC) e mucocutâneas (LM) são causadas por várias espécies de Leishmania sendo a mais importante no Brasil a L. braziliensis. Um aspecto importante da LC causada por essa espécie é a ocorrência de lesões atípicas não-ulceradas que podem não responder ao tratamento com antimônio (Sb). Deste modo, o principal objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a susceptibilidade de L. braziliensis obtidas de pacientes com lesões típicas e atípicas aos agentes antileishmania utilizados na prática clínica – anfotericina B (AmB), miltefosina (MIL) e glucantime (GLU). Todos os isolados foram sensíveis à AmB e MIL, sendo que este último, apesar de eficaz, apresenta baixa correlação entre a taxa de infecção e o número de amastigotas/macrófago. Apenas os isolados de L. braziliensis provenientes de lesões atípicas (316, 330 e 340) foram resistentes ao Sb (SbR) e apresentaram menor infectividade em macrófagos THP-1. A resistência ao Sb foi atribuída à redução de incorporação do fármaco, como revelado pelo ensaio de quantificação de Sb intracelular utilizando absorção atômica, associada ao aumento de transcritos dos genes ARM56 e ARM58. A diminuição nos níveis de mRNA de AQP1 corroborram os achados funcionais de redução do acúmulo de Sb em parasitos SbR. O sequenciamento do gene que codifica para AQP1 revelou a presença de polimorfismos exclusivos tanto em cepas isoladas de lesões típicas como atípicas, apesar dessas mutações serem silenciosas. Não houve diferença entre os isolados clínicos de L. braziliensis frente ao choque hiposmótico. Leishmania braziliensis isolada de lesões típicas e sensíveis ao Sb apresentaram níveis de transcritos que codificam para gama-glutamil cisteína sintase e do transportador ABCI4, ambos alvos associados ao metabolismo de Sb. A incorporação diferencial de Sb em isolados clínicos de L. braziliensis nos levou a testar o papel de glicoconjugados da superfície dos parasitos na entrada de Sb. Para isso, o isolado 346 – que apresentou maior acúmulo de Sb – foi incubado na presença do anticorpo CA7AE, cuja função de aglutinação de glicoconjugados parece favorecer a entrada de Sb e pode ser utilizado como ferramenta para melhor compreender a dinâmica de transporte do Sb. Estes dados destacam a importância de se caracterizar molecular e funcionalmente isolados clínicos de Leishmania spp. com o intuito de identificar previamente a resistência a fármacos e guiar a escolha do melhor tratamento. A identificação concomintante de diferentes marcadores pode ser utilizada com estratégia para desenvolver uma ferramenta/kit preditivo voltado para a vigilância e controle das leishmanioses.Fundação Oswaldo CruzCutaneous (LC) and mucocutaneous (LM) leishmaniasis are caused by several species of Leishmania and the most important species in Brazil is L. braziliensis. An important aspect of LC caused by this species is the occurrence of non-ulcerated atypical lesions that may not respond to antimony (Sb) treatment. Thus, our main goal was to evaluate in vitro susceptibility of L. braziliensis obtained from patients with typical and atypical lesions to the antileishmania agents used in clinical practice - amphotericin B (AmB), miltefosine (MIL) and glucantime (GLU). All isolates were sensitive to AmB and MIL, and the latter, although effective, showed a lower correlation between infection rate and number of amastigotes/macrophage. Only L. braziliensis from atypical lesions (316, 330 and 340) were resistant to Sb (SbR) and showed lower infectivity in THP-1 macrophages. Resistance to Sb was attributed to the reduction of drug incorporation, as revealed by the intracellular Sb quantification assay using atomic absorption, associated with increase of transcripts from ARM56 and ARM58 genes. The decrease in AQP1 mRNA levels corroborates the functional findings of reduction of Sb accumulation in SbR parasites. Sequencing of the gene encoding AQP1 revealed the presence of a unique genetic profile both in strains isolated from typical and atypical lesions, although such mutations were silent. There was no difference in the behavior of L. braziliensis clinical isolates to hyposmotic shock. Leishmania braziliensis isolated from typical lesions and sensitive to Sb presented levels of transcripts coding for gamma-glutamyl cysteine synthase and ABCI4 carrier, both targets associated with Sb metabolism. The differential Sb incorporation in L. braziliensis clinical isolates led us to test the role of glycoconjugates of the parasites at the entrance of Sb. For this, isolate 346 - which had the highest accumulation of Sb - was incubated in the presence of the CA7AE antibody, whose function of glycoconjugates agglutination seems to favor the Sb uptake and can be used as a tool to better understand the transport dynamics of Sb. These data highlight the importance of molecularly and functionally characterizing clinical isolates of Leishmania spp. in order to identify drug resistance and guide the choice of the best treatment. The concomitant identification of different markers can be used as strategy to develop a predictive tool / kit for surveillance and control of leishmaniasis
Obtenção e caracter ização de uma cepa atenuada de Leishmania Infantum mediante deleção do gene Kharon1
No full textCNPqCAPESFAPEMIGISID.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.Apesar
da vacinação ser
considerada a melhor estratégia para prevenir a
infecção por
Leishmania
, não existe até
o momento nenhuma vacina segura e
eficaz para uso humano disponível.
As
vacinas atenuadas, consideradas
padrão
-
ouro para proteção con
tra patógenos intracelulares, tê
m sido
largamente estudadas como estratégia de imunização contra as leishmanioses.
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orma, c
om o objetivo de obter uma cepa atenuada de
Leishmania
, foi
realizado o nocaute
do gene
Kharon1
(
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)
em
L. infantum
,
o qual foi
descrito
como sendo essencial para citocinese das formas amastigotas de
L. mexicana
.
Os mutantes
LiKh1
-
/
-
foram obtidos
com sucesso por meio de recombinação
homóloga
e a deleção de ambas
as
cópias do gene foi confirmada por PCR,
qPCR e
Southern blot
. Em seguida foram também obtido
s
mutantes
complementados
nos quais o gene
Kh1
foi reinserido
nos parasitos
LiKh1
-
/
-
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-
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A
pesar das
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-
/
-
não
apresentaram alteração do crescimento
quando comparadas com
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,
parasitos
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-
/
-
apresentam
alteração morfológica, que não é detectada nos
parasitos
complementados
.
Apesar de
Kh1
estar indireta
mente relacionado
com o transporte de glicose, os
m
utantes
LiKh1
-
/
-
não apresentaram alteração
da captação de glicose e nem alteração na sensibilidade ao antimônio.
Por
outro lado, as formas amastigotas de
LiKh1
-
/
-
foram incapazes de manter a
infecção em m
acrófagos
humanos ou
murinos, formando estruturas
multinucleadas que não sobrevivem por mais de 16 dias
in vitro
. A análise do
ciclo celular dos mutantes demonstrou que as amastigotas
LiKh1
-
/
-
apresentam
retenção em G
2
/M,
confirm
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-
/
-
apresentaram defeito
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Os
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deficientes
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também possuem menor
capacidade
de manter a infecção
in vivo
, até mesmo em camundongos
imunossuprimidos
. A deleção do gene
Kh1
não interferiu na produção de óxido
nítrico pelos macrófag
os
peritoneais
murinos.
Os resultados obtidos
in vitro
e
in
vivo
nesse trabalho demonstram que os parasitos
LiKh1
-
/
-
apresentam fenótipo
atenuado,
devido à
alteração na divisão celular. Esses parasitos poderão
ser
futuramente
testados como
potenciais candi
datos vacinais contra as
leishmaniosesAlthough vaccination is
the most suitable approach to prevent
L
eishmania
infection
,
there is no safe
and efficacious
vaccine against
human
leishmaniasis
available. Live attenuated
vaccines
-
golden
-
s
tandard against intracellular
pathogens
-
also
have been used as strategy for immunization
against
Leishmania
. In order to obtain an attenuated
Leishmani
a
parasite for vaccine
purposes, w
e perform
ed KO of
L. infantum Kharon1 (
KH1
)
gene
-
a target that
was previously associated with growth defects in
the
amastigote stage
of
L.
mexicana
–
by two rounds of conventio
nal homologous gene replacement
.
LiKH1
-
/
-
mutants were confirmed by PCR,
qPCR
and
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. We also
generate a
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add
-
back
line with an episomal copy of
Kh1
.
Despite t
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between the
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LiKh1
-
/
-
promastigotas when compared with
LiWT
parasites, we observed morphological alterations in th
ose mutant
s
.
Although
Kh1
mediates flagellar targeting of a glucose transporter, there is no
difference in the glucose uptake of the mutants when compared with the WT
line and there is no change in the sensitivity of the parasites to antimony. On
the other hand,
LiKH1
-
/
-
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n
o
t able to sustain the infection in
neither
human
THP
-
1 macrophages
or
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peritoneal
macrophages
, forming
multinucleate cells
that
unable
to survive more than 16 days
.
The cell cycle
analysis of
LiKh1
-
/
-
ama
stigotes
shows an accumulation of cel
ls in the G
2
/M
phase, indicating a cytokinesis defect.
The
LiKH1
-
/
-
mutants
displayed an
attenuated growth
in vivo
, even in immunosuppressed mice. The
Kh1
deletion
did not interfere with the production of nitric oxide by murine peritoneal
macrophages.
Take
n together, these results shows that these
LiKH1
-
/
-
parasites
present
a atennuated
phenotype
due to a cytokinesis defect. These
LiKH1
-
/
-
parasites
could be further tested as a potential vaccine against
leishmaniasis
Obtenção e caracterização de uma cepa atenuada de Leishmania Infantum mediante deleção do gene Kharon1
No full textApesar da vacinação ser considerada a melhor estratégia para prevenir a infecção por Leishmania, não existe até o momento nenhuma vacina segura e eficaz para uso humano disponível. As vacinas atenuadas, consideradas padrão - ouro para proteção contra patógenos intracelulares, têm sido largamente estudadas como estratégia de imunização contra as leishmanioses. Dessa forma, com o objetivo de obter uma cepa atenuada de Leishmania, foi realizado o nocaute do gene Kharon1 ( Kh1 ) em L. infantum, o qual foi descrito como sendo essencial para citocinese das formas amastigotas de L. mexicana . Os mutantes LiKh1 - / - foram obtidos com sucesso por meio de recombinação homóloga e a deleção de ambas as cópias do gene foi confirmada por PCR, qPCR e Southern blot. Em seguida foram também obtidos mutantes complementados nos quais o gene Kh1 foi reinserido nos parasitos LiKh1 - / - ( add - back ). Apesar das formas promastigotas dos mutantes LiKh1 - / - não apresentaram alteração do crescimento quando comparadas com LiWT, parasitos LiKh1 - / - apresentam alteração morfológica, que não é detectada nos parasitos complementados . Apesar de Kh1 estar indiretamente relacionado com o transporte de glicose, os mutantes LiKh1 - / - não apresentaram alteração da captação de glicose e nem alteração na sensibilidade ao antimônio. Por outro lado, as formas amastigotas de LiKh1 - / - foram incapazes de manter a infecção em macrófagos humanos ou murinos, formando estruturas multinucleadas que não sobrevivem por mais de 16 dias in vitro. A análise do ciclo celular dos mutantes demonstrou que as amastigotas LiKh1 - / - apresentam retenção em G 2 /M, confirmando que os mutantes LiKh1 - / - apresentaram defeito na citocinese. Os parasitos deficientes em Kh1 também possuem menor capacidade de manter a infecção in vivo, até mesmo em camundongos imunossuprimidos. A deleção do gene Kh1 não interferiu na produção de óxido nítrico pelos macrófagos peritoneais murinos. Os resultados obtidos in vitro e in vivo nesse trabalho demonstram que os parasitos LiKh1 - / - apresentam fenótipo atenuado, devido à alteração na divisão celular. Esses parasitos poderão ser futuramente testados como potenciais candidatos vacinais contra as leishmanioses.CNPqCAPESFAPEMIGISID.Although vaccination is the most suitable approach to prevent L eishmania infection , there is no safe and efficacious vaccine against human leishmaniasis available. Live attenuated vaccines - golden - standard against intracellular pathogens - also have been used as strategy for immunization against Leishmania. In order to obtain an attenuated Leishmani a parasite for vaccine purposes, we perform ed KO of L. infantum Kharon1 (KH1) gene - a target that was previously associated with growth defects in the amastigote stage of L. mexicana – by two rounds of conventio nal homologous gene replacement. LiKH1 - / - mutants were confirmed by PCR, qPCR and South ern blot. We also generate a Kh1 add - back line with an episomal copy of Kh1. Despite there is no difference between the growth of LiKh1 - / - promastigotas when compared with LiWT parasites, we observed morphological alterations in those mutants . Although Kh1 mediates flagellar targeting of a glucose transporter, there is no difference in the glucose uptake of the mutants when compared with the WT line and there is no change in the sensitivity of the parasites to antimony. On the other hand, LiKH1 - / - amastigotes was not able to sustain the infection in neither human THP - 1 macrophages or murine peritoneal macrophages, forming multinucleate cells that unable to survive more than 16 days . The cell cycle analysis of LiKh1 - / - ama stigotes shows an accumulation of cel ls in the G 2 /M phase, indicating a cytokinesis defect. The LiKH1 - / - mutants displayed an attenuated growth in vivo, even in immunosuppressed mice. The Kh1 deletion did not interfere with the production of nitric oxide by murine peritoneal macrophages. Take n together, these results shows that these LiKH1 - / - parasites present a atennuated phenotype due to a cytokinesis defect. These LiKH1 - / - parasites could be further tested as a potential vaccine against leishmaniasis
Estudo pré-clínico de complexos de ouro (Au) como metalofármacos antileishmania e antitumoral
No full textAs leishmanioses e o câncer são doenças complexas, com amplo espectro de manifestações clínicas e que dependem da quimioterapia para seu controle. As opções de tratamento para essas doenças são limitadas e possuem diversas desvantagens como alto custo e toxicidade, fazendo com que a busca por novos fármacos seja prioridade. Neste trabalho investigamos a atividade e modo de ação de complexos de ouro (AuI) que foram sintetizados com base na auranofina, um fármaco que tem atividades antileishmania e antitumoral descritas. Com o objetivo de implementar um modelo in vivo de baixo custo e fácil manutenção para o estudo de vias supressoras de tumores e compostos antitumorais, usamos planárias da espécie Schmidtea mediterranea. Os 24 complexos de ouro(I) estudados possuem potente atividades antileishmania e antitumoral, com CI50 entre 0,5 e 4,2 μM em amastigotas de Leishmania infantum e 0,1 e 5,7 μM em linhagem celular derivada de melanoma murino. Os compostos AdO Et e AdT Et causam estresse oxidativo nos parasitos, gerando espécies reativas de oxigênio diretamente ou causando seu acúmulo por inibição da enzima tripanotiona redutase e dano mitocondrial. Estes complexos foram capazes de reduzir o tamanho de lesão e carga parasitária em modelo murino de leishmaniose cutânea. Além disso, a combinação de AdT Et e miltefosina foi capaz de reduzir o tempo de tratamento pela metade. O estudo destes complexos utilizando planárias nos permitiu observar que eles causam
alterações no ciclo celular, reduzindo taxas de mitose e aumentando taxas de apoptose em animais saudáveis. Em planárias cuja P53 foi silenciada,
observamos que os compostos AdO Et e AdT Et aumentaram a sobrevida dos animais, por agirem inibindo a via de apoptose independente de P53. Os resultados deste trabalho indicam que os complexos de ouro(I) estudados são promissores agentes antileishmania e antitumorais. Sua comprovada eficácia in vivo, aliado a parâmetros toxicológicos e farmacocinéticos favoráveis, encorajam o desenvolvimento de alternativas para tratamento das leishmanioses e câncer, contribuindo com a expansão do restrito arsenal terapêutico.CAPESLeishmaniasis and cancer are complex diseases with a broad spectrum of
clinical manifestations that depends on chemotherapy as the main form of
control. The treatment options for these diseases are limited and have several drawbacks such as high cost and toxicity, making the search for new drugs a priority. In this work we investigated the activity and mode of action of gold (I) complexes that were synthesized based on auranofin, a drug with antileishmanial and antitumor activities described. In order to implement an inexpensive and low maintenance in vivo model for the study of tumor suppressor pathways and antitumor compounds, we used Schmidtea mediterranea planarians. The 24 gold (I) complexes studied have potent antileishmanial and antitumor activities with IC50 ranging from 0.5 to 4.2 μM in Leishmania infantum amastigotes and 0.1 to 5.7 μM in mouse metastatic melanoma. The compounds AdO Et and AdT Et cause oxidative stress in the parasites, generating reactive oxygen species directly or causing their accumulation by inhibition of the trypanothione reductase enzyme and affecting mitochondrial function. These complexes were able to reduce lesion size and parasite load in experimental cutaneous murine leishmaniasis. In addition, the combination of AdT Et and miltefosine was able to reduce treatment time by half. The study of these complexes using planarians allowed us to observe that they affect cell cycle, reducing mitosis and increasing apoptosis rates in healthy animals. In P53 knockdown animals, we observed that compounds AdO Et and AdT Et increased survival time of the animals by inhibiting P53 independent apoptosis pathway. The results shown here indicate that the gold (I) complexes
are promising antileishmanial and antitumor agents. The proven in vivo efficacy and favorable pharmacokinetic and toxicological parameters, encourages the development of chemotherapic antileishmanial alternatives, contributing with the expansion of the restricted therapeutic arsenal.2035-01-0
Variação de Número de Cópias em Genes Relacionados à Resistência aos Antimaláricos em Isolados de Plasmodium spp. do Brasil
No full textUm dos maiores desafios do controle da malária é a resistência do parasito aos antimaláricos. A biologia molecular tem permitido a compreensão desse fenótipo com o estudo de marcadores associados a ela, tais como o Polimorfismo de Base Única (SNP) e o Polimorfismo de Variação de Número de Cópias Gênicas (CNV). Alterações gênicas atribuídas ao CNV podem levar a alterações fenotípicas no parasito, conferindo resistência ou suscetibilidade aos antimaláricos. Sua presença foi relacionada com a falha terapêutica a drogas com o cloroquina (CQ) e mefloquina (MQ) em diversas regiões do mundo. Os genes pfmdr1 e pfgch1 de P. falciparum e pvmdr1 de P. vivax são relacionados com resistência a diferentes fármacos. Entretanto, no Brasil poucos estudos caracterizaram esses genes quanto à presença de CNVs, sendo que sua maioria investigou a diversidade genética associada aos SNPs. O objetivo deste estudo foi investigar a presença de CNV nos genes pfmdr1 e pfgch1 de P. falciparum e pvmdr1 e pvcrt-o de P. vivax, assim como SNPs nos genes pfcrt e pfmdr1 de P. falciparum. O CNV foi determinado por qPCR utilizando sondas de hidrólise e os SNPs por PCR-RFL P. As amostras foram coletadas entre 2002 a 2012, em 3 diferentes estado s brasileiros – Mato Grosso (n=31), Rondônia (n=27) e Amapá (n=10). As 31 amostras analisadas de P. falciparum apresentaram cópia única para pfmdr1 e pfgch1 , apesar do histórico de resistência do parasito a vários antimaláricos utilizados ao longo do tempo no Brasil. Entretanto, um importante SNP em pfcrt (K76T), relacionado com resistência à CQ, foi identificado em todas as amostras analisa das. Nesse estudo, também foram analisados 38 isolados de P. vivax, sendo reportado a amplificação gênica em 7 (18%) amostras para pvmdr1. No sudoeste asiático altas taxas de CNV em pvmdr1 foram reportadas (38%), sendo relatado por um único estudo no Brasil (0,9% de amplificação). Um resultado importante desse estudo foi a observação, pela primeira vez, da amplificação de pvcrt-o. Embora estudos anteriores o associem com resistência e casos graves da doença, nenhum avaliou a presença de CNV em pvcrt-o. Este estudo é um dos primeiros a avaliar a presença de CNV nos genes pvmdr1, pvcrt-o e pfgch1 no Brasil, assim como estudar a distribuição de CNV no mundo através de uma revisão sistemática.FAPEMIGCNPqCAPESFundação Oswaldo CruzOne of the greatest challenges on malaria control is the parasite resistance to antimalarials. Molecular genotyping aims to identify and to monitor genetic markers related to parasite resistance, as single nucleotide polymorphisms (SNP) and copy number variation (CNV). Genetic alterations related to CNV could lead to phenotypic alterations in parasite, conferring resis tance or susceptibility to antimalarials. The presence of CNV was identified e r elated with therapeutic failure to drugs like chloroquine and mefloquine in different regions of the world. The mdr1 and gch1 genes of P. falciparum and mdr1 of P. vivax are related with resistance, however in Brazil few studies have characterized these genes in relation to CNV, being more associated with SNPs. The objective of this project was investigate the presence of CNV in pfmdr1 and pfgch1 genes and pvmdr1 and pvcrt-o , as well as evaluate SNP on mdr1 and crt genes of P. falciparum. The CNV was estimated by qPCR using the TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) system and SNPs was assessed by RFLP-PCR. The samples comprise a period between 2002 to 2012 from 3 different areas of Brazil – Mato Grosso (n=31), Rondônia (n=27) and Amapá (n=10). All 31 samples analyzed to P. falciparum showed no amplification to mdr1 and gch1 genes. However, an important SNP on crt gene (K76T), related to chloroquine resistance, was observe d. Despite the resistance history in Brazil, in this study the CNV was not prese nt on the P. falciparum genes. To the 38 P. vivax isolates, amplification was observed in 7 samples t o mdr1 gene e 1 to crt-o . The change on the therapeutic scheme could be rela ted to the reversion of the genetic amplification genotype, with the withdra wal of drug with historic of resistance, as chloroquine. High rates of CNV are obse rved in Southeast Asia countries (reaching 38%), but in Brazil just one stud y reported a low rate of amplification (0,9%). For the first time, the prese nce of CNV on pvcrt-o was reported in Brazilian samples. Other studies have associated this gene with resistance and severe cases, but none evaluated the association of CNV and this outcome. This study is one of the first to evaluate CNV on pvmdr1 , pvcrt-o and pfgch1 in Brazil, as well as to evaluate the CNV distribution in the world through a systematic review
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Gelatinases MMP-2 e MMP-9 como Biomarcadores de Evolução entre as Formas Clínicas e Ativadores Alternativos da Interleucina (IL)-1B na Doença de Chagas
No full textA doença de Chagas ou Tripanossomíase Americana é uma doença parasitária tropical causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. A doença de Chagas humana tem uma apresentação clínica variável. A fase aguda é caracterizada por alta parasitemia, que geralmente é facilmente detectada pelo exame direto do sangue. A fase crônica, geralmente inicia-se com uma forma clínica longa, assintomática ou latente, chamada de forma indeterminada (IND). Enquanto a maioria dos pacientes infectados pelo T. cruzi persistem em IND para sempre, cerca de 40% deles, 10-30 anos após a infecção inicial, podem desenvolver lesões em diferentes órgãos,
principalmente no coração, a forma cardíaca (CARD) da doença crônica. Um dos principais desafios na doença de Chagas crônica é identificar um mecanismo de intervenção capaz de predizer a evolução clínica de IND para CARD ou minimizar os efeitos do desenvolvimento da fibrose no coração. Portanto, um esforço significativo é dado à identificação de biomarcadores moleculares que podem ser usados para prever a evolução da doença e que podem ser usados como um prognóstico clínico. Outro ponto importante está na resposta imune entre as formas clinicas que é
bastante diferente. Considerando que um biomarcador de evolução clinica ideal também pode influenciar a resposta imune durante a morbidade, as
metaloproteinases de matriz (MMPs) tem recebido destaque. As MMPs são um grupo de endopeptidases dependentes de zinco que controlam a síntese e degradação da matriz extracelular por clivagem de colágeno, laminina e citocinas, como a interleucina (IL)-1 . O desequilíbrio entre MMPs e seus inibidores teciduais (TIMPs) está envolvido em algumas doenças que abrangem a inflamação crônica, como câncer, artrite e cardiopatias. Além disso, conversão do precursor inativo pro-IL-1 em peptídeo IL-1V é controlada por via dependente da caspase-1, associada
aos inflamassomas. Porém, outros mecanismos independentes de caspase-1 mediados por proteases, especialmente como MMPs, já foram descritos. Nós dosamos a concentração plasmática das MMPs e TIMPs em dois tempos em uma coorte com pacientes com diferentes formas clinicas da doença de Chagas para caracterizarmos biomarcadores de evolução, usando ensaio milliplex. Também analisamos a expressão das MMPs, citocinas e moléculas da via clássica de ativação da IL-1 em células da imunidade inata, por citometria de fluxo, para avaliar se as MMPs têm influencia como via alternativa de ativação da IL-1 . A MMP-2 mostrou-se um biomarcador para a fibrose de substituição no remodelamento precoce e um preditor sensível para alterações iniciais em pacientes IND que podem evoluir para a forma clínica cardíaca. A MMP-9 parece ser um biomarcador para fibrose tardia e remodelação cardíaca grave em pacientes CARD. Propomos que eventuais dosagens de gelatinases no manejo clínico, aliadas a avaliações da fisiologia do coração, possam ser um importante preditor para o prognóstico da doença e facilitar medidas preventivas em pacientes com doença de Chagas. Demonstramos, também, que as gelatinases parecem envolvidas de forma diferente
com as vias de ativação da IL-1 em células de pacientes com formas clínicas distintas da doença de Chagas. Contudo, mecanismos moleculares dessas vias devem ser melhor caracterizados para reforçar esse achado.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) [404151/2012-4].
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) [APQ-
02419-15, PPM-00501-13 e PPM-00233-17].
Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) - Programa Estratégico de Apoio à Pesquisa em Saúde (PAPES) [478846/2009-6].Chagas disease or American Trypanosomiasis is a tropical parasitic disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. Human Chagas disease has a variable clinical presentation. The acute phase is characterized by high parasitemia, which is usually easily detected by direct examination of the blood. The chronic phase usually begins with a long, asymptomatic or latent clinical form, called indeterminate (IND). While most T. cruzi-infected patients persist in IND forever, about 40% of them, 10-30
years after initial infection, may develop lesions in different organs, especially in the heart, the cardiac form (CARD) of the chronic disease. One of the main challenges in chronic Chagas disease is to identify an intervention mechanism capable of predicting the clinical evolution of IND to CARD or to minimize the effects of the development of fibrosis in the heart. Therefore, a significant effort is made to identify molecular biomarkers that can be used to predict disease progression and that can be used as a clinical prognosis. Another important point, is the immune response between the clinical forms that is different. Considering that a ideal biomarker of clinical evolution may also influence the immune response during morbidity, matrix metalloproteinases (MMPs) have been highlighted. MMPs are a group of zinc dependent endopeptidases that control the synthesis and degradation of the extracellular matrix by cleavage of collagen, laminin and cytokines such as interleukin (IL)-1 . The imbalance between MMPs and their endogenous inhibitors (TIMPs) is involved in some diseases that include chronic inflammation, such as cancer, arthritis and heart diseases. In addition, conversion of the inactive precursor
pro-IL-1 to IL-1V peptide is controlled by the caspase-1 dependent pathway, associated with inflammasomes. However, other independent mechanisms of caspase-1 mediated by proteases, especially as MMPs, have been described. We measured the plasma concentration of MMPs and TIMPs in two times in a cohort with patients with different clinical forms of Chagas disease to characterize evolution biomarkers using multiplex assay. We also analyzed the expression of MMPs, cytokines and molecules of the classic IL-1 activation pathway in cells of innate immunity by flow cytometry to assess whether MMPs have influence as an alternative route of IL-1 activation. MMP-2 has been shown to be a biomarker for replacement fibrosis in early remodeling and a sensitive predictor for early changes in IND patients that may progress to cardiac clinical form. MMP-9 appears to be a biomarker for late fibrosis and severe cardiac remodeling in CARD patients. We propose that dosages of gelatinases in the clinical management, associated with evaluations of the physiology of the heart, can be an important predictor for the prognosis of the disease and facilitate preventive measures in patients with Chagas disease. We have also shown that gelatinases seem to be involved in different pathways of IL-1 activation in cells from patients with distinct clinical forms of Chagas disease. However, molecular mechanisms of these pathways should be better characterized to reinforce this finding.2021-01-0
Malária como zoonose na Mata Atlântica: detecção molecular da infecção por PLASMODIUM em primatas neotropicais e desenvolvimento de um diagnóstico diferencial
No full textA presença de primatas não-humanos (PNHs) como fonte de infecção por Plasmodium para seres humanos consiste em um grande desafio para eliminação da malária. No Brasil, sugerese que a manutenção da transmissão em áreas de Mata Atlântica envolva a presença de PNHs infectados, que podem atuar como reservatórios da doença. Duas espécies de parasitos da malária são capazes de infectar primatas neotropicais, P. brasilianum e P. simium, ambos infectantes ao homem e estreitamente relacionados aos parasitos causadores da malária humana, P. malariae e P. vivax, respectivamente. Apesar da importância destes parasitos devido ao seu potencial zoonótico, relativamente pouco se conhece sobre a prevalência da infecção, dinâmica de transmissão e a diversidade genética dos parasitos. O limitado número de estudos sobre plasmódios de primatas brasileiros, assim como o relato de casos autóctones em regiões de Mata Atlântica motivou nosso grupo a investigar a infecção malárica em PNHs de vida livre e de cativeiro desde 2008, na tentativa de elucidar diversos mecanismos da transmissão zoonótica. Ao todo, foram obtidas cerca de 360 amostras de PNHs coletadas em Joinville/SC, Indaial/SC, Porto Rico/PR, Taquarassu/MS e Guapimirim/RJ. As coletas de sangue de primatas neotropicais no Centro de Primatologia do Rio de Janeiro (CPRJ), em Guapimirim (RJ), foram realizadas entre 2011 a 2016. A infecção por Plasmodium foi verificada por NESTED/PCR. Nós observamos que existe uma grande variação na taxa de infecção, justificada pela sazonalidade e pelas espécies de PNHs que foram amostradas, sugerindo que algumas famílias são mais susceptíveis à infecção por Plasmodium do que outras. Além disso, nós descrevemos pela primeira vez a infecção por P. simium em Cebus e Sapajus e por P. brasilianum em Callitrichidae dos gêneros Callithrix, Mico e Leontopithecus. A infecção foi comprovada por sequenciamento de um pequeno fragmento do gene 18S SSU rRNA, confirmando a grande similaridade genética entre P. brasilianum e P. malariae e entre P. simium e P. vivax. Neste trabalho também foi possível padronizar um método molecular de diagnóstico da infecção por Plasmodium a partir de fragmentos de órgãos provenientes de necropsia de um PNH. Além disso, em parceria com pesquisadores da Fiocruz e do Japão, foi possível caracterizar a Malária como Zoonose na Mata Atlântica brasileira através do sequenciamento do mitogenoma de P. simium. A partir da descrição, com nossa colaboração, de dois polimorfismos (3535 C> T e 3869 G> A) capazes de diferenciar a infecção por P. simium, responsável por esses casos zoonóticos, da infecção por P. vivax, foi desenvolvido um diagnóstico diferencial de P.simium por NESTED/PCR RFLP. Para validação desse ensaio, mais de cem amostras de sangue de humanos e PNHs de diferentes regiões, infectadas com diferentes espécies de Plasmodium foram utilizadas. Todas as amostras de PNHs e a maioria dos humanos infectados no bioma da Mata Atlântica foram positivas para P. simium. Todos os resultados foram confirmados por sequenciamento de DNA. Esta ferramenta pode ser usada para o diagnóstico da malária zoonótica na Mata Atlântica, auxiliando o serviço de vigilância no delineamento de estratégias de controle e prevenção, quanto ao diagnóstico precoce de casos humanos na região extra-amazônica.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES)Non-Human Primates (NHPs) as a source for Plasmodium infections in humans are a challenge for malaria elimination. In Brazil it is suggested that the maintenance of malaria transmission in the Atlantic Forest involve the presence of infected monkeys, which can act as reservoirs of the disease. Two species of malaria parasites are able to infect NHPs, P. brasilianum and P. simium, both are infective to men and very similar to the human parasites P. malariae and P. vivax, respectively. Despite the importance of these parasites due to their zoonotic potential, relatively little is known about the prevalence of infection, transmission dynamics and genetic diversity of parasites. The limited number of studies as well as the report of autochthonous cases in regions of Atlantic Forest motivated our group to investigate malaria infection in NHPs since 2008 in an attempt to elucidate the zoonotic transmission mechanisms. Overall, about 360 samples of free-living and captive NHPs from Joinville/SC, Indaial/SC, Porto Rico/PR, Taquarassu/MS and Guapimirim/RJ in Brazil were collected. Blood collections of neotropical primates at the Rio de Janeiro Primatology Center (CPRJ) in Guapimirim (RJ) were performed between 2011 and 2016. Plasmodium infection was verified by NESTED/PCR. In this study it was possible to observe that the prevalence of infection varies according to the time of year and the species of NHP sampled, since some Neotropical primate families are more susceptible to Plasmodium infection than others. Moreover, we described, for the first time, infection by P. simium in Cebus and Sapajus and by P. brasilianum in Callitrichidae of the genus Callithrix, Mico and Leontopithecus. The infection was confirmed by sequencing a small fragment of the 18S SSU rRNA gene, confirming a great genetic similarity between P. brasilianum and P. malariae and between P. simium and P. vivax. In addition, in partnership with researchers from Fiocruz and Japan, it was possible to demonstrate the zoonotic character of malaria infection in the Brazilian Atlantic Forest by sequencing the complete mitochondrial genome of P.simium. Based on two SNPs (3535 C> T e 3869 G> A) described with our collaboration, capable of differentiating the P. simium infection, responsible for these zoonotic cases, from P. vivax infection, was developed a NESTED/PCR RFLP. For validation of this assay, more than one hundred of human and NHPs blood samples from different regions, infected with different Plasmodium species were used. All NHPs samples and most of the infected humans in the Atlantic Forest biome were positive for P. simium. All results were confirmed by DNA sequencing. This molecular tool can be used for the diagnosis of zoonotic malaria in the Atlantic Forest, helping the surveillance system in the delineation of strategies that can be taken to control and prevent the disease in these regions.2030-01-0
Formulações responsivas ao ambiente contendo óleo resina de Copaifera reticulata Duche no combate à leishmaniose cutânea vísceral : indução da resposta imune TH1 e perfil de segurança
Get PDFOrientador: Prof. Dr. Celso Vataru NakamuraCoorientador: Prof.ª Dr.ª Danielle Lazarin BidóiaTese (doutorado em Ciências Biológicas) - Universidade Estadual de Maringá, 2024RESUMO: As leishmanioses representam um desafio global em saúde pública devido à falta de avanços significativos no desenvolvimento de novas terapias desde a introdução dos antimoniais pentavalentes na década de 1940. Diante da limitada eficácia terapêutica e da alta toxicidade dos medicamentos disponíveis, a investigação de novas substâncias, baseada em conhecimentos empíricos e no uso tradicional de plantas medicinais, tem se mostrado uma alternativa promissora. Dentre as espécies vegetais de interesse, as pertencentes ao gênero Copaifera se destacam, sendo o óleo resina extraído dessas plantas um recurso natural de grande importância na medicina tradicional da região Amazônica, com atividade antileishmania promissora. No entanto, para garantir a qualidade, segurança e a eficácia dos fitoterápicos, é fundamental realizar o controle de qualidade desses produtos, desde a identificação da espécie vegetal até a presença dos agentes bioativos na formulação final, assim como garantir a sua biodisponibilidade. Além disso, o desenvolvimento de formulações farmacêuticas requer várias etapas para garantir a estabilidade do medicamento, a preservação da atividade das substâncias e a melhoria da solubilidade e biodistribuição. Nesse contexto, com base no uso tradicional do óleo de copaíba (OC) e nas evidências de sua segurança, o presente estudo teve como objetivo avaliar a eficácia terapêutica de um sistema auto emulsionante (F14) para administração oral e de um sistema bioadesivo termoresponsivo (F12) tópico para o tratamento da leishmaniose cutânea e visceral. Foram conduzidos estudos in vivo utilizando camundongos infectados ou não com Leishmania amazonensis ou L. infantum, nos quais foram administrados o óleo resina de C. reticulata Ducke isolado ou incorporado nas formulações F14 e F12. Os efeitos dos tratamentos foram avaliados por meio de medidas de peso corporal e dos órgãos, determinação do volume das lesões e carga parasitária utilizando técnicas de bioluminescência e qPCR, avaliação dos níveis de citocinas e produção de oxido nítrico, além de análises bioquímicas e hematológicas para detectar possíveis efeitos tóxicos. Os resultados indicaram que os animais não infectados submetidos aos tratamentos com o OC e as formulações não apresentaram alterações significativas no peso corporal nem nos pesos dos órgãos, sugerindo a ausência de toxicidade dessas terapias. No entanto, nos animais infectados com L. infantum, observou-se uma redução significativa no peso corporal quando tratados com a formulação F14 com OC ou miltefosina, apesar de não apresentarem diferenças na aparência física. Essa diminuição no peso corporal foi acompanhada por uma redução no peso do fígado em todos os grupos de tratamento em comparação com o grupo controle, indicando uma possível reversão da hepatomegalia, uma
característica da leishmaniose visceral, como resultado dos tratamentos administrados. Essas reduções nos pesos dos órgãos alvo foram então atribuídas à diminuição da carga parasitária confirmada por técnicas de qPCR, demonstrando a eficácia das intervenções terapêuticas. No modelo experimental de infecção com L. amazonensis, não foram observadas variações significativas no peso corporal ou nos órgãos após a necropsia. Ao avaliar o aumento no volume das lesões nas patas desses camundongos após 28 dias de tratamento, constatou-se uma redução de 64,25% e 45,42% para a formulação F14 com OC e a formulação F12 com OC, respectivamente, em comparação com o grupo controle. Esses resultados foram corroborados pelas medidas de bioluminescência e qPCR, que indicaram que a redução no volume das lesões foi diretamente proporcional a redução na carga parasitária. A ação imunomoduladora do OC e das formulações também foi avaliado, sendo observado uma polarização da resposta Th1 com aumentos nos níveis de IL-2, TNF-? e IFN-? concomitante com a redução de IL-10 e TGF-?, que como consequência levaram a aumentos de oxido nítrico e morte dos parasitos. Além da eficácia terapêutica, a segurança do uso das formulações F14 e F12 com OC foi avaliada, e os resultados indicam que essas formulações não causaram toxicidade significativa nos animais, uma vez que os marcadores renais e hepáticos apresentaram valores semelhantes aos observados nos animais não tratados. Apesar dos estudos toxicológicos publicados demonstrarem que o óleo resina de Copaifera spp. não possui efeitos mutagênico, genotóxico ou citotóxicos, e os polímeros e emulsionantes utilizados no desenvolvimento das formulações F14 e F12 serem reconhecidos como seguros e aprovados para uso em formulações farmacêuticas, ainda eram necessários estudos de toxicidade de ambas as formulações. Uma vez que a identificação de qualquer atividade toxicológica em substâncias bioativas de plantas por meio de testes pré-clínicos deve preceder seu uso em estratégias de saúde preventiva. Sendo assim, a toxicidade aguda das formulações foi avaliada em ratos Wistar machos e fêmeas ao longo de um período de 14 dias. Os ratos receberam uma dose única da formulação F14 com OC por via oral ou intraperitoneal ou da formulação F12 com OC por via tópica, na dose de 2.000 mg/kg. Avaliamos a toxicidade comportamental, bem como as alterações bioquímicas e hematológicas, incluindo toxicidades em múltiplos órgãos. A administração das formulações não resultou em mortalidade dos ratos, e nenhum efeito toxicológico foi observado em relação ao peso corporal, consumo de ração e água, peso dos órgãos ou parâmetros hematológicos e bioquímicos. Complementarmente, camundongos Swiss foram tratados com as formulações na dose de 2.000 mg/kg por 24 h e, então, realizada a coleta de medula óssea para realizar o teste de micronúcleos para avaliar potencial atividade genotóxica das formulações, a qual não foi
evidenciada. Em conclusão, neste trabalho, descrevemos a eficácia terapêutica e segurança do uso das formulações F14 e F12 contendo óleo resina de C. reticulata Ducke como alternativa terapêutica para o tratamento da leishmaniose cutânea e visceral. Com estas abordagens pretende-se obter os dados necessários para notificação de novo produto fitoterápico de acordo com o estipulado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Food and Drug Administration (FDA - Estados Unidos da América) e demais agências reguladoras como uma alternativa de baixo custo para o tratamento de leishmaniosesABSTRACT: Leishmaniasis presents a global public health challenge due to the lack of significant advancements in developing new therapies since the introduction of pentavalent antimonials in the 1940s. Given the limited therapeutic efficacy and high toxicity of available medications, investigating new substances based on empirical knowledge and the traditional use of medicinal plants has emerged as a promising alternative. Among the plant species of interest, those belonging to the genus Copaifera are notable. The oil-resin extracted from these plants is a natural resource of great importance in traditional medicine in the Amazon region, exhibiting promising anti-leishmanial activity. However, to ensure the quality, safety, and efficacy of phytotherapeutics, it is essential to conduct quality control of these products, from the identification of the plant species to the presence of bioactive agents in the final formulation, as well as to guarantee their bioavailability. Additionally, developing pharmaceutical formulations requires several steps to ensure the drug's stability, preservation of the active substances' activity, and improvement of solubility and biodistribution. In this context, based on the traditional use of copaiba oil (CO) and evidence of its safety, this study aimed to evaluate the therapeutic efficacy of a self-emulsifying system (F14) for oral administration and a topical thermoresponsive bioadhesive system (F12) for treating cutaneous and visceral leishmaniasis. In vivo studies were conducted using mice infected or not with Leishmania amazonensis or L. infantum, where C. reticulata Ducke oil-resin was administered either in isolation or incorporated into the F14 and F12 formulations. The treatment effects were evaluated by measuring body and organ weights, determining lesion volume and parasitic load using bioluminescence and qPCR techniques, assessing cytokine levels and nitric oxide production, and conducting biochemical and hematological analyses to detect potential toxic effects. The results indicated that uninfected animals subjected to CO and formulation treatments did not exhibit significant changes in body weight or organ weights, suggesting the absence of toxicity of these therapies. However, in animals infected with L. infantum, a significant reduction in body weight was observed when treated with the F14 formulation with CO or miltefosine, despite no differences in physical appearance. This decrease in body weight was accompanied by a reduction in liver weight in all treatment groups compared to the control group, indicating a possible reversal of hepatomegaly, a characteristic of visceral leishmaniasis, as a result of the administered treatments. These reductions in target organ weights were attributed to the decreased parasitic load confirmed by qPCR techniques, demonstrating the efficacy of the therapeutic interventions. In the experimental infection model with L. amazonensis, no
significant variations in body or organ weights were observed after necropsy. When evaluating the increase in lesion volume on the paws of these mice after 28 days of treatment, reductions of 64.25% and 45.42% were observed for the F14 formulation with CO and the F12 formulation with CO, respectively, compared to the control group. These findings were corroborated by bioluminescence and qPCR measurements, which indicated that the reduction in lesion volume was directly proportional to the reduction in parasitic load. The immunomodulatory action of CO and the formulations was also evaluated, revealing a Th1 response polarization with increased levels of IL-2, TNF-?, and IFN-?, concomitant with reduced levels of IL-10 and TGF-?, leading to increased nitric oxide production and parasite death. Besides therapeutic efficacy, the safety of using the F14 and F12 formulations with CO was evaluated, and the results indicate that these formulations did not cause significant toxicity in the animals, as renal and hepatic markers showed values similar to those observed in untreated animals. Despite published toxicological studies demonstrating that Copaifera spp. oil-resin does not possess mutagenic, genotoxic, or cytotoxic effects, and the polymers and emulsifiers used in developing the F14 and F12 formulations are recognized as safe and approved for use in pharmaceutical formulations, toxicity studies of both formulations were still necessary. Identifying any toxicological activity in bioactive plant substances through preclinical tests must precede their use in preventive health strategies. Thus, the acute toxicity of the formulations was evaluated in male and female Wistar rats over 14 days. The rats received a single dose of the F14 formulation with CO orally or intraperitoneally or the F12 formulation with CO topically at a dose of 2,000 mg/kg. We assessed behavioral toxicity and biochemical and hematological changes, including multi-organ toxicities. The administration of the formulations did not result in rat mortality, and no toxicological effects were observed regarding body weight, food and water consumption, organ weights, or hematological and biochemical parameters. Additionally, Swiss mice were treated with the formulations at a dose of 2,000 mg/kg for 24 h, and bone marrow was collected for micronucleus testing to assess potential genotoxic activity of the formulations, which was not evidenced. In conclusion, this work describes the therapeutic efficacy and safety of the F14 and F12 formulations containing C. reticulata Ducke oil-resin as an alternative therapy for cutaneous and visceral leishmaniasis. These approaches aim to obtain the necessary data for the notification of a new phytotherapeutic product in accordance with the regulations of the National Health Surveillance Agency (ANVISA), the Food and Drug Administration (FDA - United States of America), and other regulatory agencies as a low-cost alternative for leishmaniasis treatment100 f. : il. (algumas color.)
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