95 research outputs found
Diffusion of nanoparticles in the cell cytoplasm
No full textIn Etoc 2018, we presented the diffusive behavior inside the cytosol of living cells for different kind of nanometric sized nanoparticles. We showed that the passivation of the particles is the main parameter that regulate the diffusion properties of particles smaller than 70nm not only in Hela cells but also in RPE1 and MSC cells.
Here we open the data for the MSC cells.
Experiments consists in the recording of small subregions of the cytoplasm located at the periphery of the cell.
A README file is included in the archive with the recording parameters.
DATA were recorded by Elie BALLOUL
Scripts were written by Mathieu COPPEY, Fred ETOC and modified by Elie BALLOUL.(to use polyfit instead of ezyfit)
We also make available the scripts that we used to generate the maps.
Some functions were found in Matlab Central and their corresponding license is in their respective folders.</p
Imaging the dynamic architecture of chromatin at the single cell level
No full textLa structure de la chromatine joue un rôle crucial dans la régulation de plusieurs fonctions cellulaires chez les cellules de mammifères. Perturber l’organisation spatiale de la chromatine peut avoir des conséquences dramatiques sur la vie d’une cellule et peut amener`des pathologies graves chez les organismes. Deux facteurs nucléaires, CTCF et Cohesine, sont parmi les principaux acteurs dans la régulation et le maintien de l’architecture de l’ADN. Des avancements importants ont révélé ́la complexité ́des mécanismes qui régulent l’organisation de la chromatine, mais le domaine manque encore d’une description dynamique à l’échelle de la cellule et de la molécule unique. Cette étude est centrée sur la description de la dynamique de CTCF et Cohesin réalisé ́avec de méthodes de suivi de la molécule unique dans des cellules souche embryonnaires vivantes de souris. L’interaction entre ces deux facteurs a été étudiée à travers la caractérisation de la dynamique de Cohesin en absence de CTCF et dans le contexte d’autres altérations biologiques.Chromatin structure and cellular function are tightly linked in the nucleus of mammalian cells. Disruption of chromatin spatial organisation dramatically affects the life of a cell and eventually leads to severe pathologies in entire organisms. Two nuclear factors, CTCF and Cohesin, have been found to play a crucial role in the regulation and maintenance of DNA architecture. Huge advancements have been made in the understanding of the mechanisms behind chromatin arrangement but the field is still lacking a dynamic picture at the single cell and single molecule level. This study provide this study provides insight into the dynamics of CTCF and Cohesin through single particle tracking of CTCF and Cohesin dynamics achieved with single molecule tracking in living mouse embryonic stem cells. The interplay between these two factors was studied by looking at Cohesin’s behaviour in the absence of CTCF and in the context of other biological alterations
Cell to cell communication by diffusible molecules
No full textNon UBCUnreviewedAuthor affiliation: Curie Institute ParisResearche
Contrôle optogénétique de la polarité de la migration cellulaire par la voie de signalisation RhoA
No full textLes cellules perçoivent des signaux chimiques ou physiques externes, les interprètent à l'aide de leur réseau de protéines et modifient leur comportement en conséquence. Mieux comprendre les systèmes vivants passe par le décryptage des signaux biochimiques à l'intérieur de la cellule, qui sont responsables de réponses phénotypiques spécifiques. Parmi tous les processus cellulaires, la migration cellulaire est fascinante car elle révèle la capacité des cellules à agir comme des unités individuelles ou collectives, qui se polarisent par elles-mêmes et ont leur propre indépendance.Les Rho-GTPases jouent un rôle clé dans la migration des cellules de mammifères: ce sont des protéines souvent considérées comme des contrôleurs du cytosquelette cellulaire, et donc responsables des changements morphologiques provoqués par les filaments et les moteurs tels que l'actine et la myosine. Pour sonder le réseau de protéines et étudier les liens de cause à effet sur le comportement cellulaire ou multicellulaire, l'optogénétique est un outil formidable qui permet un contrôle spatio-temporel précis de l'activité des Rho-GTPases.Ce manuscrit aborde la question du contrôle de la migration cellulaire et multicellulaire par les Rho-GTPases à travers deux systèmes modèles différents, grâce à l'optogénétique.Le premier projet porte sur la migration et la polarisation de cellules individuelles après le recrutement membranaire d'un activateur de la protéine RhoA (un domaine GEF). En utilisant l'optogénétique, j'ai découvert qu'un domaine GEF est capable de déclencher deux réponses phénotypiques opposées dans la même lignée cellulaire : une protrusion ou une rétraction. La caractérisation des phénotypes a permis de montrer que le choix est dicté par la concentration de l'activateur optogénétique présent dans la cellule avant l'activation. J'ai décrit la conséquence de ce changement de concentration sur les voies de signalisation impliquées et j'ai développé un modèle qui récapitule les principaux résultats avec peu de paramètres. Grâce à lui, j'ai pu contrôler les deux effets opposés de cette protéine dans la même cellule. Ce projet révèle et explique un exemple clair de multiplexage des signaux cellulaires, à savoir la capacité d'une voie de signalisation à avoir plusieurs fonctions, ici dans le même contexte cellulaire et à l’échelle de la minute.Le second projet a été réalisé en collaboration avec l'équipe de Fanny Jaulin de l'Institut Gustave Roussy. Il visait à comprendre un nouveau mode de migration collective découvert par eux dans l'initiation des métastases du cancer colorectal. Cette migration d'amas épithéliaux de dizaines à centaines de cellules repose sur des propriétés uniques : absence d'adhésions focales sur le substrat, environnement confiné, et forte contractilité. Ce mode de migration collective rappelle la migration amiboïde d'une seule cellule. En utilisant des outils optogénétiques développés dans notre laboratoire et des canaux microfluidiques, j'ai conçu et réalisé des expériences pour comprendre le rôle des Rho-GTPases dans la polarité et la migration de ces sphères multicellulaires. Mon principal résultat est qu'un déséquilibre de contractilité déclenché par la protéine RhoA est suffisant pour contrôler la polarité et le mouvement du groupe de cellules.Dans l'ensemble, mon doctorat a permis de comprendre comment la voie de signalisation RhoA agit pour établir une polarité dans la migration cellulaire : je l'ai examinée au niveau de la cellule unique, révélant un exemple unique de multifonctionnalité d'une protéine, ainsi qu'au niveau collectif, disséquant un nouveau mode de migration collective des cellules cancéreuses.Cells sense external chemical or physical signals, interpret them using their protein network and modify their behavior accordingly. A better understanding of living systems involves deciphering how biochemical signals are transmitted within the cell, leading to specific phenotypic responses. Among all cellular processes, cell migration is fascinating because it reveals the ability of cells to act as individual or collective units, which polarize by themselves and have their own independence.Rho-GTPases play a key role in mammalian cell migration: they are proteins often regarded as controllers of the cellular cytoskeleton, and therefore responsible for morphological changes caused by filaments and motors such as actin and myosin. To probe the protein network and study causal links on cellular or multicellular behavior, optogenetics is a great tool that enables precise spatio-temporal control of Rho-GTPase activity.This PhD manuscript addresses the question of the control of single and multicellular migration by Rho-GTPases, using optogenetics in two different model systems.The first project focuses on the migration and polarization of single cells following membrane recruitment of a RhoA activator (a GEF domain). Using optogenetics, I discovered that a GEF domain is capable of triggering two opposite phenotypic responses in the same cell line: protrusion or retraction. Characterization of the phenotypes showed that the choice is dictated by the concentration of optogenetic activator present in the cell prior to activation. I described the consequences of this change in concentration on the signalling pathways involved, and developed a model that summarizes the main results with few parameters. Thanks to it, I was able to control the two opposite effects of this protein in the same cell. This project reveals and explains a clear example of cellular signal multiplexing, i.e. the ability of a signaling pathway to have multiple functions, here in the same cellular context and on a minute scale.The second project was carried out in collaboration with Fanny Jaulin's team at the Institut Gustave Roussy. It aimed to understand a new mode of collective migration discovered by them in the initiation of colorectal cancer metastases. This migration of epithelial clusters of tens to hundreds of cells relies on unique properties: absence of focal adhesions to the substrate, confined environment, and high contractility. This mode of collective migration is reminiscent of single cell amoeboid migration. Using optogenetic tools developed in our laboratory and microfluidic channels, I designed and carried out experiments to understand the role of Rho-GTPases in the polarity and migration of these multicellular spheres. My main finding is that a contractility imbalance triggered by the RhoA protein is sufficient to control the polarity and movement of the cell group.Overall, my PhD has provided insight into how the RhoA signaling pathway acts to establish polarity in cell migration: I examined it at the single-cell level, revealing a unique example of multifunctionality of a protein, as well as at the collective level, dissecting a novel mode of collective cancer cell migration
Mapping of nanoparticles diffusion in cells
No full textWe mapped the diffusion of particles in the cytoplasm. To do so, we electroporated QDs-SB particles in cells as shown in Debayle et al 2019. Here we were using RPE1 cells. We present the recording of three cells and the scripts that we used to generate some maps of diffusion in the cell.
The scripts were made to use the output tracks from Slimfast 1.103e but can be adapted by changeing the beginning of the script.
Some functions were found in Matlab Central and their corresponding license is in their respective folders.</p
Théorie stochastique des réactions limitées par le transport
No full textPARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF
Coordination interne pendant la migration cellulaire
No full textWhen cells migrate, they need to coordinate multiple signaling pathways in space and time to orchestrate the dynamics of their cytoskeleton and the distribution of their internal organelles. Yet, it remains unclear how the different signaling programs are coupled, and to what extent a proper cell polarity is required for migration. Such questions are difficult to answer because of the numerous feedbacks in the cell signaling circuitry. During my thesis, using dynamic micropatterning, optogenetics, pharmacological and trafficking assays, and live-cell imaging, I found that a feedback between RhoGTPases’ biochemical gradients -that dictate local membrane activity- and cell internal organization -that defines the global polarity axis of the cell- allows cell migration to be persistent. I first demonstrated that Golgi complex positioning is instructive for the selection of the direction of movement using a well-controlled dynamic micropatterning assay. Second, by pharmacologically dispersing Golgi complex and disrupting polarized secretion, I showed that persistent migration breaks down and becomes random. Third, I found evidence that the Golgi orientation biases protruding activity, most likely by directing the secretion of adhesive molecules. Fourth, by applying sustained optogenetic perturbations, I proved that a localized Cdc42 RhoGTPase gradient is able to orient the Golgi complex. Taken together, I propose a model of persistent cell migration based on the coupling between protrusion dynamics, driven by RhoGTPases’ activities, and polarized secretion, biased by organelle positioning.Lorsque les cellules migrent, elles doivent coordonner de multiples voies de signalisation dans l'espace et le temps pour orchestrer la dynamique de leur cytosquelette et la distribution de leurs organites internes. Cependant, on ne sait pas encore très bien comment les différents programmes de signalisation sont couplés. Il est difficile de répondre à de telles questions en raison des nombreuses boucles de rétroaction dans les circuits de signalisation cellulaire. Au cours de ma thèse, en utilisant des expériences de micropatterning dynamique, d'optogénétique, de perturbations pharmacologiques, de trafic, ainsi que d'imagerie des cellules vivantes, j'ai découvert qu'une boucle de rétroaction entre les gradients biochimiques des RhoGTPases - qui dictent l'activité membranaire locale - et l'organisation interne de la cellule - qui définit l'axe de polarité global de la cellule - permet à la migration cellulaire d'être persistante. Premièrement, j'ai démontré que le positionnement de l’appareil de Golgi est instructif pour la sélection de la direction du mouvement. Deuxièmement, en dispersant l’appareil de Golgi et en perturbant la sécrétion polarisée, j'ai montré que la migration perd sa persistance et devient aléatoire. Troisièmement, j'ai avancé des preuves que l'orientation de l’appareil de Golgi biaise l'activité des protrusions membranaires. Quatrièmement, j'ai prouvé qu'un gradient localisé de la RhoGTPase Cdc42 est capable d'orienter l’appareil de Golgi. Au final, je propose un modèle de migration cellulaire persistante basé sur le couplage entre la dynamique des protrusions membranaires, et la sécrétion polarisée
Magnetic manipulation of intracellular signals
No full textIn the context of the MAGNEURON project we have developed magnetic tools to manipulate intracellular proteins involved in intracellular signaling processes. We focused on the manipulation of the subdomain DHPH of ITSN1 in order to control the activity of CDC42.
To control the activity of CDC42 we produced a fusion protein consisting in the DHPH domain of ITSN1, the mCherry fluorescent protein and a nanobody against GFP (aGFPnb).
The manipulations were done either using a magnetic tip or magnetic micropillars done with soft magnetic material (Nickel Iron alloy). Nanoparticles were first injected in the cytoplasm of the cell. After a delay of at least ten minutes, the survival of the cell was controlled and the manipulation could start.
We monitored the fluorescence of the reporter (IRFP-NWASP) and the formation of protrusion/filopodia as markers of a biological response to the manipulation.
We observed protrusion formation as well as NWASP activity when attracting the nanoparticles, but control experiments (Manipulation of particles without ITSN1-mcherry-aGFPnb) also showed increase of fluorescence of the NWASP reporter at the point of attraction of the particles.
In addition, if compared to optogenetic manipulation of the similar ITSN1-DHPH domain, the formation of protrusion was very limited. We concluded that magnetic manipulation of intracellular signals was not efficient to hijack signaling pathways.
We publish here the raw data of some experiments that were produced in the lab.
Each experiment has a README file describing the parameter of the recording and what can be observe on the video</p
Self-interference 3D localization microscopy in the near-infrared for deep tissue single-particle tracking
No full textLa microscopie de fluorescence a réussi à atteindre au cours de la dernière décennie la localisation super-résolutive d'émetteurs uniques avec de nombreuses applications en imagerie biologique. La localisation dynamique en 3D d’émetteurs et en profondeur dans des tissus biologiques vivants reste cependant un défi. Il y a quelques années, notre équipe a développé la méthode SELFI (self-interference 3D super-resolution microscopy), permettant la localisation 3D de molécules uniques dans des spécimens et des tissus multicellulaires dans le domaine de longueurs d’onde visibles. Dans cette thèse, nous étendons les capacités de SELFI dans la région du proche infrarouge (NIR) pour des études dynamiques, où la fluorescence des nanotubes de carbone monoparois (SWCNT) est intense. Les SWCNT sont en effet désormais utilisés comme sondes fluorescentes de mobilité des tissus biologiques en profondeur, car ils permettent une excellente pénétration des tissus, une faible diffusion de la lumière et une absorption réduite par les tissus. L'objectif de ce travail est ainsi de développer le SELFI NIR pour des applications de suivi de particules uniques utilisant les SWCNTs dans des tissus cérébraux vivants. SELFI utilise un réseau de diffraction placé sur le chemin optique de l'image de l'échantillon, générant un motif d'interférence sans étalement significatif de la distribution d’intensité de l’image d’émetteurs ponctuels. Une seule image obtenue avec SELFI NIR contient alors deux informations indépendantes : la distribution d'intensité pour extraire la super-localisation latérale de l’émetteur et la courbure du front d'onde (fournie par les interfranges) permettant d’obtenir la super-localisation axiale de l’émetteur. Pour adapter SELFI à la super-localisation de SWCNT uniques, nous avons conçu et mis en œuvre un système optique adapté à une émission dans le proche infrarouge. Les expériences réalisées montrent que la résolution 3D obtenue avec le SELFI NIR est d'environ 50 nm pour une émission autour de 985 nm. Nous avons ensuite effectué le suivi 3D de SWCNTs individuels à une fréquence vidéo dans des environnements complexes, dont des gels d'agarose, avant d’appliquer la méthode dans des tranches de cerveau organotypiques de rat.Fluorescence microscopy has achieved over the last decade super-resolution localization of single emitters with numerous applications in biological imaging. However, dynamic 3D localization of single emitters at depth in living biological tissues remains a challenge. A few years ago, our team developed the SELFI method (self-interference 3D super-resolution microscopy), allowing the 3D localization of single molecules in specimens and multicellular tissues in the visible wavelength range. In this thesis, we extend the applicability of SELFI in the near-infrared (NIR) region for dynamic studies, where the fluorescence of single-walled carbon nanotubes (SWCNT) is intense. SWCNTs are indeed now used as fluorescent probes for dynamic studies in deep biological tissue, as they allow excellent tissue penetration, low light scattering and reduced tissue absorption. The objective of this work is thus to develop NIR SELFI for single particle tracking applications using SWCNTs in living brain tissue. SELFI uses a diffraction grating placed in the optical path of the sample image, generating an interference pattern without significant spreading of the intensity distribution generated by the image of a point emitter. A single image obtained with NIR SELFI then contains two independent pieces of information: the intensity distribution to extract the lateral super-localization of the emitter and the curvature of the wavefront (provided by the interfringes) to obtain the axial super-localization of the emitter. To adapt SELFI to the super-localization of single SWCNTs, we designed and implemented an optical system adapted to near-infrared emission. The experiments performed allowed to obtain 3D resolutions of about 50 nm considering emitters at 985 nm. We then performed the 3D tracking of individual SWCNTs at video rate in complex environments, including agarose gels, before applying the method in organotypic rat brain slices
Manipulation de signaux intracellulaires à l'aide de nanoparticules magnétiques
No full textLes cellules captent des informations sur leur environnement en utilisant des récepteurs qui transmettent l’information au milieu intracellulaire. L’information est traitée par des protéines de signalisation qui in fine produiront un comportement cellulaire adapté. Dans ce travail nous proposons une méthode pour pirater ces signaux intracellulaires. Nous proposons d’utiliser des nanoparticules magnétiques pour cibler et déplacer des protéines intracellulaires. Ce contrôle magnetico-moléculaire fait parti du projet H2020 Magneuron qui prévoit le développement d’outils pour contrôler des cellules implanté chez des patients dans le contexte de la médecine régénérative pour la maladie de Parkinson. Dans cette maladie des neurones dopaminergiques qui connectent deux régions du cerveau sont manquant, et un soin curatif nécessite d’implanter des neurones dans la substancia nigra et de contrôler la croissance de leur axone en direction du striatum. Les manipulations magnétiques intracellulaires ont plusieurs avantages sur le papier. Tout d’abord les champs magnétiques traversent les tissues biologiques sans difficultés et avec peu d’interactions. Deuxièmement en agissant de manière intracellulaire il est possible d’agir de manière spécifique sur certaines cellules et de limiter les effets indésirables sur d’autres tissus. En utilisant des nanoparticules magnétiques nous avons ciblé les facteurs d’échange de guanines (GEF) qui sont les activateurs des petites Rho GTPases. Ces rhoGTPases ont différents rôles, entre autres le contrôle de la migration cellulaire et de la polarisation. Cette dernière est importante pour la formation des axones, tandis que la première est facilement observable dans les cultures cellulaires. Nous avons donc produit des expérimentation sur des cellules unique en culture, et nous avons pu contrôler la formation de protrusion de plusieurs micromètres en réaction à nos manipulation. Nous avons toutefois observé un certain nombres de limitations à notre technique et nous avons donc cherché à en comprendre les causes. Premièrement nous avons exploré l’environnement des particules, le cytoplasme. En utilisant différent type de particules nous avons dans la continuité de précédent travaux montré que les interactions non spécifiques jouent un rôle prépondérant dans le mode de diffusion de ces particules. Nous avons aussi montré que s’agissant de particules ayant peu d’interactions, la diffusion de ces particules est homogène dans tout les cytoplasme. Concernant les manipulations de nanoparticules magnétiques nous présentons un ensemble de données préliminaires pour tenter d’expliquer les limitations de notre technique.Cells are sensing their environment using receptor that transmit the information to the intracellular side where pathways of signaling molecules are processing the information to decide of their behavior. In our project we propose a new way to hijack these internal signals. We propose to use magnetic nanoparticles to target intracellular engineered protein and to move them in the cytoplasm. This magneto-molecular actuation on cells is part of the Magneuron H2020 project which intend on the long run to provide tools to control implanted cells in the context of regenerative medicine targeting the Parkinson disease. In this pathology neurons connecting two regions of the brains are lacking and a proper cure would need a way to implant cell in one of this location the substancia nigra, and to control the neurons to make them grow toward the striatum. Magnetic manipulation of intracellular proteins offer interesting characteristic on paper. First magnetic fields can go through tissue without limitation and have no interaction with biological structure. Second actuating intracellularly allow the highest specificity and will limit potential adverse effects on other cells. Thus using magnetic nanoparticles (MNPs) we targeted Guanine exchange factors (GEF) proteins which are known to be the activator of the Rho small GTPases. These RhoGTPases are playing many roles, and specially they can control cell migration and cell polarization. The later is very important during the axonal growth of neurons, the first one is easy to visualize in cell cultures. We produced sets of experiments showing that we could generate in single cell experiments protrusions of a few micrometers that are related to the activation of the RhoGTPases. As we also observed different limitation to our technic we studied the environment in which our particles are, and what could be the causes of these limitations. The environment of the particles is the cytoplasm, we explored how different particles interact with this environment and how it affect their diffusion. We also explored spatially if this environment is homogeneous. We showed that small particles (less than 70nm) diffuse can diffuse freely in the cell when they are properly passivated. Concerning the magnetic manipulation we present some preliminary data that start to explain why the technic is limited to activate intracellular signals
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