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New insight into translation during yeast programmed cell death
Full text linkTese de doutoramento em Ciências da SaúdeGlobal mRNA translation impairment has been described during the course of
apoptosis in both mammalian and yeast. Nevertheless, the molecular pathways
modulating translation during different scenarios of yeast apoptosis are still largely
unexplored. Here we show by polysome profile analysis an impairment in capdependent
translation initiation, correlated with alterations in translation
machinery, such as the decrease in eIF4A levels and the phosphorylation of eIF2
by Gcn2 protein kinase upon acetic acid treatment. Gcn2p proved to play a
preponderant role for the progression of the acetic acid-induced apoptosis, not only
through the repression of cap-dependent translation initiation, but also by the
induction of a cell cycle arrest in G0/G1 phase. Despite the observed impairment of
cap-dependent translation initiation, some mRNAs, such as AIF1 and eIF4G, were
translated during acetic acid treatment. eIF4G harbors an IRES in the 5’
untranslated region (5’UTR) of the mRNA allowing its translation by a capindependent
IRES-mediated translation, being also crucial for an efficient IRESmediated
translation of other mRNAs. The inhibition of the cap-dependent
translation initiation associated with the observation of AIF1 and eIF4G efficient
translation during acetic acid treatment made us question the possibility of an
alternative IRES-mediated translation occur during acetic acid treatment.
Furthermore, the translation machinery alterations proved to be dependent of
the yeast caspase like protease, metacaspase, which induced also the specific
fragmentation of the glycolytic enzyme glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
(GAPDH). Although metacaspase role in the induction of the apoptosis is well
established, its specific substrates were still unknown. The fact that GAPDH is
specifically cleaved by metacaspase, suggests a role of this enzyme in the
apoptotic process. In mammalian cells, GAPDH interacts with some virus and
cellular mRNAs repressing their internal ribosome entry site (IRES)-mediated
translation. GAPDH cleavage by caspase-1 during apoptosis suggests a regulation
of its function by derepression of the IRES-mediated translation.
Upon the inhibition of translation initiation during acetic acid treatment,
eEF1A, a translation elongation factor responsible for the delivery of aminoacyltRNAs to the ribosomes, appears to play a function unrelated to translation elongation. A proteomic analysis combined with a proteinase K assay showed that
upon acetic acid treatment, eEF1A is fragmented and the eEF1A N-terminal
fragments are present in mitochondria where they appear to play a pro-apoptotic
role. Apart from its role in translation this protein is also an actin-binding protein
being responsible for the actin cytoskeleton organization. This re-localization to
mitochondria reduces its binding to actin leading to actin cytoskeleton alterations
which proved to be conserved from yeast to mammalian cells.
Our previously reported proteomic analysis in the same apoptotic conditions
revealed an increased expression of heat shock protein 90 (HSP90) isoforms. We
herein demonstrate by microarray analysis of polysomal mRNAs combined with the
HSP90 isoforms 5’ untranslated region (5’UTR) expression in monocistronic
reporter plasmids harboring an hairpin, that HSP90 isoforms are translated by a
cap-independent mechanism mediated by (IRES) elements. Moreover, genetic
abrogation of HSP90 isoforms indicate divergent roles for HSP90 isoforms, Hsc82
acts as a pro-survival and Hsp82 as a pro-death molecule, upon the acetic acid
treatment. In fact, the deletion of HSC82 leads to a severe necrotic cell death, in
spite of an apoptotic cell death, upon acetic acid treatment. These undisclosed
functions of yeast HSP90 isoforms were confirmed through pharmacological
inhibition of HSP90 activity, using 17-allylaminogeldanamycin (17AGG), and by
the overexpression of each HSP90 isoform during acetic acid. These results
suggest that the efficiency of HSP90 isoforms mRNA translation is an important
component of the cellular response to acetic acid. In summary, the results
presented in the scope of this thesis contributed to the understanding of the
translation mechanisms regulating yeast cell death processes.A inibição global da tradução foi descrita no decurso da apoptose tanto em
leveduras como em mamíferos No entanto, as vias moleculares que modulam a
tradução em diferentes cenários de morte celular programada (MCP) em levedura
são ainda desconhecidas. Neste trabalho demonstramos, através de perfis
polissomais, uma inibição da iniciação da tradução dependente da estrutura cap,
correlacionada com alterações na maquinaria de tradução, tais como a redução
dos níveis de eIF4A e a fosforilação do eIF2 mediada pela cinase Gcn2p, durante
o tratamento com ácido acético. Gcn2p provou desempenhar um papel relevante
na progressão da morte induzida por ácido acético não só pela repressão da
iniciação da tradução dependente de cap mas também através da indução de um
bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1. Apesar da diminuição da iniciação da
tradução dependente de cap, alguns mRNAs, tais como o AIF1 e o eIF4G, são
traduzidos durante o tratamento com ácido acético. eIF4G possui um internal
ribosome entry site (IRES) na região 5' não traduzida (5'UTR) do mRNA o que
permite a sua tradução independente de cap, sendo também fundamental para a
tradução eficiente de outros mRNAs regulados por IRES. A inibição da iniciação da
tradução dependente de cap associada à observação da tradução de AIF1 e eIF4G
levanta a possibilidade da ocorrência de uma tradução alternativa mediada por
IRES durante o tratamento com ácido acético. Para além disso, as alterações na
maquinaria de tradução observadas durante o tratamento com ácido acético
parecem ser dependentes da ação da caspase de leveduras, a metacaspase, que
provou ser ainda responsável pela clivagem específica da enzima glicolítica
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Embora a importância da
metacaspase na execução da apoptose esteja bem estabelecida, os substratos
desta protease são ainda desconhecidos. O fato da GAPDH ser especificamente
clivada pela metacaspase, sugere um papel desta enzima no processo apoptótico.
Em mamíferos, a GAPDH interage com alguns mRNAs celulares e de vírus inibindo
a sua tradução mediada por IRES. A clivagem da GAPDH pela caspase-1 durante a
apoptose sugere uma regulação da sua função na tradução e a desrepressão da
tradução mediada por IRES. Após a inibição da iniciação da tradução durante o tratamento com ácido acético, o fator de elongação da tradução eEF1A,
responsável pela entrega dos aminoacil-tRNAs nos ribossomas, parece
desempenhar uma função independente do processo de tradução. Uma análise
proteómica em conjunto com um ensaio de proteinase K mostraram que, após o
tratamento das células com ácido acético, o eEF1A é fragmentado e os fragmentos
N-terminais de eEF1A são detetados na matriz mitocondrial onde parecem
desempenhar um papel pró-apoptótico. Para além da sua participação no processo
de tradução esta proteína está também associada à actina sendo responsável pela
organização do citoesqueleto de actina. A relocalização para a mitocôndria reduz a
sua ligação à actina induzindo alterações no citoesqueleto de actina que provaram
ser conservados tanto em levedura como em mamíferos.
Anteriormente, uma análise proteómica, nas mesmas condições apoptóticas,
revelou um aumento dos níveis das isoformas da proteína de choque térmico 90
(HSP90). A análise de microarrays dos mRNAs presentes em frações polissomais
complementada com a expressão dos 5’UTR das isoformas da HSP90 em
plasmídeos monocistrónicos contendo um gancho no 5’UTR, demonstrou a
presença de IRES no 5’UTR das HSP90 mediando a sua tradução independente de
cap. A deleção genética das isoformas das Hsp90 sugere que estas desempenham
funções divergentes durante o tratamento com ácido acético, Hsc82p atua como
uma molécula de sobrevivência e Hsp82p como uma molécula pró-apoptótica.
Além disso, a deleção da HSC82 conduz a uma drástica morte celular necrótica
durante o tratamento com ácido acético, sugerindo que estas isoformas são
cruciais para o balanço e equilíbrio entre a apoptose e a necrose. Estas novas
funções das isoformas da HSP90 foram confirmadas através da inibição
farmacológica da atividade das HSP90, utilizando 17-allylaminogeldanamycin
(17AGG), e da sobreexpressão de cada isoforma em células tratadas com ácido
acético. Estes resultados sugerem que a eficiência de tradução do mRNA das
isoformas da HSP90 é um componente importante da resposta celular ao ácido
acético. Em resumo, os resultados apresentados no âmbito desta tese contribuíram
para o aumento do conhecimento dos mecanismos de tradução que regulação processo apoptótico em levedur
Effect of senolytic anti-aging compounds in Down syndrome-driven senescence
Full text linkRESUMO:A Síndrome de Down é uma doença caracterizada por uma trissomia do cromossoma 21 (T21), com
milhares de novos casos reportados todos os anos. Com o desenvolvimento da tecnologia e da
medicina, a esperança de vida destes pacientes tem vindo a aumentar, tornando evidente uma
manifestação prematura de características e patologias do envelhecimento. A aneuploidia – um
número anómalo de cromossomas que resulta de uma incorreta segregação dos cromossomas
durante a divisão celular – tem sido correlacionada com várias características celulares do
envelhecimento, incluindo a senescência. A acumulação de células senescentes ao longo da idade
está na base do desenvolvimento de patologias do envelhecimento. Como tal, a senescência poderá
também contribuir para o envelhecimento prematuro em T21. Contudo, até ao presente, não existe
uma análise quantitativa da senescência em T21 ao longo da idade. Neste estudo usámos culturas
de fibroblastos humanos de dadores saudáveis e com T21 de diferentes idades e fizemos uma
análise quantitativa de vários marcadores de senescência. Observámos que todos os marcadores
indicam um aumento do número de células senescentes em culturas de T21 em comparação com
controlos saudáveis de idade semelhante. Para além disso, existe uma acumulação de senescência
em T21 com o avanço da idade, e acelerada em comparação com controlos saudáveis. Estabelecida
esta prevalência de senescência em T21, questionámos se o uso de senolíticos – compostos que
eliminam células senescentes de forma seletiva – se revelaria eficaz neste contexto de T21. Assim,
testámos uma combinação dos senolíticos Dasatinib e Quercetina. Observámos que este
tratamento diminuiu a quantidade de células senescentes em culturas de T21, para níveis
semelhantes aos dos respetivos controlos saudáveis. No entanto, verificou-se uma diminuição da
taxa proliferativa das culturas controlo e de T21, o que sugere que o tratamento ainda requer
ajustes em termos de concentração e duração. Em sumário, este estudo não só demonstra que
existe uma acumulação de senescência em T21, mas também que essa acumulação é prevalente ao
longo da idade e em comparação com controlos saudáveis. Adicionalmente, este estudo fornece
uma prova de conceito para o potencial uso terapêutico de senolíticos na prevenção de
características prematuras de envelhecimento associadas à trissomia 21.ABSTRACT: Down Syndrome (DS) is a disease characterized by a trisomy of chromosome 21, with thousands of
new cases being reported every year. With the development of technology and medicine, life
expectancy for these patients has been steadily increasing, making noticeable the development of
premature age-related features and pathologies. Aneuploidy – an abnormal number of
chromosomes resulting from chromosome mis-segregation during cell division – has been
associated with several cellular phenotypes, including senescence. In recent years, evidence has
pointed to the accumulation of senescent cells along aging as a major reason for the development
of several age-associated diseases. This suggests that senescence accrual might contribute to the
premature aging phenotypes of DS. However, quantitative analysis of senescence in DS along
advancing age is missing so far. To fill this gap, we used human fibroblast cultures from differently
aged DS and healthy donors and performed quantitative analysis of several senescence markers.
We found that, for all markers, the number of senescent cells in DS cultures was higher when
comparing to euploid age-matched counterparts. Moreover, aging was also accompanied by
senescence accrual in both healthy and trisomic fibroblasts. Having established the senescence
prevalence in DS, we asked whether the use of senolytics – compounds that selectively eliminate
senescent cells – could prove efficient in this context. To this end, we treated the cells with a
combination of the well-established senolytic compounds, Dasatinib and Quercetin. We observed
that this therapeutical approach decreased the senescence load measured through distinct markers
in DS cultures to equivalent levels of euploid counterparts. However, this was accompanied by an
impairment in proliferative capacity in both healthy and DS cultures, suggesting that the treatment
might need concentration and duration adjustments. This study not only shows that cellular
senescence prevails in DS patient-derived cell cultures, but also that it aggravates with advancing
age. Furthermore, the study suggests senolysis as a potential therapy to prevent or delay the onset
of progeroid clinical features associated with trisomy 21, eventually extending DS patients’
healthspan
Age-dependent sensitivity to anti-mitotics: the role of FoxM1 and its therapeutic potential
No full textDissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Oncogenic transcription factor FoxM1 is overexpressed in the majority of human cancers. Emerging data suggest that targeting FoxM1 in mono- or combination therapy may have promising therapeutic benefits for the treatment of cancer. FoxM1 expression is associated with the proliferative capacity of the cell, consistently with its role in primarily driving the expression of G2/M specific genes, with associated phenotypic expression of mitotic defects and chromosome aberrations when defective. Using high-resolution live cell imaging to observe individual cell behavior, we found that human elderly dermal fibroblasts reproduce the mitotic defects of FoxM1 repression. In agreement, expression of FoxM1 and its downstream targets decreases progressively with chronological ageing, suggesting it counters senescence. Importantly, we also perceived that old fibroblasts are sensitized to cell death when treated with anti-mitotic drugs commonly used in chemotherapy. Therefore, we not only depleted FoxM1 in young cells but also overexpressed a constitutively active form of FoxM1 in old cells, to follow their cell fate upon anti-mitotic drug treatment. Our results indicate that FoxM1 downregulation accounts for the increased sensitivity to anti-mitotics in aged cells. Therefore, a combinatorial treatment using FoxM1 inhibition plus microtubule poisons was tested and our data suggest a pro-apoptotic efficacy against tumor cells overexpressing FoxM1.O fator de transcrição oncogénico FoxM1 é sobre-expresso na maioria dos cancros humanos. Dados recentes sugerem que a inibição de FoxM1 em terapia mono- ou combinada pode ter benefícios terapêuticos promissores para o tratamento de cancro. A expressão de FoxM1 está associada com a capacidade proliferativa da célula, o que é consistente com a sua função principal de promover a expressão de genes G2/M. A repressão de FoxM1 induz uma manifestação fenotípica de defeitos mitóticos e aberrações cromossómicas. Usando microscopia de alta resolução para aquisição de imagens de células vivas e observação do comportamento individual de células, descobrimos que fibroblastos dérmicos humanos idosos reproduzem os defeitos mitóticos de repressão de FoxM1. Consistentemente, a expressão de FoxM1 e de genes alvo diminui progressivamente com a idade cronológica, sugerindo uma função do FoxM1 na prevenção da senescência celular. Relevantemente, observámos também que os fibroblastos de idade avançada são mais sensíveis à morte celular em mitose quando tratados com drogas anti-mitóticas comummente usadas em quimioterapia. Deste modo, diminuímos os níveis de FoxM1 em células jovens e sobre-expressámos uma forma constitutivamente ativa de FoxM1 em células velhas, e seguimos o seu destino celular após tratamento com drogas anti-mitóticas. Os nossos resultados indicam que a redução dos níveis de FoxM1 é responsável pelo aumento da sensibilidade aos anti-mitóticos em células idosas. Finalmente, testámos um tratamento combinado usando inibição de FoxM1 e drogas anti-mitóticas e os nossos dados sugerem uma eficácia pró-apoptótica contra células cancerosas que sobre-expressam FoxM1
Ataxina-3 de C. elegans: função, perda de função e parceiros moleculares
Full text linkTese de doutoramento em Ciências da Saúde (especialização em Ciências Biológicas e Biomédicas)Ataxin-3 is the protein involved in Machado-Joseph Disease, one of the nine polyglutamine (polyQ) disorders identified to the date. These are characterized by a polyQ expansion in the corresponding proteins, the presence of ubiquitylated inclusions and selective neuronal death. Although a toxic gain of function has been proposed as the common pathogenic mechanism underlying ali these diseases, it is believed that partial loss of the normal function of the proteins may also contribute and modulate disease progression.
Human ataxin-3 binds ubiquitin, ubiquitylated substrates, is a deubiquitylating (DUB) enzyme in vitro which suggests a role in the ubiquitin-proteasome pathway (UPP). Ataxin-3 is also able to bind to histones and transcriptional repressor complexes hinting a link with transcriptional repression.
In this study, we explored the function, loss of function and molecular partners of the C. elegans ataxin-3 orthologue, ATX-3. We found that the worm protein is highly similar to the human protein at a sequence and structural level and has DUB activity in vitro as the counterpart. We showed that ATX-3 is expressed in several cell types (neurons, muscle, spermatheca, intestinal cells) and from embryonic stages until adulthood. Considering the proposed role for ataxin-3 in transcriptional repression and also in order to analyze the physiological effects of the absence of ATX-3, we analyzed two C. elegans ATX-3 knockout strains, the first models of ataxin-3 deficiency to be characterized. These animals are viable and with no overt phenotype in basal conditions, although they show a distinct transcriptomic profile, with several genes altered in the two mutant strains.
We identified several ataxin-3 interactors and characterized more extensively some of them. Of these, some were already known as VCP/p97 (CDC-48 in worms), alpha-tubulin and HSP-90 (DAF¬21 in worms). Of the novel interactors, a large proportion were structural/cytoskeletal proteins, muscular proteins and components of the UPP.
As an example, we characterized a novel trimolecular complex formed by ATX-3, the CDC-48 and the UBXN-5 protein, which is probably involved in the shuttling of ubiquitylated proteins to the proteasome. Additionally, we also identified some potential targets of this complex.
Another ataxin-3 interactor is the ubiquitin-Iike protein Nedd8, and it is known that human ataxin-3 has deneddylase activity. Although we showed that this interaction is conserved in worms, we did not observe any differences in the global neddylation pattern of ATX-3 mutants, therefore the biological relevance of this interaction remains unanswered.
We also analyzed the effects of ATX-3 absence in muscle and found that paramyosin (UNC-15) was accumulating in ATX-3 mutants at a stress-treshold situation, 25°C. This accumulation seemed to occur due to inefficient degradation of UNC-15 in ATX-3 knockout animals. Even though the muscle of these animais was apparently normal at a structural level, they showed a significant motility defect at 25°C, suggesting that ATX-3 has a Iink with muscle maintenance and/or function.
Considering the role of ataxin-3 in the protein degradation pathway, we studied the ATX-3 mutants in a situation where the protein homeostasis was compromised, i.e. after an heat insult. In this situation, the ATX-3 mutants were significantly more resistant to heat stress than wild type. This phenotype was explained by the upregulation of several chaperone proteins, as analyzed by proteomic studies.
Lastly, we showed that both human and worm interact with alpha-tubulin and are microtubule-associated proteins. Concordant with a role of ataxin-3 in cytoskeleton, cells with low ataxin-3 expression have an abnormal cell shape, reduced cell-cell interconnectivity and a clear cytoskeletal disorganization, the intermediate filament and the microtubule networks being severely compromised.
In summary, this work provided new c1ues about ataxin-3 biological function and pathways where it is involved. It reinforced ataxin-3' s involvement with the UPP and it also raised new hypotheses for its role in cytoskeleton organization and in muscle maintenance.Ataxina-3 é a proteína envolvida na Doença de Machado-Joseph, uma das nove doenças de poliglutaminas (poliQ) identificadas até à data. Este grupo de doenças é caracterizado por uma expansão de poliQ nas proteínas correspondentes, pela presença de inclusões ubiquitiladas e morte neuronal específica. Apesar de ser proposto que um ganho tóxico de função é o mecanismo patogénico destas doenças, a perda parcial da função normal das proteínas também pode contribuir e modular a progressão da doença.
A ataxina-3 humana liga-se a ubiquitina, a substratos ubiquitilados e é uma ubiquitina hidrolase in vitro, sugerindo um papel na via ubiquitina-proteassoma (UPP). A ataxina-3 também é capaz de se ligar a histonas e a complexos repressores da transcrição, indicando uma possível associação com a repressão da transcrição.
Neste estudo, explorámos a função, a perda de função e os parceiros moleculares do ortólogo da ataxina-3 em C. elegans, ATX-3. Descobrimos que a proteína do nemátode é muito similar à humana a nível de sequência e estrutura, e, tal como a ataxina-3 humana, possui actividade de ubiquitina hidrolase in vitro. Demonstrámos que a ATX-3 é expressa em vários tipos de células (neurónios, músculo, espermateca, células intestinais) e desde estadios embrionários até à fase adulta. Considerando o papel da ataxina-3 na repressão da transcrição, e também de forma a analisar os efeitos fisiológicos da sua ausência, estudámos duas estirpes knockouts para a ATX-3 em C. elegans, os primeiros modelos a serem caracterizados com deficiência em ataxina-3. Estes animais são viáveis e não possuem fenótipo visível em condições fisiológicas normais, no entanto apresentam um perfil transcriptómico distinto, com vários genes alterados nas duas estirpes knockouts.
Identificámos vários parceiros moleculares da ataxina-3 e caracterizámos mais extensivamente alguns deles. Dos interactores identificados, alguns já eram conhecidos, tais como a VCP/p97 (CDC-48 nos nemátodes), alfa-tubulina e HSP90 (DAF-21 em C. elegans). Dos novos interactores, uma grande percentagem eram proteínas estruturais ou do citosqueleto, proteínas musculares e componentes da UPP.
Caracterizámos um novo complexo trimolecular formado por ATX-3, CDC-48 e a proteína UBXN-5, que provavelmente está envolvido na translocação de proteínas ubiquitiladas para o proteassoma. Adicionalmente, também identificámos possíveis alvos deste complexo.
Outro interactor da ataxina-3 é a proteína tipo ubiquitina Nedd8, e é sabido que a ataxina-3 humana tem actividade de desnedilase. Apesar de mostrarmos que esta interacção é conservada em C. elegans, não observarmos diferenças no padrão geral de nedilação nos mutantes para a ATX-3, por isso o significado biológico desta parceria permanece obscuro.
Também analisámos os efeitos da ausência da ATX-3 no músculo, e descobrimos que a paramiosina (UNC-15) estava aumentada nos mutantes ATX-3 numa condição de crescimento a 25°C. O aumento de UNC-15 parecia ser causado por uma degradação ineficiente desta proteína. Apesar do músculo deste animais ser aparentemente normal a nível estrutural, eles têm um deficit motor a 25°C, incitando que a ATX-3 tem uma associação com a manutenção e/ou função do músculo.
Considerando o papel da ataxina-3 na via de degradação de proteínas, examinamos os mutantes ATX-3 numa situação fisiológica onde a homeostasia celular proteica estava comprometida, i.e., após um choque térmico. Os mutantes ATX-3 são mais termoresistentes que os animais selvagens. Este fenótipo pode ser explicado pela sobreexpressão de várias chaperones moleculares, como confirmado pelos estudos de proteómica quantitativa.
Por fim, mostrámos que a ataxina-3 humana e do nemátode interactuam com a alfa-tubulina e que se ligam aos microtúbulos in vitro. Condizente com uma possível função da ataxina-3 no citosqueleto, células com níveis baixos de ataxina-3 têm uma forma celular anormal, uma conectividade intercelular reduzida, e uma desorganização do citosqueleto grave, com os filamentos intermédios e os microtúbulos completamente comprometidos.
Em sumário, este trabalho originou diversas pistas acerca da função biológica da ataxina-3 e vias onde está envolvida. Confirmou o envolvimento da ataxina-3 com a UPP e também levantou novas hipóteses acerca do seu envolvimento na organização do citosqueleto e na manutenção do músculo.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - SFRH/BD/17066/2004, projecto POCTI/SAU-MMO/60412/2004 e PTDC/SAU-GMG/64076/2006Portuguese-American Foundation for Development (FLAD) - projecto 582-99Fundação Calouste GulbenkianNational Ataxia Foundation (NAF
Estudo da Função Mitótica da Proteína Cep57 Humana na Regulação das Interacções dos Microtúbulos com os Centrossomas e Cinetocoros
No full textDissertação de Mestrado em Genética Molecular, Comparativa e TecnológicaA distribuição equitativa dos cromossomas durante a divisão celular é essencial à viabilidade do organismo. Erros na segregação dos cromossomas estão na origem da aneuploidia associada a doenças do recém-nascido e tumorigénese. Deste modo, é fundamental a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na fidelidade da segregação cromossómica.
A separação dos cromossomas durante a mitose requer a formação de uma estrutura simétrica bipolar, designada fuso mitótico, que é formada por microtúbulos nucleados a partir dos centrossomas em células animais. Os cromossomas são ligados ao fuso através da interacção dos cinetocoros com os microtúbulos. Existe um elevado número de proteínas associadas ao fuso, centrossomas e cinetocoros que regulam a bipolaridade, os movimentos cromossómicos e a fidelidade da segregação.
A proteína xCep57 foi previamente caracterizada em Xenopus como uma proteína adaptadora das ligações dos microtúbulos aos centrossomas e cinetocoros. A imunodepleção desta proteína num sistema in vitro de extractos de oócitos compromete a estrutura do fuso, o alinhamento dos cromossomas e a estabilidade das ligações cinetocoro-microtúbulo e centrosoma-microtúbulo. Consistentemente, esta proteína interactua com proteínas cinetocorianas reguladoras das ligações ao fuso bem como a γ-tubulina que faz parte dos anéis de nucleação de microtúbulos nos centrossomas.
Tem sido questionada a possibilidade da xCep57 ser o homólogo funcional da proteína Dam1 de levedura, para a qual foi demonstrado um papel fulcral na acoplagem da ligação do cinetocoro aos microtúbulos dinâmicos. Existe assim grande expectativa quanto à identificação de um homólogo em eucariotas superiores de função determinante na regulação dos movimentos cromossómicos e fidelidade de segregação.
Neste trabalho, partiu-se para um estudo funcional da proteína Cep57 humana com recurso à metodologia de RNA de interferência (RNAi) e microscopia de fluorescência confocal, com o objectivo de se caracterizar a função desta proteína num sistema in vivo através da sua repressão específica por RNAi. Verificou-se por imunofluorescência que a proteína Cep57 se localiza nos centrossomas em interfase e mitose, mas não se detectou nos cinetocoros. Também se demonstrou que a proteína Cep57 se liga directamente a microtúbulos in vitro. A análise do fenótipo mitótico de células depletadas de Cep57 por RNAi revelou a existência de problemas no alinhamento dos cromossomas na placa metafásica e na organização do fuso mitótico. As ligações cinetocoro-microtúbulos estão significativamente comprometidas e a distância interpolar está diminuída. No entanto, ao contrário dos resultados anteriormente descritos que apontam para a interacção de xCep57 com as proteínas cinetocorianas Zwint e Mis12, neste estudo não se observou a diminuição destas proteínas no cinetocoro de células RNAi-depletadas. Deste modo, o fenótipo mitótico observado parece resultar de uma função da proteína Cep57 no centrossoma e não no cinetocoro, possivelmente, e em particular, na ancoragem dos microtúbulos aos centrossomas. Curiosamente, através de um estudo in silico, descobriu-se a existência de um segundo homólogo de xCep57 em humano e em ratinho. Deixa-se assim em aberto a questão de, em humano, poderem existir duas proteínas homólogas de xCep57 com função acopladora aos microtúbulos, actuando uma nos centrossomas (provavelmente a Cep57 aqui descrita) e outra nos cinetocoros. Estudos futuros centrar-se-ão no esclarecimento desta questão.The equal distribution of chromosomes during cell division is essential to the viability of the organism. Errors in chromosome segregation are the cause of aneuploidy associated with diseases of the newborn and tumorigenesis. Thus, it is essential the understanding of the molecular mechanisms involved in the fidelity of chromosome segregation.
The separation of chromosomes during mitosis requires the formation of a symmetric bipolar structure, called spindle, which is formed by microtubules nucleated from centrosomes in animal cells. Chromosomes are attached to the spindle through interaction of the kinetochores with microtubules. There are a large number of proteins associated with the spindle, centrosomes and kinetochores governing spindle bipolarity, chromosome movement and the fidelity of chromosome segregation.
xCep57 protein was previously characterized in Xenopus as an adapter of the connections of microtubules to the centrosomes and kinetochores. Immunodepletion of this protein in an in vitro system of oocyte extracts compromises the structure of the spindle, the alignment of chromosomes and stability of kinetochore-microtubule as well as centrosome-microtuble connections. Consistently, this protein interacts with regulatory kinetochore proteins linked to the spindle and γ-tubulin which is a main component of the nucleation rings of microtubules at centrosomes.
It has been called into question the possibility of xCep57 be the functional homolog of the Dam1 yeast protein, for which a central role in coupling the attachment of kinetochore to dynamic microtubules has been shown. Thus, there are great expectations to the identification of a homolog with decisive role in regulating the movement and fidelity of chromosome segregation in higher eukaryotes.
In this work, a functional study of the human protein Cep57 has been carried out in an in vivo system using the RNA interference (RNAi) methodology and confocal microscopy analysis. It was found by immunofluorescence that the Cep57 protein is located in centrosomes during both interphase and mitosis, but could not be detected in kinetochores. It was also demonstrated that the protein Cep57 binds directly to microtubules in vitro. Phenotypic analysis of Cep57 RNAi-depleted mitotic cells revealed the existence of chromosome alignment and spindle defects. The kinetochore-microtubule connections are significantly compromised and the interpolar distance is decreased. Futhermore, the kinetochore localization of known interactors of xCep57 is not altered in Cep57 RNAi-depleted cells consistently to the fact that human Cep57 could not be detected at kinetochores. Thus, overall, the mitotic phenotype observed seems to result from a centrosomal function of Cep57, possibly in microtubule anchorage to centrosomes. Interestingly, through an in silico study, we found the existence of a second homolog of xCep57 in human and mouse. Therefore, an open question remains whether both xCep57 protein homologues in human and mouse have a function in microtubule attachment, with Cep57 described here acting at the centrosome level and the other Cep57-related protein perhaps acting at the kinetochore level. Future studies will be focused on addressing this question
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Melhoria de marcas de envelhecimento através da marcação epigenética mitótica
No full textDissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaThe global population is experiencing an irreversible demographic transition characterized by an increase of the aging population, posing significant challenges for healthcare and social systems. Research in aging has therefore become increasingly relevant as a means of improving health and quality of life. Among the hallmarks of aging are epigenetic alterations, which play a key role in aging-related diseases. However, the underlying mechanisms and reasons for these changes are not yet fully understood. One possibility is the loss of epigenetic memory, associated with spatial genome disorganization. Histone H3 lysine 9 dimethylation (H3K9me2) is a conserved, specific mark of nuclear peripheral heterochromatin that is retained through mitosis. During mitosis, phosphorylation of H3 on serine 10 (H3K9me2S10ph) temporarily shields the H3K9me2 mark allowing for dissociation of chromatin from the nuclear periphery, and dephosphorylation of S10 before mitotic exit allows re-association with the forming nuclear lamina. In fact, progeroid and aged cells are characterized by nuclear lamina abnormalities and impaired mitotic function, so we hypothesize that the H3K9me2-mediated 3D architectural mitotic guidepost may be disrupted during aging. Moreover, our group recently demonstrated that transgene induction of the transcription factor Forkhead box M1 (FOXM1) and small-molecule enhancement of the major microtubule-depolymerizing activity mediated by KIF2C rescue several cellular aging hallmarks, namely epigenetic shifts and nuclear morphology. Altogether, this raised the hypothesis that these novel senomorphic strategies may rescue peripheral heterochromatin organization and epigenetic bookmarking inheritance in aged cells. Using high-resolution microscopy, we found a decrease in global H3K9me2 levels and a loss of compartmentalization at the nuclear periphery in elderly and progeroid mouse and human fibroblasts (MAFs and HDFs, respectively). Interestingly, KIF2C small-molecule and FOXM1 transgene inductions could rescue the spatial positioning of H3K9me2 in interphasic nucleus. Furthermore, in elderly MAFs, H3K9me2 bookmarking appeared to be deregulated during mitosis since there is a loss of H3K9me2S10ph. FOXM1 transgene induction improves the ‘phospho-methyl’ switch, by increasing the levels of H3K9me2S10ph. The primary results of this study highlight the role of H3K9me2 in aging and progeroid syndrome and the potential therapeutic implications. These findings have deepened the mechanistic understanding of how epigenetic changes arise during aging and unveiled startling reprogramming strategies with translational potential.A população mundial está a enfrentar uma transição demográfica irreversível caracterizada por um aumento da população envelhecida, desafiando os sistemas de saúde e sociais. A investigação no campo do envelhecimento tem, por isso, vindo a tornar-se cada vez mais relevante como forma de melhorar a saúde e a qualidade de vida destes indivíduos. Entre as principais características do envelhecimento estão as alterações epigenéticas, que desempenham um papel fundamental nas doenças relacionadas com o envelhecimento. No entanto, os mecanismos subjacentes e as razões para estas alterações ainda não são totalmente compreendidos. Uma possibilidade é a perda de memória epigenética, associada à desorganização espacial do genoma. A dimetilação da histona H3 no resíduo 9 de lisina (H3K9me2) é uma marca específica e conservada da heterocromatina periférica nuclear que se mantém durante a mitose. Durante a mitose, a fosforilação da H3 na serina 10 (H3K9me2S10ph) protege temporariamente a marca H3K9me2, permitindo a dissociação da cromatina da periferia nuclear, e a desfosforilação da S10 antes da saída da mitose permite a reassociação com a lâmina nuclear em formação. De facto, células progeróides e células envelhecidas são caracterizadas por alterações na lâmina nuclear e por uma função mitótica comprometida, que nos levou à hipótese de que a regulação da arquitetura genómica 3D mediada pela H3K9me2 pode estar comprometida durante o envelhecimento. Além disso, o nosso grupo demonstrou recentemente que a indução transgénica do fator de transcrição Forkhead box M1 (FOXM1) e o aumento da atividade de KIF2C responsável despolimerização de microtúbulos, melhoram várias características do envelhecimento celular, nomeadamente alterações epigenéticas e morfologia nuclear. Tais descobertas permitiram-nos formular a hipótese de que estas novas estratégias senomórficas podem recuperar a organização periférica da heterocromatina e a herança epigenética em células envelhecidas. Usando microscopia de alta resolução, descobrimos uma diminuição nos níveis globais de H3K9me2 e uma perda de compartimentalização da periferia nuclear em fibroblastos de murganhos e humanos envelhecidos ou progeróides (MAFs e HDFs, respetivamente). Curiosamente, a indução de KIF2C e do transgene FOXM1 restabeleceu o posicionamento espacial de H3K9me2 em núcleos interfásicos. Para além disso, em MAFs envelhecidos, a marcação de H3K9me2 parece estar desregulada durante a mitose, uma vez que se verificou uma perda de H3K9me2S10ph. A indução do transgene FOXM1 melhora a interação "fosfo-metil", através da subida dos níveis de H3K9me2S10ph. Os principais resultados deste estudo realçam o papel da H3K9me2 no envelhecimento e na síndrome progeróide, tal como as suas potenciais implicações terapêuticas. Estas descobertas aprofundaram a compreensão mecanicista de como as alterações epigenéticas surgem durante o envelhecimento e revelaram estratégias de reprogramação com potencial translacional.FC
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