1,721,056 research outputs found
The importance of the intramembrane protease SPPL2a for the development of murine B lymphocytes
Get PDFIn dieser Arbeit wurde die physiologische Bedeutung der Intramembranproteasen Signal peptide peptidase like 2a und 2b (SPPL2a und SPPL2b) mit Hilfe SPPL2a- und SPPL2b-defizienter Mäuse untersucht. Die invariante Kette (CD74), ein Chaperon von MHCII Molekülen, konnte als erstes in vivo validiertes Substrat von SPPL2a identifiziert werden. Aufgrund fehlender Intramembranproteolyse von CD74 in SPPL2a-defizienten B-Lymphozyten kommt es zur Akkumulation eines N-terminalen Fragmentes von CD74. Die Auswirkungen dieser Akkumulation auf die Entwicklung und Funktionalität der B-Zellen und die humorale Immunantwort werden beschrieben
Massenspektrometrie basierte Bioanalytik an Modellorganismen
Get PDFThe aim of this work was both the development and application of mass spectrometry (MS) based analytical methods for the investigation of biological research questions on model organisms. The primary focus was on the relative-quantitative proteome analysis by mass spectrometry. A secondary technological aspect of import was the separation of biomolecules by high-performance liquid chromatography (HPLC). The efficient fractionation and separation of complex peptide mixtures form enzymatic full-proteome digests is essential to facilitate a comprehensive mass spectrometric proteome analysis. The combination of HPLC and MS (LC-MS) was applied in the three projects of this thesis.Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Anwendung massenpektrometrischer Analysemethoden zur Untersuchung biologisch relevanter Fragestellungen an Modellorganismen. Im Vordergrund stand dabei die relativ-quantitative Proteomanalyse. Als sekundäre Technologie war die mehrdimensionaler Flüssigkeitschromatographie ein Schwerpunkt der Arbeit. Um eine möglichst umfassende massenspektrometrische Analyse komplexer, aus Vollproteom-Isolaten hergestellter Peptidlösungen zu gewährleisten, ist eine effiziente Fraktionierung und Auftrennung der Probe essentiell. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Kombination mit Massenspektrometrie (LC-MS) wurde in den drei Teilprojekten dieser These angewandt
Exploring mechanisms of C. elegans microbiota-mediated protection
Get PDFAnimals and microorganisms live together, forming a network of associations between animal hosts and their resident microorganisms, the microbiota. One important beneficial microbiota function is protecting the host against pathogen infection, termed microbiota-mediated protection. Many studies describe microbiota-mediated protection in animals; however, the underlying mechanisms remain mostly elusive. In my Ph.D. thesis project, I investigated mechanisms of microbiota-mediated protection in the nematode model Caenorhabditis elegans.
To understand microbiota-mediated protection mechanisms, I first identified C. elegans natural microbiota isolates that protect the host against infection with Bacillus thuringiensis. Then, I explored the underlying mechanisms of protection by these microbiota isolates both from the bacterial and the host side. On the bacterial side, I showed that: 1) Some microbiota isolates can protect the host by directly inhibiting pathogen growth via massetolide E production, a lipopeptide of the viscosin group, while others protect the host without producing massetolide E. 2) Microbiota isolates can produce biofilm in vitro, suggesting biofilm formation as a potential protection mechanism, which merits in vivo investigation. 3) Microbiota isolates cannot protect against B. thuringiensis toxins (Cry21Aa3 and Cry14Aa2) and are rendered pathogenic under certain pathogen exposure conditions, revealing the context-dependent dual nature of microbiota protective function. Moreover, in collaboration with colleagues, we characterized a more extensive selection of natural microbiota isolates of C. elegans and elucidated their metabolic contribution to the host using whole-genome sequencing, mathematical modeling, and experimentation. We showed that C. elegans microbiota could synthesize all the essential vitamins and amino acids needed by the nematode, reinforcing its beneficial role to the host.
On the host side, I used a multi-omics approach to identify host genes and pathways required for microbiota-mediated protection. To this end, I obtained transcriptomic and proteomic datasets of the infected and uninfected worms treated or untreated with the protective microbiota isolates. I showed that: 1) Protective microbiota isolates influence the worm's innate immune response and cellular structural component functions. 2) Microbiota isolates induce changes in expression and abundances on both gene and protein levels, respectively, for galectins, C-type lectins, and lysozymes, suggesting their potential roles in microbiota-mediated host protection. Altogether, these findings indicate microbiota-mediated activation of innate immune response genes, suggesting that the microbiota isolates ‘prime’ the C. elegans immune response, increasing host preparedness for subsequent pathogen attack.
Overall, the findings of this thesis provide valuable insights into mechanisms of microbiota-mediated protection on the bacterial and host sides, expanding our understanding of host-microbe interactions
Aufklärung der Tertiärstruktur der antimikrobiellen Peptide Alvinellacin und Theromacin mit Hilfe der NMR-Spektroskopie
Get PDFIn der vorliegenden Arbeit wurden die Tertiärstrukturen der antimikriobiellen Peptide (AMP) Alvinellacin und Theromacin mit Hilfe der NMR-Spektroskopie aufgeklärt.
Alvinellacin wurde in der Arbeitsgruppe von A. Tasiemski (Laboratoire de Neuroimmunologie et Neurochimie Evolutive, Université de Lille, Frankreich) entdeckt. Es stellt das erste AMP dar, dessen mRNA aus dem Pompejiwurm Alvinella pompejana isoliert wurde.
Die Tertiärstruktur von Alvinellacin zeigt eine G-förmige Konformation, welche aus random coil-Strukturelementen gebildet wird. Die in der Primärstruktur vorhandenen vier Cysteine bilden zwei Disulfidbrücken.
Auf Grund der analogen Primärstruktur von Alvinellacin, Arenicin-1 und Arenicin-2 wurde ein struktureller Vergleich der Tertiärstrukturen durchgeführt. Es konnte keine Analogie in der Tertiärstruktur der drei antimikrobiellen Peptide festgestellt werden. Daraufhin wurde ein Vergleich von Tertiärstrukturen kleiner Peptide durchgeführt. Dabei konnte eine strukturelle Analogie zu einem Toxin, dem ω-Conotoxin MVIIC, aus der Meeresschnecke Conus magus festgestellt werden. Das ω-Conotoxin MVIIC wird in die Familie der Conotoxine aus der Superfamilie der Omega-Toxin-ähnlichen Proteine eingeordnet. Die Tertiärstruktur von ω-Conotoxin MVIIC weist random coil-Sekundärstrukturelemente auf. Keine der drei Cysteinbrücken des ω-Conotoxins MVIIC weist eine ähnliche Position im Molekül, wie die von Alvinellacin, auf. Die einzigen Conotoxine, welche zwei Disulfidbrücken aufweisen, sind die α-Conotoxine. Diese Toxine weisen keine strukturelle Analogie zu Alvinellacin auf.
Das zweite in der vorliegenden Arbeit charakterisierte AMP, Theromacin aus Hirudo medicinalis, weist eine Analogie in der Primärstruktur zu einem antimikrobiellen Peptid aus Hydra vulgaris, Hydramacin-1, auf. Dieses gehört zur Superfamilie der Skorpion-Toxin-ähnlichen Proteine. Die Tertiärstrukturen der Mitglieder dieser Superfamilie zeigen ein Cystein-stabilisiertes α-Helix/β-Faltblatt-Motiv. Dieses CSα/β-Motiv konnte bei der Aufklärung der Tertiärstruktur von Theromacin ebenfalls identifiziert werden. Das CSα/β-Motiv besteht aus einer α-Helix, die durch zwei Disulfidbrücken mit einem Strang des antiparallelen β-Faltblattes verbunden ist. Eine weitere Disulfidbrücke verbindet den zweiten Strang des β-Faltblattes mit dem N-Terminus. Bei einem Vergleich der Strukturen von repräsentativen Mitgliedern dieser Superfamilie konnte festgestellt werden, dass die höchste Analogie zu Hydramacin-1 besteht. Beide weisen eine zweite α-Helix auf, welche in der Tertiärstruktur der anderen Mitglieder dieser Superfamilie nicht vorkommt. Im Weiteren konnte festgestellt werden, dass eine Disulfidbrücke aus dem Cystein Knot sich in einer anderen Position befindet, als die vergleichbare Disulfidbrücke der anderen Mitglieder. Theromacin stellt somit ein weiteres Mitglied der Macin-Familie dar
Molecular Characterisation of Antimicrobial Arsenal of Dictyostelium discoideum
Get PDFIn Entamoeba histolytica, Amoebapores and lysozymes are known to confer antimicrobial functions. The structure and functions of Amoebapores and lysozymes are evolutionally conserved, as evidenced by their analogous in many other organisms. Amoebapores and its structural counterparts have five α-helices that are connected by disulfide bonds, involving cysteine residues. Any protein with this typical structure is categorised under the SAPLIP family (Saposin-like protein) and the domain is called SAPLIP domain. SAPLIPs are known for their diverse cellular functions. The Amoebapores (M Leippe 1997) from E. histolytica and their structural and functional analogues, NK-lysin (porcine) and granulysin (human) are known for their antimicrobial and cytolytic functions. By contrast, the name giving Saposins (human) are necessary for lipid metabolism. Dictyostelium discoideum, has a multi-protein complex in which one component, called countin has a SAPLIP domain. Countin is required for aggregate size determination during development. Earlier work in our laboratory has found that the D. discoideum genome harbours 17 genes, which encode for 33 putative Amoebapore-like peptides (Apls). In addition, the D. discoideum genome comprises 15 genes coding for four different classes of lysozymes. These classes are c-type lysozymes (LyC), phage-type lysozymes (LyT4), Entamoeba-type lysozymes (LyEh), and the amoeba lysozymes (Alys), which is a unique class of lysozymes found in D. discoideum. As D. discoideum amoebae feed on bacteria, they are at a risk to encounter pathogenic bacteria. Therefore, it has been postulated that the Apls and lysozymes may play a synergistic role to kill and degrade the bacteria. My study has focused on three apl genes (aplD, aplJ, and aplP) and two lysozyme genes (lyC2 and lyC3), based on collaborator reports that these genes are implicated in bacterial destruction. The phenotypic characterisations were carried out with the single gene KO mutants for the corresponding genes. All the gene disruptions were performed in wild type Ax2 background. Among all five KO mutants tested for growth on bacteria, the aplD¯ showed growth defects on several strains of K. pneumoniae. The aplP¯ and lyC2¯ were defective for growth only on the capsule defective mutant of Kp52145 (K¯). As the aplD¯ was defective for growth on different K. pneumoniae strains, further phenotypic characterisations were carried out for the aplD¯. In accordance with growth defects on K. pneumoniae, the aplD¯ was also defective for intracellular killing of K. pneumoniae (KpLM21). Moreover, the wild type Ax2 cells confronted with KpLM21 showed at least three fold up-regulation of the aplD transcript (qRT-PCR). Similar qRT-PCR experiments with axenic Ax2 revealed that the transcription of aplD is moderately up-regulated during axenic growth, whereas sturdily up-regulated during development and peaked at the slug stage. This spontaneous up-regulation of aplD transcript during Ax2 development, which was performed totally in the absence of bacteria, prompted me to do the slug infection experiments with the aplD¯. As the D. discoideum cells stop feeding at the onset of development they may need an armament to protect their developing structures from foreign intruders. In fact, the migrating slugs are highly prone to infection when compared with the other stages of development. Following this, the slug infection experiments were performed with a GFP expressing strain of K. pneumoniae (KpGFP) and an E. coli strain that expressed DsRed (E. coli DsRed). The Ax2 slugs were used as controls. Unlike Ax2 slugs, the aplD¯ slugs infected with KpGFP showed massive KpGFP accumulation which corroborates with growth and killing defects of aplD¯ with K. pneumoniae. In contrast, the aplD¯ slugs infected with E. coli DsRed were able to slough off E. coli DsRed in their slime trail. However, I could show that the aplD¯ slugs were unaffected in their ability to form S cells and to sequester toxin (EtBr). Apart from their reduced ability to defend against K. pneumoniae, the aplD¯ also showed several morphogenetic defects during development. This includes late stream breaks (12 h), delayed formation of smaller slugs (18 h) and fruiting bodies (~ 26 h), and a relatively reduced spore formation efficiency (sfe). Nevertheless, the spore morphology and spore viability were unaffected in aplD¯. These observations may point to an additional role for aplD during D. discoideum development. On the other hand, it is also possible that the aplD¯ is immunocompromised and therefore it is showing several developmental defects. In summary, this study shows that the aplD is crucial for the growth of D. discoideum on K. pneumoniae and also for the intracellular killing of K. pneumoniae. Additionally, aplD is required to prevent K. pneumoniae accumulation in the D. discoideum slugs.In Entamoeba histolytica sind die Amoebapores und die Lysozyme dafür bekannt, antimikrobielle Funktionen zu übernehmen. Die Struktur und die Funktion sowohl der Amoebapores als auch der Lysozyme sind evolutionär konserviert, was durch das Vorhandensein analoger Proteine in einer Vielzahl anderer Organismen bewiesen ist. Die Amoebapores und deren strukturelle Verwandte sind durch fünf α-Helices charakterisiert, die über Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten miteinander verbunden sind. Jedes Protein, das diese typische Struktur zeigt, wird der SAPLIP-Familie (Saposin-like protein), den Saposin-ähnlichen Proteinen, zugeordnet. Die entsprechende Domäne wird demnach SAPLIP-Domäne genannt. Die SAPLIPs sind für ihre vielfältigen Funktionen bekannt. Die Amoebapores aus E. histolytica und deren strukturell und funktionell analoge Proteine, das NK-lysin aus dem Schwein und das Granulysin aus dem Menschen, sind für ihre antimikrobiellen und cytolytischen Funktionen bekannt. Die namengebenden Saposine des Menschen sind dagegen für den Lipidstoffwechsel wichtig. In Diyctyostelium discoideum gibt es eine Komponente eines Multi-Protein-Komplexes, das countin, das ebenfalls eine SAPLIP-Domäne besitzt. Countin ist notwendig für die Bestimmung der Aggregatgröße während der Entwicklungsphase von D. discoideum. Als Ergebnis einer früheren Arbeit in diesem Labor konnte gezeigt werden, dass das Genom von D. discoideum 17 Gene aufweist, die für 33 putative Amoebapore-ähnliche Peptide (Apls) codieren. Zudem finden sich im Genom von D. discoideum 15 Gene, die für Lysozyme aus vier verschiedenen Klassen codieren. Dabei handelt es sich um die Klassen der c-Typ Lysozyme (LyC), T4 Phagen-Lysozyme (LyT4), Lysozyme des Entamoeba-Typs (LyEh) und die Amoeba-Lysozyme (Alys), eine ausschließlich in D. discoideum vorkommende Lysozym-Klasse. Da das Amöbenstadium von D. discoideum Bakterien als Nahrungsquelle nutzt, besteht für diese auch ein hohes Risiko, auf pathogene Bakterien zu treffen. Daher wurde angenommen, dass die Apls und die Lysozyme eine synergistische Rolle beim Töten und Degradieren von Bakterien spielen könnten. In meiner Arbeit habe ich mich auf die Untersuchung von drei Apl-Genen (aplD, aplJ und aplP) sowie zwei Lysozym-Genen (lyC2 und lyC3) konzentriert, für die bereits von einer kooperierenden Arbeitsgruppe berichtet wurde, dass sie möglicherweise eine Rolle beim Abbau von Bakterien spielen. Die phänotypischen Charakterisierungen wurden mithilfe von Deletionsmutanten für die einzelnen Gene durchgeführt. Als Ausgangsstamm für die Herstellung dieser Mutanten wurde jeweils der Wildtyp-Stamm Ax2 verwendet. Alle fünf Deletionsmutanten wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, auf Bakterien zu wachsen, untersucht. Dabei zeigte die aplD--Mutante Wachstumsdefekte auf den meisten der getesteten Stämme von Klebsiella pneumoniae, während die Mutanten aplP- und lyC2- nur einen Wachstumsdefekt auf dem Klebsiella-Stamm Kp52145 (K-) zeigten, der sich wiederum dadurch auszeichnet, dass er eine veränderte Kapsel aufweist. Da das Wachstum der aplD--Mutante auf verschiedenen Stämmen von K. pneumoniae gestört war, wurde diese Mutante im Folgenden genauer phänotypisch charakterisiert. In Übereinstimmung mit den Wachstumsdefekten auf K. pneumoniae zeigte sich, dass die aplD--Mutante zudem in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt war, intrazelluläre K. pneumoniae (KpLM21) zu töten. Des Weiteren zeigten Zellen des Wildtyps Ax2, die mit KpLM21 konfrontiert wurden, eine mindestens dreifache Hochregulierung das aplD-Transkripts (qRT-PCR). Ähnliche qRT-PCR-Experimente mit axenischen Ax2-Zellen ergaben, dass die Transkription von aplD während des axenischen Wachstums nur leicht hochreguliert wird, wohingegen dies während der Entwicklungsphase sehr stark der Fall ist, mit einem Maximum im sogenannten Slug-Stadium. Die spontane Hochregulierung der aplD-Transkription während der Entwicklung von Ax2-Zellen passierte in der kompletten Abwesenheit von Bakterien. Diese Beobachtung veranlasste mich dazu, das Infektionsexperiment mit dem Slug-Stadium von aplD--Mutanten durchzuführen. Da D. discoideum Zellen mit dem Beginn der Entwicklungsphase aufhören zu fressen, ist es anzunehmen, dass sie Abwehrmoleküle benötigen, um ihre sich entwickelnden Strukturen vor fremden Eindringlingen zu schützen. Tatsächlich sind wandernde Slugs im Vergleich zu den anderen Stadien der Entwicklungsphase hoch anfällig für Infektionen. Daraufhin wurden Infektionsexperimente mit Slugs mit einem GFP exprimierenden Stamm von K. pneumoniae (KpGFP) und einem DsRed exprimierenden Stamm von E. coli (E. coli DsRed) durchgeführt. Slugs des Wildtyps Ax2 wurden dabei als Kontrolle verwendet. Anders als der Wildtyp wiesen die mit KpGFP infizierten aplD--Slugs eine massive Akkumulation der Bakterien auf, was mit den entsprechenden Wachstums- und Tötungsdefekten dieser Mutante übereinstimmt. Im Gegensatz dazu waren die mit E. coli DsRed infizierten aplD--Slugs in der Lage, diese Bakterien in ihre Schleimspur mit abzugeben. Zudem konnte ich zeigen, dass die aplD--Slugs nicht in ihrer Fähigkeit beeinträchtigt waren, S-Zellen zu bilden und Giftstoffe (EtBr) abzusondern. Neben der verminderten Fähigkeit, sich gegen K. pneumoniae zu verteidigen, zeigte die aplD--Mutante außerdem einige morphogenetischen Defekte während der Entwicklungsphase. Hierzu gehörten Unterbrechungen in den Hyphen des späten Streaming-Stadiums (12 h), die verzögerte Bildung von kleineren Slugs (18 h) und Fruchtkörpern (~26 h) sowie eine etwas reduzierte Sporenbildungseffizienz. Gleichwohl waren die Morphologie und die Viabilität der Sporen in der aplD--Mutante nicht beeinträchtig. Diese Beobachtungen könnten auf eine zusätzliche Rolle für AplD während der Entwicklungsphase hindeuten. Andererseits wäre es auch denkbar, dass die aplD--Mutante generell immunsupprimiert ist und somit mehrere Entwicklungsdefekte aufweist. Zusammenfassend konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass aplD von entscheidender Bedeutung für das Wachstum von D. discoideum auf K. pneumoniae und auch für das intrazelluläre Töten dieser Bakterien ist. Außerdem ist aplD notwendig, um die Akkumulation von K. pneumoniae in den Slugs von D. discoideum zu verhindern
Sind Aquaporine an der Zellwanderung beteiligt?
Get PDFZur Untersuchung der Fragestellung, ob Aquaporine an der Zellwanderung beteiligt sind, wurde in dieser Arbeit D. discoideum als Modellorganismus verwendet. Ausgangspunkt
war die Identifizierung von drei neuen putativen Aquaporin-Genen im Genom von D. discoideum.
Der Schwerpunkt der Arbeit wurde auf DdAQP2 gelegt, welches aus cDNA von D. disocideum-Amöben erfolgreich amplifiziert werden konnte. In X. laevis-Oocyten Schwelltests konnte trotz erfolgreicher cRNA-Synthese und
Expression von DdAQP2 weder Wasser- noch Harnstoff- oder Glycerolleitfähigkeit festgestellt
werden. Nachdem in Protein-
Sequenzvergleichen strukturelle Besonderheiten von DdAQP2 aufgefallen waren, wurden
acht Mutanten hergestellt und mit Hilfe von Oocyten-Schwelltests analysiert. Nur die
Mutante Delta208-219 führte zu einer fünffach erhöhten Schwellrate gegenüber Kontroll-
Oocyten. Es konnte damit gezeigt werden, dass DdAQP2 ein aktiver Wasserkanal sein
kann. In Kooperation durchgeführte dynamische Lichtstreuungsmessungen bestätigten
dies. Die Ergebnisse legen einen gating-Mechanismus nahe, an dem die Schleife D, aber
nicht der N-Terminus beteiligt zu sein scheint. Des Weiteren konnte DdAQP2 in D. discoideum-
Amöben auf Proteinebene mit einem im Rahmen dieser Arbeit affinitätsgereinigten
Antikörpers nachgewiesen werden. Für DdAQP2 wurden drei Banden im Western
Blot detektiert. Die 31 kDa zeigte, dass in D. discoideum das erste Methionin das verwendete
Startcodon ist. Zur Erklärung der 38 kDa Bande konnte gezeigt werden, dass
keine N-Glykosylierung vorliegt. In Kooperation innerhalb der Arbeitsgruppe konnte gezeigt
werden, dass DdAQP2 vermutlich O-glykosyliert vorliegt. Die 90 kDa Bande konnte
im Präblock als unspezifisch identifiziert werden. Zur intrazellulären
Lokalisation von DdAQP2 wurden Fusionsproteine mit C- bzw. N-terminalem
GFP verwendet. Die fluoreszensmikroskopischen Aufnahmen zeigen minimale Lokalisationsunterschiede
der beiden Konstrukte. Beide zeigten Fluoreszenz in intrazellulären
Foki, in der Plasmamembran und in Pseudopodien-artigen Zellausstülpungen. Es wurde ein DdAQP2-knockout-Konstrukt kloniert und damit erfolgreich Dictyostelium-Amöben transformiert
Molekulare Basis des antimikrobiellen Systems von Caenorhabditis elegans
Get PDFIm Rahmen dieser Arbeit wurden die Caenopores, potentiell antimikrobielle Peptide aus C. elegans, untersucht, welche durch die Gene der umfangreichen spp-Genfamilie (Saposin-like protein genes) kodiert werden. Gene, die ebenfalls für Saposin-ähnliche Proteine kodieren, wurden in den verschiedensten Organismen, von der Amöbe bis zum Säugetier, identifiziert. Die Mitglieder der Familie der Saposin-ähnlichen Proteine lassen sich über sechs Cysteinreste an konservierten Positionen sowie über eine rein α-helicale Struktur charakterisieren.
Um die Caenopore-Peptide funktionell und strukturell näher zu charakterisieren und In-vitro-Aktivitätstests mit ihnen durchführen zu können, wurden ausgewählte Vertreter der Peptid-Familie, Caenopore 1, 5 und 12, in bakteriellen Expressionssystemen rekombinant synthetisiert. Die Untersuchung dieser drei Caenopores ergab, dass sie sowohl über antimikrobielle als auch über porenbildende Aktivität verfügen. Die antimikrobielle Aktivität gegen die verschiedenen getesteten Zellen ist auf den Prozess der Membranpermeabilisierung zurückzuführen, wobei diese permeabilisierende Aktivität auf dem Mechanismus der Porenbildung basiert.
Die in dieser Arbeit durchgeführte Charakterisierung ausgewählter Vertreter der Caenopores weist darauf hin, dass die Peptidfamilie als Bestandteil des Immunsystems von C. elegans angesehen werden kann
Molekulare Charakterisierung von antimikrobiellen und cytolytischen Polypeptiden von Acanthamoeba culbertsoni, einem freilebenden und potenziell humanpathogenen Protozoon
Get PDFCulbicin ist ein neuartiges Peptid, welches aufgrund seiner porenbildenden Aktivität aus humanpathogenen Acanthamoeba culbertsoni isoliert wurde. Die Aufklärung der Nukleotidsequenz von Culbicin zeigte, dass das translatierte Culbicin in einem Precursor mit aminoterminalem Signalpeptid organisiert ist. Es wird postuliert, dass die Nukleotidsequenz zwischen dem 5'-Ende der Culbicinsequenz und der Signalpeptidcodierenden Sequenz ein weiteres Peptid codiert, welches KURZ genannt wurde. KURZ weist weder strukturelle Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen noch zu Culbicin auf. Für beide Peptide wurde jeweils ein heterologes Expressionssystem etabliert, mit dem ausreichende Mengen der rekombinanten Peptide für die Antikörpergenerierung, Funktions- und Strukturanalysen synthetisiert wurden.
Die prozentuale Verteilung der Sekundärstrukturelemente wurde untersucht und rCulbicin als ein vorwiegend α-helikales Peptid identifiziert. Die Tertiärstruktur von rCulbicin wird von fünf Disulfidbrücken stabilisiert, die dem Peptid eine enorme Stabilität unter Hitze und Säureeinwirkung verleiht. KURZ hingegen wurde als vorwiegend β-Faltblattstrukturiertes Peptid identifiziert, dessen Tertiärstruktur ebenfalls durch fünf Disulfidbrücken stabilisiert wird.
Ferner wurde festgestellt, dass rCulbicin ein breites Wirkspektrum aufweist: es permeabilisiert die Membranen Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien, bildet Poren in artifiziellen Liposomen, lysiert Human- und Schaf-Erythrocyten und wirkt cytotoxisch auf Candida albicans sowie zwei verschiedene humane Tumorzelllinien. Bei KURZ wurde ebenfalls antibakterielle, porenbildende und hämolytische Aktivität nachgewiesen. Mit den rekombinanten Peptiden Culbicin und KURZ wurden spezifische Antikörper
generiert, die zur Immunolokalisation der natürlichen Peptide in Acanthamoeba
culbertsoni-Trophozoiten verwendet wurden. Natürliches Culbicin wurde in cytosolischen Granula der Trophozoiten nachgewiesen, KURZ hingegen konnte nicht lokalisiert werden.
Mit dem spezifischen Anti-Culbicin-Antikörper wurde im Immunoblot ein Protein von Acanthamoeba castellanii erkannt, bei dem es sich vermutlich um ein Culbicin-Ortholog handelt. Die Analyse einer online-cDNA-Bank von A. castellanii untermauert dieses Postulat, da eine translatierte cDNA-Sequenz 93 % Ähnlichkeit zur Culbicinsequenzaufweist. Dieses Culbicin-Ortholog, welches in dieser Arbeit den Arbeitstitel Castellanicin erhielt, ist gleichfalls in einem Precursor organisiert. Die Aminosäuresequenz des gesamten Castellanicin-Precursors ist der des Culbicin-Precursors zu 71 % ähnlich. Aufgrund dessen wird postuliert, dass mit Culbicin und KURZ sowie deren Homologen von Acanthamoeba castellanii in dieser Arbeit zwei gänzlich neue Proteinfamilien entdeckt wurden, die keine strukturellen Ähnlichkeiten zu bekannten Proteinfamilien aufweisen
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
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