1,486 research outputs found
Skandinavisk frivillighed ved en korsvej?
No full textI dette kapitel, som er en del af et festskrift til Lars Svedberg, reflekterer jeg over skandinavisk frivillighed på baggrund af tilgængelige data og undersøgelser
Fabeln von Aesop Illustriert mit Holzstichen
No full text"Jahresgabe 1969 für die Mitglieder der Gesellschaft der Freunde und Förderer der Folkwangschulen e.V." This work is the production of Rehagel in his sixth semester at this school of the arts. I take it that we are dealing with the most famous school with a name like this, namely in Essen. The ten woodcuts are strong. My prize among them goes to the image of the miser kneeling beside the hole in which he had hid his riches. In the background someone slinks away with something in his hand. Well done! About 10" square. This collection is great for finding and bringing together rarities like this pamphlet.Language note: German1 of 750No Autho
Development and characterization of flavoprotein-based optogenetic modules in Saccharomyces cerevisiae
No full textIm letzten Jahrzehnt, wurde in der Wissenschaft dem Bereich der Optogenetik immer mehr Beachtung geschenkt. So wurden zahlreiche Anwendungen entwickelt, von lichtgesteuerten Ionenkanälen, über Module zur Kontrolle des Proteinlevels, bis zu Modulen um physiologische Prozesse mit Licht zu steuern. All diese Module basieren auf Proteinen, die als Photorezeptoren bezeichnet werden und als Sensordomäne sensitiv für Licht bestimmter Wellenlängen sind. Eine weitverbreitete Familie dieser Proteine sind die LOV-Domänen, welche zu den Blaulichtrezeptoren zählen und aufgrund ihrer geringen Größe (unter 20 kDa) von besonderem Interesse für optogenetische Anwendungen sind. Eine weitere Proteinfamilie, die immer mehr in das Interesse für die Optogenetik rückt, sind die Cryptochrome, welche ebenfalls zu den Blaulichtphotorezeptoren gezählt werden.
In dieser Arbeit ist die Entwicklung von optogenetischen Modulen basierend auf der LOV-Domäne des Aureochroms 1a aus Phaeodactylum tricornutum (AuLOV) beschrieben. Dafür wurden verschiedene Mutanten der AuLOV-Domäne strukturell und proteinchemisch charakterisiert. Bei dieser Charakterisierung konnte eine neue Dimerinteraktionsfläche für die AuLOV-Domäne durch Kristallstrukturanalyse gefunden werden. Diese neue Dimeranordnung wurde anschließend bioinformatisch charakterisiert. Für die Entwicklung von einer optogenetischen Applikation wurden verschiedene AuLOV Mutanten im psd-Modul getestet und eine Domäne entwickelt, die das Protein in Dunkelheit destabilisiert (AuLOVV254M/V349W-cODC1CA). Diese Domäne wurde mit der photoaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC fusioniert und AuPAC wurde als zweites Modul geschaffen. AuPAC ist eine synergistische, photoaktivierbare Adenylatcyclase, die gezielt über den Proteinkinase A Signalweg zelluläre Funktionen in S. cerevisiae steuert. Im Folgenden wurde ein lösliches in vivo Konstrukt mCherry-P2A-AuLOV-cODC1 gereinigt und proteinchemisch charakterisiert.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem „animal-like Cryptochrome“ aus C. reinhardtii (CraCry), welches aufgrund der verschiedenen Redoxzustände des Chromophors möglicherweise zusätzlich als Rotlichtphotorezeptor fungieren kann. Varianten von CraCry wurden im psd-Modul auf das Verhalten unter verschiedenen Lichtbedingungen in S. cerevisiae untersucht und bieten somit ein Potenzial für eine Vielzahl weiterer optogenetischen Applikationen.In the last decade, the field of optogenetics gained more and more attention in science. Several tools were developed, starting with light controlled ion-channels and devices to control the protein level, up to the control of physiological processes in living cells. These tools are based on photoreceptors, which are light-sensitive proteins for distinct wavelengths. A protein family frequently used in optogenetics are LOV domains. LOV domains are blue-light photoreceptors and have a small size of under 20 kDa. Cryptochromes are another class of blue-light photoreceptors, which are recently getting more attention in the field of optogenetics.
In this thesis an optogenetics tool was developed based on the aureochrome 1a LOV domain form Phaeodactylum tricornutum (AuLOV). Therefore, different mutants of the AuLOV domain were characterized in vitro, a new dimer interface of the AuLOV domain was identified by crystallization experiments and was characterized by bioinformatics. In order to create an optogenetic tool, AuLOV was tested in the photosensitive degron module (psd) and a darkness destabilization tag (AuLOVV254M/V349W-cODC1CA) was developed. This tag was fused to the photoactive adenylate cyclase bPAC to create AuPAC. AuPAC is a synergistic, photoactive adenylate cyclase, which is able to control cellular functions in S. cerevisiae. Furthermore, the soluble in vivo construct mCherry-P2A-AuLOV-cODC1 was expressed and characterized.
Another photoreceptor, the „animal-like Cryptochrome“ from C. reinhardtii (CraCry), was characterized in the psd-module under different light conditions in S. cerevisiae. Based on the different redox forms of the chromophore, CraCry is additionally hypothesized to set as red-light sensitive photoreceptor. CraCry has the potential for different optogenetic applications
Structural and functional characterization of a novel bacterial cryptochrome and analysis of microbial photolyases
No full textCryptochrome und Photolyasen sind eine Gruppe ubiquitärer, FAD bindender,
blaulichtabhängiger Signalproteine bzw. Enzyme, welche zusammen die
Photolyase/Cryptochrom-Superfamilie (PCSf) bilden. Während Photolyasen UV-induzierte
DNA-Läsionen zwischen benachbarten Pyrimidinbasen, nämlich die Cyclobutanpyrimidindimere
(CPD) und die (6-4)-Pyrimidin-pyrimidon-Photoprodukte ((6-4)), erkennen
und blaulichtabhängig reparieren, üben Cryptochrome regulatorische Funktionen in vivo aus.
Die pflanzlichen Vertreter sind in der Antwort auf Blaulichtreize involviert und nehmen
Einfluss auf Wachstum, Entwicklung und die circadiane Uhr von Pflanzen. In Tieren
partizipieren Cryptochrome in der circadianen Uhr als Blaulichtsensensor (Typ-I), oder
lichtunabhängig als Teil des zentralen Oszillators (Typ-II). Cryptochrome aus Bakterien sind
weniger gut untersucht, der bestcharakterisierte Vertreter aus Synechocystis sp. PCC6803
gehört zur CryDASH-Familie, deren genaue biologische Funktion noch immer unklar ist.
In dieser Arbeit erfolgte eine funktionelle und die erste strukturelle Charakterisierung eines
echten bakteriellen Cryptochroms, des Cryptochroms B aus Rhodobacter sphaeroides
(RsCryB). RsCryB zeigt keine DNA-Reparaturaktivität und reguliert die Photosynthese von
R. sphaeroides auf dem Transkriptlevel sauerstoff- und blaulichtabhängig. RsCryB definiert
eine neue, überwiegend in Proteobakterien auftretende Proteinfamilie in der PCSf, die
proteobakteriellen Cryptochrome (CryPro). Trotz geringer Sequenzidentitäten zu anderen
Vertretern der PCSf ist die Struktur der CryPro-Familie homolog zur konservierten
Überstruktur der Superfamilie. Überraschenderweise konnte in RsCryB ein [4Fe-4S]-Cluster
identifiziert werden, der neben dem katalytischen Kofaktor FAD das bestimmende Element
der C-terminalen Domäne ist. Dieser Cluster ist strukturell und chemisch verwandt mit
bekannten Clustern aus eukaryotischen Primaseuntereinheiten, wie durch EPR-Experimente
gezeigt werden konnte. Daneben wurde in RsCryB mit 6,7-Dimethyl-8-ribityl-lumazin, ein
für die PCSf neuer Antennenchromophor identifiziert. Diese Studien werden ergänzt durch
eine Analyse der DNA-Bindung der Klasse II CPD-Photolyasen aus Methanosarcina mazei
(MmCPDII), sowie durch die Analyse des vollständig reduzierten Zustandes der MmCPDII
mittels Ultrakurzzeitspektroskopie. In einem dritten Teilprojekt konnte der Antennenchromophor
der (6-4)-Photolyase aus Dunaliella salina als 8-Hydroxy-5-deazaflavin
identifiziert und die in vitro Reparatur des (6-4)-Schadens durch das Enzym demonstriert
werden.Cryptochromes and photolyases constitute a group of highly distributed, FAD-binding,
bluelight dependent signaling proteins ans enzymes, which together form the
photolyase/cryptochrome-superfamily (PCSf). Photolyases recognize UV-induced DNA
lesions between adjacent pyrimidine bases, namely cyclobutanpyrimidindimers (CPD) and
(6-4)-pyrimidine-pyrimidone-photoproducts ((6-4)), and repair them blue-light dependently,
whereas cryptochromes rather show regulatory functions in vivo. The plant representatives are
involved in responses to blue-light stimuli and take influence on growth, development and the
circadian clock of the plant. Cryptochromes in animals participate in the circadian clock as
blue-light sensors (type I), or light-independently as part of the central oscillator (type II).
Cryptochromes from bacteria are still poorly understood, the best characterized
representatives from Synechocystis sp. PCC6803 belongs to the CryDASH family whose
exact biological function is still unknown.
This work dealt with functional and the first structural characterization of a true bacterial
cryptochrome,cryptochrome B from Rhodobacter sphaeroides (RsCryB). RsCryB shows no
DNA repair activity and participates in the light-dependent and oxygen-dependent regulation
of photosynthesis genes in R. sphaeroides. It defines a new family of proteins in the PCSf,
predominantly occurring in proteobacteria, the proteobacterial cryptochromes (CryPro).
Despite low sequence identity to the other representatives of the PCSf, the structure of the
CryPro family is analogous to the conserved overall fold of the superfamily. Surprisingly, one
[4Fe-4S] clusters was identified, which is along with the catalytic cofactor FAD the defining
element of RsCryB's C-terminus. This cluster is structurally and chemically related to known
clusters of eukaryotic primase subunits, as was shown by EPR experiments. Moreover 6,7-
dimethyl-8-ribityl-lumazine was identified as antenna chromophore of RsCryB, yet unknown
inside the PCSf.
These studies are complemented by an DNA binding analysis of the class II CPD photolyase
from Methanosarcina mazei (MmCPDII), the model photolyase for plant homologs, as well as
an analysis of the fully reduced state of MmCPDII by ultrafast spectroscopy. In the third part
of the project the native antenna chromophore of the (6-4)-photolyase from Dunaliella salina
was identified as 8-hydroxy-5-deazaflavin and the in vitro repair of (6-4)-damages by the
enzyme was shown
Functional Characterisation of Arginine Methyltransferase PRMT6
No full textDas primäre Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung der
Histonmethyltransferaseaktivität von PRMT6. Trotz der Tatsache, dass PRMT6 im
Zellkern lokalisiert ist und für einige andere PRMTs Histonmethylierung gefunden
wurde, blieb die Argininmethylierung in Histonen durch PRMT6 bisher unerforscht.
Es konnte hier gezeigt werden, dass PRMT6 in vitro die Histone H3, H2A und H4
methyliert. Während ungebundene Histonproteine Substrate von PRMT6 waren, traf
dies für Histone in Nukleosomen in vitro nicht zu. Die Methylierungsstellen konnten in
den N-Termini der Histone lokalisiert werden und als R2 in Histon H3 sowie R3 in
Histon H4 und H2A identifiziert werden. Bei der Charakterisierung des
Methylierungsmechanismus ergab sich eine Präferenz von PRMT6 für monomethylierte
Arginine, was die PRMT6 als Methyltransferase ausweist, welche bevorzugt die
Dimethylierung von Argininen katalysiert. In Bezug auf die Methylierung des R2
konnten Einflüsse benachbarter Methylierungen auf die in vitro PRMT6-Aktivität
ausgemacht werden. So wirkten die Methylierungen an K4 und K9 inhibierend,
während die Methylierung des K27 einen schwachen positiven Effekt zeigte.
Das daran anschließende Ziel bestand in der Untersuchung der Funktion der H3R2
Dimethylierung im Zusammenhang des Histoncodes. Es sollten mögliche
Bindungsproteine (Effektor-Proteine) für diese Modifikation gefunden werden. Dazu
wurden Peptid-Pulldowns mit synthetisch modifizierten H3-Peptiden durchgeführt und
nach differentiell bindenden Proteinen gesucht. Diese Methode konnte allerdings keine
spezifischen Interaktionspartner identifizieren. Auch ein vermuteter Zusammenhang
zwischen der PRMT6 und dem PRC2-Komplex, sowie den entsprechenden
Modifikationen an R2 und K27 konnte mittels dieser Peptid-Pulldowns nicht betätigt
werden.
Frühere Studien der Lokalisation der R2 Di- bzw. der K4 Trimethylierung an
bestimmten Genpromotoren sowie Untersuchungen der Genexpression von c-Myc Zielbzw.
HoxA Genen bei PRMT6 Überexpression lieferten Hinweise auf einen repressiven
Effekt der PRMT6-vermittelten R2 Dimethylierung. Zur weiteren Überprüfung dieses
Mechanismus wurde zuerst die Genregulation des c-Myc Gens durch den Wnt-
Signalweg untersucht. Dabei konnte durch RNAi-vermittelte Depletion kein Einfluss
der PRMT6 auf die Genexpression dieses Gens gefunden werden.Um den negativen Effekt der R2 Dimethylierung auf die Trimethylierung des K4 auf
mechanistischer Ebene zu beschreiben, wurde die in vitro Aktivität der K4
Trimethyltransferase MLL sowie die Histon H3 Interaktion der MLL-Komplexkomponente
WDR5 in Abhängigkeit von der R2 Dimethylierung untersucht. Hierbei
konnte gezeigt werden, dass sowohl die Methyltransferaseaktivität von MLL wie auch
die Bindung des WDR5 an den Histon H3 N-Terminus durch eine Dimethylierung des
R2 verhindert wird. Der inhibitorische Effekt der R2 Methylierung auf die
Methylierung des K4 konnte spezifisch durch Chromatin-IPs in vivo am HoxA2
Promotor nachgewiesen werden, wo eine PRMT6 Überexpression zu verstärkter
PRMT6 Rekrutierung und R2 Dimethylierung führte. Diese wiederum hatte die
verminderte Assoziation von MLL und WDR5 mit diesem Promotor zur Folge und
somit eine Reduktion der Trimethylierung des K4. In einem Modell neuronaler
Differenzierung konnten diese Ereignisse am HoxA2 Gen bestätigt werden und
zusätzlich die repressive Funktion der PRMT6-vermittelten R2 Dimethylierung auf die
Genexpression aufgezeigt werden.
Zusammenfassend charakterisieren die Daten dieser Arbeit PRMT6 als neue
Histonmethyltransferase, die R2 in Histon H3 dimethyliert. Desweiteren wurde eine
spezifische Genregulationsfunktion der PRMT6 im Zusammenhang mit dem Histon-
Code identifiziert, bei welcher die H3K4Me3-vermittelte Expression bestimmter
Genpromotoren durch die H3R2Me2 reprimiert wird.The primary goal of this work was to characterise the histone methyltransferase activity
of PRMT6. Despite the fact that PRMT6 was found to be mainly nuclear localised and
that several PRMT members exhibit activity towards histones, the histone-methylation
by PRMT6 has not been investigated so far.
In this work PRMT6 was found to methylate histones H3, H2A and H4 in vitro. Free
histones were substrates of PRMT6, whereas nucleosomes could not be methylated by
PRMT6 in vitro. The methylation sites were localized in the N-termini of histones and
identified as R2 in histone H3 and R3 in histones H4 and H2A, respectively. The
characterisation of the methylation mechanism resulted in a catalytic preference of
PRMT6 for monomethylated arginines. This indicates that PRMT6 is mainly
responsible for the dimethylation of arginines. Considering the methylation of R2 in
histone H3 other histone modifications were found to exhibit an influence on the in
vitro activity of PRMT6. While methylation of K4 and K9 in H3 inhibited PRMT6
activity, methylation of K27 increased PRMT6 activity.
Subsequently, the investigation of H3R2 dimethylation function in the context of the
histone code was the next goal of this work. This should be achieved by identifying
potential binding partners (effector proteins) for this modification. Peptide pulldowns
with synthetically modified histone H3-pepides were used to search for differentially
interacting proteins. This technique did not result in the identification of specific
interaction partners for H3R2 dimethylation. A supposed functional relationship
between PRMT6 and the PRC2-complex as well as between their corresponding
modifications R2 and K27 could not be confirmed using peptide pulldowns.
Recent studies considering the genome-wide localisation of R2 di- and the K4
trimethylation suggested a negative cross-talk between these histone marks.
Additionally, PRMT6 overexpression experiments demonstrated a repressive effect of
PRMT6 on the expression of distinct HoxA genes and c-myc targets. The regulation of
c-myc gene expression by the Wnt-pathway was used to further characterise the
regulation mechanism of PRMT6. RNAi-mediated PRMT6-knockdown exhibited no
effect of PRMT6 on the gene expression of c-myc in this context.
Alternatively, the negative cross-talk between R2Me2 and K4Me3 should be described
on the mechanistic level. Therefore, the in vitro influence of R2 dimethylation on K4
trimethyltransferase MLL activity as well as on histone binding affinity of MLL-complex subunit WDR5 was investigated. The R2 dimethylation exerted a strong
inhibitory effect on MLL activity and on WDR5 binding to the histone H3-tail. The
negative effect of R2 methylation on K4 methylation could be verified in vivo using
chromatin immunoprecipitation on the HoxA2 promoter in PRMT6 overexpressing
cells. Exogenous PRMT6 levels resulted in increased PRMT6 and R2 dimethylation
levels at the promoter and decreased K4 trimethylation as well as reduced recruitment
of MLL and WDR5. These promoter events were described in a model of neuronal cell
differentiation, which confirmed the model for the repressive function of PRMT6-
mediated R2 dimethylation in gene regulation.
Together, the data from the present work identify PRMT6 as a novel histone
methyltransferase, which dimethylates R2 in histone H3. Furthermore, the specific gene
regulation mechanism for PRMT6 was characterised in the context of the histone code,
where H3R2Me2 regulates H3K4Me3-mediated expression of certain genes
Biotechnologische Anwendungen der Aldehyd‑Oxidoreduktase und anderer Enzyme aus Aromatoleum aromaticum
No full textDie Aldehyd-Oxidoreduktase aus dem beta-Proteobakterium Aromatoleum aromaticum EbN1 (AORAa) ist eine Enzym mit einer „Nanowire“ Struktur aus drei Untereinheiten, dass Redox-Reaktion verschiedener Aldehyde und entsprechender Carbonsäuren katalysiert. Die β-Untereinheiten enthalten je einen Wolfram-bis-Pterin-Kofaktor im aktiven Zentrum, der über einen Tunnel aus [4Fe-4S]- Clustern in β- und α-Untereinheiten mit FAD-Kofaktoren in den γ-Untereinheiten verbunden sind. Für die Produktion von AORAa sind neben den drei Strukturgenen aorA-C zwei weitere Gene aorD und aorE, die für Maturationsfaktoren codieren, im Operon essenziell.
Besonders bemerkenswert am Aufbau des Enzyms ist der „Nanowire“ Multimer-Komplex. In der Strukturanalyse wurde in AorA ein α- helikaler Strukturanteil identifiziert, von dem vermutet wird, dass er für die Oligomerisierung verantwortlich ist. Es wurde eine Deletionsmutante von dieser AorA, AorΔhelix, erstellt. Dieser wird in dieser Arbeit kinetisch charakterisiert und mit dem AORAa Wildtyp verglichen.
In vitro kann die Aktivität von AORAa mit Viologen-Farbstoffen, Ti(III)-Citrat, und NAD(H) gemessen werden, wobei bisher nur NAD(H) als physiologischer Elektronenakzeptor in Frage kommt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde geprüft, ob Ferredoxin als natürlicher Elektronendonator fungiert. Zusätzlich wurden Phosphit, Hypophosphit, Methylenblau und DCPIP als Elektronendonatoren, bzw. -akzeptoren getestet.
Gemeinsam mit verschiedene Alkoholdehydrogenasen kann die Reduktion von aromatischen und aliphatischen Carbonsäuren durch AORAa weiter bis zum entsprechenden Alkohol katalysiert werden. Neben AORAa enthält A. aromaticum EbN1 weitere dafür interessante Enzyme. Bei AdhB und BaDH handelt es sich um Alkohol-Dehydrogenasen, die für Biokatalysten interessante Eigenschaftenbesitzen, etwa die Toleranz gegenüber gängigen Lösungsmitteln (AdhB, BaDH) oder ein breites Substratspektrum von aromatischen Verbindungen (BaDH). Beide Enzyme wurden grundlegend charakterisiert. Besonders auffällig sind Hinweise auf einen neuen, Nukleotid-ähnlichen Kofaktor in den rekombinanten Enzympräparaten beider Proteine. In Kombination mit AORAa wurden sie außerdem zur Reduktion von Benzoat oder Essigsäure zu den entsprechenden Alkoholen eingesetzt.
Im Genom von A. aromaticum EbN1 ist das Gen für ein weiteres Wolframenzym vorhanden, AOR1. Obwohl diese Enzym-Art auch in anderen Organismen vorkommt, wurde bisher noch kein Vertreter charakterisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde AOR1 rekombinant produziert und anfänglich charakterisiert.
Die Optimierung der Wachstumsbedingungen für verschiedene Stämme von Aromatoleum spp. ist nicht nur für ein künftige Biokatalyse-System wichtig, sondern hat auch zur Entwicklung der Methoden zur gentechnischen Manipulation von A. evansii beigetagen. Zuletzt wurde gezeigt, dass verschiedene Vertreter der Aromatoleum-Gruppe Substanzen aus Lignin-Derivaten als Kohlenstoffquelle nutzen können und dass Substrate für AORAa in Lignin-Derivaten vorhanden sind.The aldehyde:ferredoxin oxidoreductase from the beta-proteobacterium Aromatoleum aromaticum
EbN1 (AORAa) is an enzyme with a three-subunit "nanowire" structure that catalyzes the redox
reactions of various aldehydes and their corresponding carboxylic acids. The β subunits each
contain a tungsten-bis-pterin cofactor in the active site, which is connected via a tunnel of [4Fe-4S]
clusters in the β and α subunits to FAD cofactors in the γ subunits. In addition to the three structural
genes aorA–aorC, two further genes in the operon, aorD and aorE, which encode maturation
factors, are essential for AORAa production.
Particularly notable in the enzyme’s architecture is the three-dimensional “nanowire” multimer
complex. Structural analysis identified an α-helical region in AorA that is suspected to be
responsible for oligomerization. A deletion mutant of this AorA, AorΔhelix, was constructed. It is
kinetically characterized in this work and compared with the AORAa wild type.
In vitro, AORAa activity can be measured with viologen dyes, Ti(III)-citrate, and NAD(H), although so
far only NAD(H) is considered a physiological electron acceptor. In this study, it was tested whether
ferredoxin could serve as a natural electron donor. In addition, phosphite, hypophosphite,
methylene blue, and DCPIP were tested as electron donors or acceptors.
Together with various alcohol dehydrogenases, the reduction of aromatic and aliphatic carboxylic
acids by AORAa can continue to the corresponding alcohols. In addition to AORAa, A. aromaticum
EbN1 harbours other enzymes of interest for this purpose. AdhB and BaDH are alcohol
dehydrogenases that possess properties relevant for biocatalysis, such as tolerance to common
solvents (AdhB, BaDH) and a broad substrate range for aromatic compounds (BaDH). Both enzymes
have been characterized at a basic level. Notably, recombinant preparations of both proteins
contain indications of a novel nucleotide-like cofactor. In combination with AORAa, they have also
been used to reduce benzoate or acetic acid to the corresponding alcohols.
The genome of A. aromaticum EbN1 contains the gene for another tungsten enzyme, AOR1.
Although this type of enzyme occurs in other organisms, no representative has been characterized
to date. In the course of this work, AOR1 was produced recombinantly and initially characterized.
Optimizing growth conditions for various Aromatoleum spp. strains is not only important for a future
biocatalytic system but has also contributed to the development of methods for the genetic
manipulation of A. evansii.
Lastly, it was shown that various members of the Aromatoleum group can use substances derived
from lignin as a carbon source and that substrates for AORAa are present in lignin derivatives
Structural basis for signal-induced changes in phytochrome B as well as in the phytochrome-associated protein phosphatase PAPP5
No full textPflanzen haben auf Grund ihrer sessilen Lebensweise im Laufe der Evolution komplexe Mechanismen entwickelt, um ihr Überleben zu sichern. Speziell Licht ist sowohl für die Photosynthese als auch die Aufnahme von Informationen über die Umgebung essentiell. Hierfür haben Pflanzen verschiedene Photorezeptoren ent-wickelt, von denen die Phytochrome die am besten charakterisierten Vertreter darstellen. Durch die Absorption von rotem Licht findet eine reversible Umwandlung des Grundzustandes Pr (engl.: Red) in die in Pflanzen aktive Form Pfr (engl.: Far-red) statt. Für Pflanzen konnte bislang nur eine Kristallstruktur im Pr Zustand von Phytochrom B erhalten werden.
Diese Arbeit bietet eine detaillierte Analyse der konformationellen Änderungen des photosensorischen Moduls von Arabidopsis thaliana (At) PhyB zwischen der Pr und der Pfr Form durch Wasserstoff-Deuterium-Austausch Messungen. Des Weiteren konnten ein Einfluss der N-terminalen Erweiterung (NTE) auf den Chromophor nachgewiesen werden und mithilfe der Vermessung einer Deletionsvariante ohne NTE mittels Wasserstoff-Deuterium-Austausch erstmals ein Packungsmodell für die N-terminale Erweiterung von PhyB entwickelt werden.
Weiterhin konnte die Struktur einer mit Phytochromen interagierende Phosphatase, PAPP5, gelöst und die Interaktion mit dem NTE von PhyB nachgewiesen werden. Die Struktur von PAPP5 zeigt eine Autoinhibition durch die N-terminale TPR Domäne so-wie das C-terminale inhibierende Motiv. Hierbei konnten die verantwortlichen Reste in der TPR Domäne und in dem C-terminalen Motivs identifiziert werden. CD-spek-troskopische Messungen und Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Experimente liefer-ten Daten zur Entwicklung eines Modells der PAPP5-Aktivierung durch Fettsäuren.
Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit bestand darin ein Hybridsystem zu entwickeln, das einen einfacheren Zugang zur biophysikalischen Analyse pflanzlicher Phytochrome ermöglicht. Hierfür wurden die PAS und GAF Domäne des cyanobakteriellen Phytochroms SynCph1 mit der PHY Domäne aus PhyB fusioniert. Zwar zeigte das Hybrid keine vollständige Photokonversion, dennoch war es in der Lage eine lichtabhängige Wechselwirkung mit der Phosphatase PAPP2c einzugehen.In the course of evolution plants have evolved complex mechanisms to ensure their survival as sessile organisms. Especially light plays a key role for autotrophic organisms because it is not only essential for photosynthesis, but also provides informations about the environment and the day/night rhythm. To sense these informations, plants have developed different photoreceptors, among them phytochromes are the best characterized ones. The absorption of red light results in a reversible transformation of the ground state Pr (Red) into the plant-active form Pfr (Far-red). For plants, only a crystal structure of phytochrome B in its Pr state exists.
This work provides a detailed analysis of the conformational changes of the photosensory module of Arabidopsis thaliana (At) PhyB between the Pr and the Pfr form by hydrogen-deuterium exchange (HDX) measurements. Furthermore, an influence of the N-terminal extension (NTE) on the chromophore could be detected. For the first time, a packing model for the NTE of PhyB was developed by means of the HDX of a deletion variant without NTE.
Furthermore, the structure of a phosphatase, PAPP5, interacting with phytochromes was solved and the interaction with the NTE of PhyB could be demonstrated. The structure of PAPP5 showed autoinhibition by the N-terminal TPR domain and a C-terminal motif. The responsible residues could be identified in the TPR domain and in the C-terminal motif. CD-spectroscopic measurements and hydrogen deuterium exchange experiments provided data on the development of a model of PAPP5-fatty acid activation. Another aspect of this work was to develop a hybrid system that allows easier access biophysical studies on plant phytochromes. For this purpose, the PAS and GAF domains of the cyanobacterial phytochrome SynCph1 were fused with that of the PHY domain from AtPhyB. Although, the hybrid lacked complete photoconversion, it was able to interact with the phosphatase PAPP2c in a light-dependent manner
Architecture and function of eubacterial dodecins - a novel class of cofactor binding proteins
No full textDodecine sind kleine Flavin-bindende Proteine, die während eines inversen Strukturgenomik-Projektes im Archaebakterium H. salinarum entdeckt worden sind. Die nur 7.4 kDa großen monomeren Untereinheiten mit einfachem beta-alpha-beta-beta-Faltungsmotiv bilden dodecamere Komplexe mit kubischer 23-Punktsymmetrie, die einen inneren Hohlraum aufweisen. Die Flavine werden in Form von Dimeren in Bindungstaschen entlang der zweizähligen Achsen des Komplexes gebunden und bilden mit zwei benachbarten Tryptophanresten eine bislang einzigartige aromatische Tetrade.
Diese Arbeit legt einen Grundstein für das Verständnis der Flavinbindung in eubakteriellen Dodecinen. Durch das Lösen der 2.6 und 1.7 Å Kristallstrukturen der heterolog exprimierten Dodecine aus T. thermophilus und M. tuberculosis konnte gezeigt werdem, dass eubakterielle Dodecine einen anderen Bindungsmodus aufweisen, als zuvor für das haloarchaeale Dodecin publiziert. Einzelne Punktmutationen der Reste, in denen sich eubakterielle Dodecine von dem archaebakteriellen Typus unterscheiden, weisen jedoch denselben Bindungsmodus auf wie der Wildtyp, wie durch Lösen der 2.6 und 1.3 Å Kristallstrukturen der T. thermophilus Dodecin R45A- und R65A-Mutanten gezeigt werden konnte. Spektroskopische Untersuchungen des T. thermophilus WT-Proteins und seiner W38Y- und W38F-Mutanten zur Charakterisierung der Funktion der aromatischen Tetrade geben deutliche Hinweise auf elektronische Interaktionen zwischen Flavin und der benachbarten aromatischen Aminosäure, die letztendlich im Falle des WT Dodecins innerhalb von nur 70 fs zur kompletten Deaktivierung des angeregten Flavinzustandes führt.
Neben Flavin-Dimeren enthalten eubakterielle Dodecine endogen gebundenes Coenzym A wie durch Röntgenkristallographie und massenspektrometrische Untersuchungen nachgewiesen werden konnte. Die CoA-Moleküle sind in den dreizähligen symmetrischen Stellen II als Trimere nicht-kovalent so gebunden, dass die freie Thiol-Gruppe von Protein
umgeben ist. Eine solche trimere Anordnung von CoA ist bis jetzt - ebenso wie die des FMN-Kofaktors - einzigartig und ein Kennzeichen eubakterieller Dodecine.
Erstmals konnte zudem ein Dodecin-Datensatz in atomarer Auflösung (1.08 Å) aufgenommen werden, der als Grundlage für zukünftige Berechnungen der Dodecin-Kofaktor-Interaktionen herangezogen werden kann.
Aufgrund der gewonnenen Erkenntnisse kann die Funktion des Dodecins als bifunktionales Speicherprotein postuliert werden, das sowohl CoA als auch Flavine in nicht-reaktiver Formen speichert und somit die zelluläre Photoschädigung aufgrund dieser Kofaktoren reduziert.Dodecins are small flavin binding proteins, which were discovered during an inverse structural genomics project in the archaebacterium H. salinarum. The monomeric subunits, which are only 7.4 kDa in size consist of a simple beta-alpha-beta-beta-fold and adopt a hollow spheric dodecameric complex with cubic 23-point symmetry. The flavins are bound as dimers along the twofold symmetry axes of the dodecameric complex and are sandwiched between two neighbouring tryptophan residues resulting in an aromatic tetrade, which is unique so far.
This work is the basis for the understanding of flavin binding in eubacterial dodecins. Solving the 2.6 and 1.7 Å crystal structures of the heterologously expressed dodecins from T. thermophilus and M. tuberculosis showed a different flavin-binding mode for eubacterial dodecins than published for the H. salinarum dodecin. Single point mutations of residues, which differ in the eubacterial dodecins and the haloarchaeal type showed the same binding mode as observed for the wild type T. thermophilus dodecin, as was shown by the 2.6 and 1.3 Å crystal structures of the T. thermophilus dodecin R45A and R65A mutants. Spectroscopic investigation of the T. thermophilus dodecin and its W38Y and W38F mutants which were performed in order to investigate the function of the aromatic tetrade give clear indication of electronic interaction between the flavin and its neighbouring amino acid, which results in case of the WT dodecin in complete deactivation of the flavin activated state in only 70 fs.
Beside flavin dimers eubacterial dodecins also contain endogenously bound coenzyme A, as was shown by X-ray crystallography and mass spectrometry. The CoA molecules are bound non-covalently as trimers in the threefold symmetric face II in such a way that the free thiol group is surrounded by the protein. Such a trimeric assembly of CoA molecules has never been reported in literature before.
Also for the first time a dodecin dataset with atomic resolution (1.08 Å) was collected, that can serve as a basis for further calculations of dodecin-flavin interactions.
Based on the obtained knowledge the function of dodecin as bifunctional cofactor storage protein can be postulated; this protein binds CoA and flavins in a non-reactive state und reduces cellular photosensitive effects resulting from these cofactors
Struktur und Funktionsanalysen von pilzlichen Zellwandproteinen der SUN und CFEM Proteinfamilien
No full textPilzliche Organismen stellen eine der artenreichsten Lebensformen der Erde dar. Die ausgesprochen
hohe Anzahl unterschiedlicher Vertreter spiegelt hierbei die große Diversität der besetzten ökologischen
Nischen wieder. Ermöglicht wird die Anpassung beispielsweise an widrige Umweltfaktoren
durch einen komplexen und hoch funktionellen Zellwandaufbau. Diese 50 - 200 nm dicke Schicht
setzt sich aus Chitin und b-1,3-/ b-1,6-Glukanen zusammen die weitere organismenspezifische Modifikationen
beinhaltet. Die b-1,3-Glukane innerhalb dieses Netzwerks bilden tripelhelikale Überstrukturen
und sorgen in Verbindung mit dem daran gebundenen Chitin, zu einem stabilen Grundgerüst.
Innerhalb der stark verzweigten Architektur der pilzlichen Zellwand erfüllt eine Vielzahl an sekretierten
Proteinen diverse Aufgaben.
In dieser Arbeit stehen die Familien der SUN- und CFEM-Proteine im Fokus. SUN-Proteine sind
bei der Remodellierung der b-1,3-Glukanstrukturen innerhalb der pilzlichen Zellwand beteiligt. Für
die C-terminale SUN-Domäne aus Saccharomyces cerevisiae konnte über SPR und HDX-MS Untersuchungen
die Bindungsstelle gegen Laminarin, einem b-1,3-Glukan mit b-1,6-
Glucoseverzweigungen [7:1], gezeigt werden. Molekulardynamische Simulationen für die Interaktion
von ScSun4C gegen Curdlan, einem unverzweigten b-1,3-Glukan, zeigten hierbei ein stabiles Bindungsverhalten
über 100 ns. Auf diesen Erkenntnissen aufbauend können zwei Funktionsmodelle der
C-terminalen SUN-Domäne geschlussfolgert werden. Die SUN-Domäne als neuartige, reversible
Docking-Einheit innerhalb des b-Glukanmaterials, oder als Tripelhelix entwindende Glukanhelikase.
Letztere sorgt für ein Entwinden der thermodynamisch begünstigten Tripelhelix und einem dadurch
schnelleren Abbau durch endo-/exo-Glukosidasen. AFM-Untersuchungen können weiterhelfen die
beschriebenen Modelle zu verifizieren.
CFEM-Proteine können nach phylogenetischen Analysen in mehrere distinkte Gruppen, mit unterschiedlichen
Aufgaben und Funktionen unterteilt werden, die durch zusätzliche strukturbasierte Erkenntnisse
bestätigt werden können. Pga7-Orthologe sind bei der Akquisition von Hämin aus Hämoglobin
und dessen Weiterleitung ins Zellinnere beteiligt. Die Bindung gegen Hämin zeigt hierbei
eine zeitliche Abhängigkeit, sodass ein zweistufiger Bindungsprozess mit einer strukturellen Reorganisation
geschlussfolgert werden kann. Für Ccw14-Orthologe, die bei der Quervernetzung der Zellwand
beteiligt sind, konnte hingegen keine Häminbindung beobachtet werden. Die Interaktion von
Ccw14-Orthologen zu endo-Glukosidasen wie Bgl2 könnte hierbei wichtige Fragen zur gruppenspezifischen
Funktion beantworten.The fungal kingdom is one of the most diverse lifeforms found on earth. Hereby the manifold number
of different subspecies reflects their populated ecological niches. The fungal cell wall is a complex
and highly functional organelle that allows adaptation to adverse environmental conditions like
change in osmolarity. This 50 – 200 nm thick layer is formed by a basic set-up from chitin and b-
1,3-/ b-1,6-glucans and further species specific content. Within this heavily cross-linked network the
b-1,3-glucans form triple helical structures that are then linked to the chitin moiety. This corecontent
of b-glucans and chitin is primarily responsible for the robustness of the fungal cell wall. In
the cross–linked space of the inner cell wall an enormous number of secreted proteins perform various
roles.
This work will focus on the two groups of SUN- and CFEM-proteins. SUN-proteins play a role during
the cell wall remodelling process of b-1,3-glucans. SPR and HDX-MS experiments for the Cterminal
SUN-domain of Saccharomyces cerevisiae showed active binding towards Laminarin, a b-1,3-
glucan with additional b-1,6-glucose linkage [7:1]. Molecular dynamic simulations of ScSun4C with
bound curdlan, an unlinked triple helical b-1,3-glucan, showed stable binding during the whole calculation
of 100 ns. These binding results combined with structural information of the C-terminal
SUN-domain lead to two hypothetical models. The SUN-domain as a novel, reversible b-glucan
docking unit or as a triple helical b-glucan unwinding domain. This glucan helicase like behaviour
unwinds hereby the triple helical form and passes one single b-glucan strand through its tunnel. This
single b-glucan then can be easily hydrolysed by endo-/exo-glucanase. Atomic force microscopy could
verify this glucan helicase functionality
CFEM-Proteins show in phylogenetic analysis distinct groups with cluster specific functions. That is
in accordance with structural information from the protein structure of Candida albicans Csa2 a
Pga7-like protein. This group of Pga7-like proteins is involved in heme-iron acquisition from haemoglobin
and the transport inside the cell. A time dependent heme binding mechanism could be observed
for Pga-like proteins with a two-step binding mode and a structural reorganisation within the
binding pocket. Ccw14-like CFEM-proteins lack the heme-binding functionality. This group plays a
role in cross-linking the inner cell wall compartment. The interaction of Ccw14 from Saccharomyces
cerevisiae with Bgl2, an endo-glucanase could solve the mystery about this group
Structural and functional analysis of non-canonical tandem-thioesterases
No full textNonribosomal peptide synthetases (NRPS) are known to produce a diverse range of bioactive natural products, like antibiotics, immunosuppressants or cytostatics. These pharmacologically important properties have attracted increased scientific interest, on the one hand to advance the discovery of new natural products from nature. On the other hand, the mechanistic elucidation of these complex synthetic pathways enables the catalytic properties of individual domains to be used for targeted drug design. Regarding mechanistic elucidation, research is particularly dependent on the structural elucidation of individual domains and modules in order to reveal functionally essential interactions, to investigate substrate specificities and facilitate the targeted modification of certain functional units. A particular interest here is the functional analysis of termination units, such as thioesterase (Te), which is indispensable for product release from the NRPS. In recent years, the interest has grown in particular in the study of the unusual tandem Te, which has been described predominantly in NRPS systems whose biosynthesis seem to represent predominantly macrocyclic natural products.
In this work, the structural and functional analysis of unusual tandem Te based on the model organism Xenorhabdus nematophila ATCC 19061 is described. Previous work by BODE et al. has already shown that the biosynthetic gene cluster of xenoamicin, a member of the cyclic depsipeptide group, harbors this didomain. One of the focal questions of this work deals with the structure elucidation of this tandem-XncTe, which is described in more detail here at a resolution of 3.4 Å. In addition, a C-terminal subdomain is revealed at a resolution of 1.9 Å, reveals properties of the isolated subdomains. The structural information is also linked to dynamic properties in solution, which are also spectrometrically classified via hydrogen/deuterium exchange. Here, the focus relies on the subdomain arrangement in particular, as well as Te-known lid features. In a further bioinformatic approach, the natural occurrence of tandem-Te is also highlighted and illuminated in greater depth using collected sequence information.
A further part of this paper, the protein biochemical characterization of the orthologous 2-F4 NRPS tandem Te of unknown origin is also described. The ortholog, which shares similarity to the syringomycin synthetase from P. syringae, is successfully recombinantly overproduced and purified for the first time. Based on this, the solubilized C-terminal partial structure is presented, which shows a strongly conserved structure to tandem Xnc-Te. The first dynamic investigations could also be carried out here.Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind dafür bekannt eine vielfältige Palette an bioaktiven Naturstoffen zu produzieren, deren Wirkungsbereiche häufig im Einsatz als Antibiotikum, Immunsuppressivum oder Zytostatika sind. Diese pharmakologisch bedeutsamen Eigenschaften haben verstärkt wissenschaftliches Interesse auf sich gezogen, um zum einen die Entdeckung neuer Naturstoffe voran zu treiben. Zum anderen erhofft man sich, über die mechanistische Aufklärung dieser komplexen Synthesestraßen, die katalytischen Eigenschaften für zielgerichtetes Medikamentendesign nutzen zu können. Im Hinblick auf die mechanistische Aufklärung ist die Forschung besonders auf die strukturelle Aufklärung einzelner Domänen und Module angewiesen um für die Funktion essentielle Interaktionen aufzuzeigen, Substratspezifitäten zu erklären und die gezielte Modifikation bestimmter Funktionseinheiten zu erleichtern. Ein besonderes Interesse gilt hier der Funktionsanalyse von Terminationseinheiten, wie der Thioesterase (Te), die für die Produktfreisetzung aus dem NRPS erforderlich ist. Innerhalb der letzten Jahre wuchs das Interesse insbesondere für die Erforschung der ungewöhnlichen Tandem-Te, die bislang überwiegend in NRPS Systemen beschrieben wurde, deren Biosynthese überwiegend makrozyklische Naturprodukte zu vertreten scheint.
In dieser Arbeit ist die strukturelle und funktionelle Analyse von ungewöhnlichen Tandem-Te auf Basis des Modellorganismus Xenorhabdus nematophila ATCC 19061 beschrieben. In voran gehenden Arbeiten von BODE et al. konnte bereits gezeigt werden, dass das biosynthetische Gencluster von Xenoamicin, einem Naturstoff aus der Gruppe der zyklischen Depsipeptide, diese Didomäne beherbergt. Eine im Fokus stehende Fragestellung dieser Arbeit befasst sich mit der kristallographischen Strukturaufklärung dieser Tandem-XncTe, die bei einer Auflösung von 3.4 Å hier genauer beschrieben wird. Zudem zeigt eine C-terminale Teilstruktur, bei einer Auflösung von 1.9 Å, Eigenschaften der isolierten Subdomänen auf. Die strukturellen Informationen werden zudem mit dynamischen Eigenschaften in Lösung verknüpft, die unter anderem über Wasserstoff / Deuterium-Austausch massenspektrometrisch eingeordnet werden. Hierbei steht insbesondere die Subdomänen-Anordnung, sowie Te-bekannte Lid-Merkmale im Vordergrund. In einem weiterführenden bioinformatischen Ansatz wird zudem das natürliche Vorkommen der Tandem-Te hervorgehoben und anhand von gesammelten Sequenzinformationen tiefgehender beleuchtet.
In einem weiteren Teil dieser Arbeit wird zudem die proteinbiochemische Charakterisierung der orthologen 2-F4 NRPS Tandem-Te unbekannten Ursprungs beschrieben. Das Ortholog, welches Ähnlichkeit mit der Syringomycin-Synthetase aus Pseudomonas syringae aufweist, wird erstmals erfolgreich rekombinant überproduziert und gereinigt. Hierauf aufbauend wird die gelöste C-terminale Teilstruktur präsentiert, die eine stark konservierte Struktur zur Tandem-Xnc-Te aufweist. Auch konnten hier erste dynamische Untersuchungen durchgeführt werden
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