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The Red Cell Life-Cycle From Erythropoiesis to Clearance
No full textThis eBook is a collection of articles from a Frontiers Research Topic. Frontiers Research Topics are very popular trademarks of the Frontiers Journals Series: they are collections of at least ten articles, all centered on a particular subject. With their unique mix of varied contributions from Original Research to Review Articles, Frontiers Research Topics unify the most influential researchers, the latest key findings and historical advances in a hot research area! Find out more on how to host your own Frontiers Research Topic or contribute to one as an author by contacting the Frontiers Editorial Office: frontiersin.org/about/contac
The Red Cell Life-Cycle From Erythropoiesis to Clearance
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The influence of hypoxia in erythropoiesis and morphology of red blood cells in sickle cell disease and hereditary spherocytosis.
Full text linkDie Lebensfahigkeit menschlicher Zellen h ¨ angt in hohem Maße vom Sauerstoff ab, der von den roten ¨
Blutkorperchen transportiert und zur Verf ¨ ugung gestellt wird. In dieser Arbeit wird untersucht, wie ¨
Sauerstoff die Physiologie und Pathophysiologie jener roten Blutkorperchen beeinflusst. Die Arbeit ¨
ist in zwei wesentliche Teile gegliedert.
Zunachst werden Ergebnisse einer gr ¨ oßeren Studie mit Probanden vorgestellt, die in großer H ¨ ohe ¨
(3450 m) durchgefuhrt wurde. In dieser H ¨ ohe sorgt der reduzierte Luftdruck f ¨ ur eine Abnahme ¨
der Sauerstoffsattigung im Blut und f ¨ uhrt so zu einer erh ¨ ohten Produktion an roten Blutk ¨ orperchen ¨
(Erythropoese). Nach der Ruckkehr aus großer H ¨ ohe f ¨ allt die Zahl an roten Blutk ¨ orperchen nach ¨
kurzer Zeit wieder auf das vorherige Niveau Es ist bislang nicht verstanden, ob die neugebildeten
roten Blutzellen dazu abgebaut werden. Der hyptothetische Mechanismus der Neozytolyse (engl.
Neocytolisis) geht davon aus, dass ausgerechnet die neu gebildeten, roten Blutzellen als erste wieder
abgebaut werden, wenn die Ruckkehr auf Meeresniveau erfolgt. Die wissenschaftliche Fragestellung, ¨
die im Rahmen dieser Studie beantwortet wurde, ist, ob und in welchem Maß Neocytolyse nach einem
3-wochigen Aufenthalt in großer H ¨ ohe stattfindet. Dazu wurden zun ¨ achst Untersuchungen an aller ¨
Probanden mittels in-vitro Zellkulturen durchgefuhrt, um sowohl die Erythropoese als auch (neu ent- ¨
standende) Retikulozyten zu charakterisieren. Die Ergebnisse zeigen eine beschleunigte Reifung der
Vorlauferzellen in Zellkulturen bei niedrigerem Sauerstoffgehalt (3%) verglichen mit normaler Atmo- ¨
sphare (20%) und eine unerwartet verbesserte ¨ Uberlebensrate der Retikulozyten. Dies stimmt mit dem ¨
Ergebnis der Studie uberein, dass nach der R ¨ uckkehr von der gew ¨ ahlten H ¨ ohe keine Neozytolyse, d.h. ¨
kein bevorzugter Abbau von neu gebildeten roten Blutzellen, auftrat, was die Hypothese eines selektiven, vorzeitigen Abbaus von unreifen roten Blutzellen widerlegt. Weiterhin wurde in der Zellkultur
unter verringerter Sauerstoffgabe eine erhohte Zahl bikonkaver Zellen beobachtet, was eine typische ¨
Gestalt fur einen fortgeschrittenen Reifegrad ist. Diese Beobachtung k ¨ onnte ein Anhaltspunkt daf ¨ ur¨
sein, dass der Reifeprozess von roten Blutzellen durch die Reduzierung des atmospharischen Sauer- ¨
stoffgehaltes begunstigt werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zus ¨ atzlich ein Protokoll zur ¨
Isolation der Retikulozyten vom Vollblut der Probanden entwickelt, um die pure Zell-RNA jeweils
vor und in großer Hohe zu sequenzieren. Jedoch muss die Ausbeute an RNA weiter optimiert werden, ¨
um einen detaillierten Vergleich der Gen-Expressions-Niveaus anstellen zu konnen. ¨
Der zweite Teil der Arbeit konzentriert sich auf die Untersuchung der Morphologie der roten Blutkor- ¨
perchen bei zwei Arten von Anamie. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der roten Blutk ¨ orperchen ¨
gegenuber Formvariationen, mussten die Proben vor jeder experimentellen Manipulation fixiert wer- ¨
den. Dazu musste ein angemessenes Verfahren entwicklelt werden, das im Rahmen dieser Arbeit
vorgestellt wird. Zunachst wird auf die Sichelzellenan ¨ amie eingegangen, bei der es unter Desoxy- ¨
genierung des Hamoglobins zur starken Verformung der roten Blutk ¨ orperchen (Sichelzellen) kommt. ¨
Dies beintrachtigt sowohl deren Funktion als auch Lebensdauer. Eine quantitative Analyse von Zell- ¨
Projektionsbildern aus konfokalen Mikroskopieaufnahmen wurde mit Hilfe eines maßgeschneiderten
Computerprogramms im Rahmen einer klinischen Pilotstudie der Phase II zur Therapie der Sichelzellanamie durchgef ¨ uhrt. Es konnte gezeigt werden, dass diese Methode in Kombination mit anderen ¨
experimentellen Verfahren ein wirkungsvolles Instrument zur Beurteilung des Zellhydratationszustands von Sichelzellenpatienten ist. Daher kann diese Technik zur Beurteilung der Wirksamkeit
von Sichelzellen-Therapien oder zur Beurteilung des Zustands der roten Blutkorperchen eines Pa- ¨
tienten verwendet werden. Da die roten Blutkorperchen bei verschiedenen Arten von An ¨ amie auch ¨
verschiedene Formvariationen aufweisen, wurde eine weitere Blutkrankheit, die hereditare Sph ¨ arozy- ¨
tose, untersucht. In diesem Fall lag der Schwerpunkt auf der automatisierten Formerkennung der roten
Blutkorperchen, die in der Regel manuell durchgef ¨ uhrt wird und daher einer Bewertungsinkonsistenz ¨
unterliegt. Die Untersuchung nutzt die 3D-Rekonstruktion der Zellen aus konfokalen Mikroskopieaufnahmen und die anschließende Formerkennung mittels kunstlicher neuronaler Netze. Die Beurteilung ¨
dieses Systems zeigte sowohl eine sehr gute Erkennungsrate, hohe Prazision, eine schnelle Prozesszeit, ¨
als auch ein objektives Ergebnis verglichen mit der manuellen Klassifikation. Verglichen mit der
Analyse von 2D Mikroskopieaufnahmen von Blutabstrichen, konnten durch die Auswertung korrespondierender 3D Aufnahmen außerdem andere Formspektren abgeleitet werden. Dies legt die
Empfehlung nahe, die manuelle Klassifizierung von Zellformen (Stand der Technik) im Kontext von
hereditarer Sph ¨ arozytose zu ¨ uberdenken.Human cell viability highly depends on oxygen, which is carried and provided by red blood cells.
This thesis aimed to investigate how oxygen influences physiology and pathophysiology of red blood
cells and is divided in two main parts.
The first one presents results that are part of a larger study performed at high altitude (3450 m).
Here, the reduced air pressure causes a decrease in blood oxygenation, which is balanced by an increase in red blood cells production (erythropoiesis). Upon return from high altitude, the amount of
red blood cells is restored to the original levels within a few days, which is in contrast with the average
red blood cell lifespan of 120 days. The reasons leading to such red blood cells premature clearance
are not well understood. A hypothetical mechanism previously proposed is defined as neocytolisis,
i.e. the selective clearance of the red blood cells formed at high altitude upon return to sea level. The
scientific question of the study was therefore to assess if and how neocytolisis occurs after a 3-week
stay at high altitude. The investigations performed in this thesis involved in vitro culture of erythroid
precursors of the donors participating in the study to characterize both erythropoiesis and the obtained immature red blood cells, namely reticulocytes. Results highlighted an accelerated maturation
of erythroid precursors in cultures performed at lower oxygen (3%) compared to atmospheric oxygen
(20%) ones and an unexpected improved cell survival of the obtained reticulocytes. This was in accordance with the finding that after the stay at the chosen altitude no neocytolisis occurred, denying
the hypothesis of a higher fragility of cells formed at low oxygen causing their selective premature
clearance upon return from high altitude. Moreover, cultures performed at low oxygen resulted in the
formation of more biconcave cells, the typical shape of mature red blood cells. This suggests that
reducing oxygen levels in cultures may contribute to advance their maturation in vitro. In addition to
cell cultures, another objective was to perform RNA sequencing of isolated reticulocytes from whole
blood of the donors to compare pre- and high altitude conditions. A protocol for the isolation of a
pure fraction of reticulocytes and their RNA was developed. However, total RNA yield needs to be
increased to perform an accurate comparison of gene expression levels.
The second part of the thesis focused on studying red blood cell morphology in two types of anemia. Because of the high sensitivity of red blood cells to shape variation, samples were always fixed
before any experimental manipulation. A thorough study describing how to perform red blood cell
fixation is presented. The first blood disease of study was sickle cell anemia. In this pathology, deoxygenation of hemoglobin causes the deformation of red blood cells to the shape of a sickle that
impairs their functions and lifespan. The quantitative analysis of cell projections from confocal images by means of a customized computer program was employed within a pilot phase II clinical trial
for the therapy of sickle cell disease. The obtained results combined with other experimental evaluations showed that red blood cell shape analysis of sickle cell disease patients is a simple but powerful
tool to evaluate cell hydration state. Therefore, this technique may be used for the assessment of
the efficacy of sickle cell disease therapies or to evaluate the state of red blood cells of a patient.
Since red blood cells display shape variations in different types of anemia, a second blood disease
was investigated, namely hereditary spherocytosis. In this case, the focus was the automation of red
blood cells shape recognition, which is usually performed manually and therefore subjected to evaluation inconsistency. The investigation made use of 3D cell reconstructions from confocal images and
automated shape recognition by means of artificial neural networks. System benchmarks showed a
good recognition performance, high accuracy, fast processing time as well unbiased results compared
to the manual classification. Moreover, the application of 3D imaging in contrast to the traditional
2D-microscopy typically employed in blood smear analysis revealed a different red blood cell shapes
spectrum. These results therefore suggest to revise the state-of-the art manual shape classification
applied in hereditary spherocytosis
High-Throughput Automated Patch Clamp Investigations on Ion Channels in Erythrocytes
Full text linkTrotz ihrer morphologischen Einfachheit ist die Membran der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) mit einer Reihe von Transportern und Ionenkanälen ausgestattet, die bisher nicht vollständig charakterisiert sind und deren biologische Rolle noch wenig verstanden ist. Die meisten Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen messen summierte Effekte großer Zellpopulationen und verbergen so jede mutmaßliche Variabilität von Zelle zu Zelle. Die Patch-Clamp-Technik hat sich als effektives Werkzeug zur Entdeckung und Charakterisierung von Ionenkanälen auf Einzelzellenebene erwiesen. Dies besonders wichtig für Erythrozyten von Säugetieren, die eine hohe Heterogenität der Leitfähigkeit zwischen verschiedenen Spendern, und auch zwischen Zellen desselben Spenders aufweisen (Kaestner et al., 2004; Minetti et al., 2013). Die Entwicklung des automatisierten Patch-Clamps ermöglichte es, eine hohe Anzahl von Zellen gleichzeitig unter identischen experimentellen Bedingungen zu untersuchen, wodurch Zellheterogenität erstmals umfassend bestimmt wurde.
In dieser Arbeit wurden Gárdos- und Piezo1-Kanäle als Hauptuntersuchungsziele ausgewählt, da sie eine prominente Rolle in erythrozytären Erkrankungen, im Einzelnen Gárdos-Kanalopathie (Fermo et al., 2017) und hereditäre Xerozytose (Zarychanski et al., 2012; Bae et al., 2013), spielen. Ziel dieser Arbeit war es, automatisierte Patch-Clamp-Assays zur Charakterisierung dieser Kanäle in Erythrozyten zu entwickeln.
Es gibt bisher nur vereinzelte Publikationen zu whole-cell Patch-Clamp-Messungen von Gárdos-Kanälen in Erythrozyten (Grygorczyk et al., 1984; Wolff et al., 1988), wahrscheinlich aufgrund der geringen Expression des Proteins in zirkulierenden Erythrozyten. Der hochparallelisierte Ansatz der automatisierten Patch-Clamp-Technologie ermöglicht zuverlässig die Identifizierung von Gárdos-Strömen in Zelltypen mit einer oft geringen Anzahl von Kanälen und einer großen Heterogenität der Expression, wie bei Erythrozyten.
Bisherige Piezo1-Kanaluntersuchungen zeigen, dass die Substanz Yoda1 Piezo1-Ströme bewirken kann, die empfindlich auf GdCl3 (unspezifischer Inhibitor dehnungsaktivierter Kanäle), nicht jedoch auf TRAM-34 (spezifischer Gárdos-Kanalinhibitor) reagieren. Die Anwendung dieses Assays auf Erythrozyten von Patienten mit einer neuartigen PIEZO1 R2110W-Mutation zeigte eine erhöhte Anzahl der Yoda1-empfindlichen Zellen und eine stärkere Antwort auf Yoda1 bei Patienten im Vergleich zu Kontroll-Erythrozyten. In Kombination mit der Untersuchung der Proteinstruktur, die den R2110W-Rests in einem gating-sensitiven Bereich des Kanals lokalisiert, deuten die Patch-Clamp-Ergebnisse darauf hin, dass die neue Piezo1-Mutation eine gain-of-function-Mutation ist (Rotordam et al., 2019).
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die automatisierte Patch-Clamp-Methode robuste Assays zur Untersuchung von Ionenkanälen (Gárdos und Piezo1) in Primärzellen liefert. Die Hochdurchsatztechnologie ermöglichte die Entwicklung eines zuverlässigen Assays für gering exprimierte Ionenkanäle bei hoher Heterogenität der Zellen. So war es möglich, eine neuartige Kanalmutation auf funktioneller Ebene direkt in Patientenzellen zu charakterisieren, ohne die Mutation in einem heterologen Expressionssystem exprimieren zu müssen. Dieser Ansatz kann zum Nachweis und zur Charakterisierung weiterer Kanalopathien verwendet werden, die nicht auf Erythrozyten beschränkt sind, und kann generell als zur Gensequenzierung komplementärer Routine-Screening-Assay für Krankheiten dienen, die mit Ionenkanalstörungen zusammenhängen.Despite the morphological simplicity, the Red Blood Cell (RBC) membrane is endowed with a number of transporters and ion channels, yet not fully characterized and whose biological role is still poorly understood. Most of the techniques used to investigate ion channels are addressed to large populations of cells, thus concealing any putative cell-to-cell variability. The patch clamp technique has proven to be a valid tool for the discovery and characterization of ion channels at a single-cell level. This is of particular relevance for mammalian RBCs, which present a high heterogeneity of conductance not only between different donors but also among cells of the same donor (Kaestner et al., 2004; Minetti et al., 2013). The advent of automated patch clamp allowed to probe an increased number of cells at the same time under identical experimental conditions, thus tackling cell heterogeneity issues.
In this thesis, Gárdos and Piezo1 channels were selected as main targets of investigation due to their relevance in RBC-related diseases, i.e. Gárdos channelopathy (Fermo et al., 2017) and hereditary xerocytosis (Zarychanski et al., 2012; Bae et al., 2013). The aim of this work was to develop automated patch clamp assays for characterizing those channels in RBCs.
As for Gárdos channels, whole cell recordings reported so far are fragmentary probably due to the low expression of the protein in circulating RBCs (Grygorczyk et al., 1984; Wolff et al., 1988). By increasing the number of cells recorded at the same time, the automated patch clamp technology allowed to identify Gárdos-mediated currents in primary cells with a low-copy number of channels and a large heterogeneity of conductance as RBCs.
Piezo1 channels investigations confirmed that application of Yoda1 alone is able to elicit currents sensitive to GdCl3 (non-specific stretch-activated channels inhibitor) but not TRAM-34 (specific Gárdos channel blocker). When transferred to patients carrying a novel PIEZO1 R2110W mutation, the assay revealed that the number of responders and the magnitude of the response to Yoda1 increased in patient compared to control RBCs. This result, combined with structural studies identifying the R2110W residue in a gating sensitive area of the channel, suggested that the novel Piezo1 mutation is gain-of-function (Rotordam et al., 2019).
Altogether, this work demonstrates that automated patch clamping provides robust assays to investigate ion channels (Gárdos and Piezo1) in primary cells. The high-throughput technology allowed to tackle issues as response heterogeneity and low expression of the channels, and to characterize a novel channel mutation at a functional level directly from patient cells, without having to express the mutation in a heterologous expression system. This approach may be used to detect other channelopathies not limited to RBCs and may serve as routine screening assay for diseases related to ion channel dysfunctions in general, complementary to gene sequencing
Space anemia unexplained: Red blood cells seem to be space-proof
No full textRecently, an article with the title “Hemolysis contributes to anemia
during long-duration space flight” by Trudel et al. has been published
in Nature Medicine. The authors propose that accelerated hemolysis
of circulating red blood cells (RBCs) significantly contributes to “space
anemia.” After monitoring Hb-concentration [Hb] and exhaled carbon
monoxide (CO) in 14 astronauts during 5 months-long space missions
on the International Space Station (ISS), and up to one year after
return, they base this conclusion on an ≈11% decrease in [Hb]
between pre- and post-mission values, together with a ≈50% increase
in the rate of CO elimination, which was entirely ascribed to extravascular
hemolysis of RBCs. In our opinion, their interpretation is not
consistent with the data, and we believe that the term “anemia” is not
justified, because [Hb] was at most decreased to low-normal. We
propose here alternative explanations both for the low [Hb] and for
the elevation of exhaled CO, which, of course, require future experimental
proof
Untersuchungen zur Regulation des intrazellulären Calciums in Physiologie und Pathophysiologie humaner und muriner Erythrozyten
Full text linkCalcium übernimmt in Erythrozyten, wie auch in vielen anderen Zellen, die wichtige Rolle eines sekundären Botenstoffs. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zum besseren Verständnis dieser Rolle in der Physiologie und Pathophysiologie von Erythrozyten beizutragen. Daher wurden im ersten Teilprojekt dieser Arbeit Untersuchungen gemacht zum intrazellulären Ca2+-Gehalt humaner pathologischer Erythrozyten von Patienten mit seltenen hämolytischen Erkrankungen. Es konnte festgestellt werden, dass Erythrozyten von Patienten mit Hereditärer Sphärozytose, Hereditärer Xerozytose und Gardos-Channelopathie signifikant erhöhte Werte an freiem intrazellulären Calcium im Vergleich zu Erythrozyten gesunder Kontrollblutspendern aufweisen. Für die ebenfalls untersuchten Patienten mit Enzymopathien und uncharakterisierter hämolytischer Anämie wurde keine eindeutige Änderung der Ca2+-Konzentration gefunden. Zusammen mit weiteren Daten aus der Literatur deuten diese Resultate darauf hin, dass ein erhöhter intrazellulärer Ca2+-Gehalt in Erythrozyten ursächlich für den verfrühten Abbau der Zellen in hämolytischen Krankheiten ist. Dieser Mechanismus scheint allgemein gültig sein, wobei sich der Signalweg des Ca2+-Einstroms für jede Erkrankung unterscheidet. Zur Entwicklung neuer Medikamente, die auf eine Inhibition dieses Ca2+-Einstroms als bessere Therapiemöglichkeit anämischer Patienten abzielen, bedarf es jedoch weiterer Forschung. Das zweite Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Lysophosphatidsäure Signalweg, der in murinen und humanen Erythrozyten zu einem Einstrom von extrazellulärem Calcium in die Zellen führt. Diese Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Gehalts steht in Verbindung mit der Aggregation der Erythrozyten als aktiver Teil der Blutgerinnung. Der Lysophosphatidsäure Signalweg ist daher auch zur Behandlung von Thrombosen von pharmakologischem Interesse. Im Detail zeigen die an humanen und murinen Erythrozyten durchgeführten Untersuchungen zum Signalweg, dass die Aktivität des am Signalweg beteiligten TRPC6 Kanals, neben der PKCα, durch einen Komplex aus FKB12 und Calcineurin reguliert wird. Zudem konnte gezeigt werden, dass eine zusätzliche mechanosensitive Komponente im Signalweg existiert. Ob es sich dabei um den Kanal Piezo1 handelt, muss in weiteren Untersuchungen bestätigt werden. Auf Basis des Lysophosphatidsäure Signalweges wurde im dritten Teilprojekt die Herkunft des TRPC6 Kanals in der Membran von Erythrozyten untersucht. Für humane Erythrozyten lässt sich der Kanal weder auf Proteom- noch Transkriptomebene detektieren. Auch funktionell kann TRPC6 nur in Erythrozyten, nicht in Retikulozyten nachgewiesen werden. Als Hypothese dieses Projekts wurde untersucht, ob es zu einem Transfer des Kanals von anderen Zellen auf Erythrozyten kommt. Dazu wurden Transfusionsversuche von Erythrozyten aus TRPC6 Knockout Mäusen in Wildtyp Mäuse durchgeführt. Anschließend wurde zur Beobachtung eines möglichen Proteinaustauschs der Lysophosphatidsäureinduzierte Ca2+-Einstrom in den transfundierten Erythrozyten untersucht. Als Grundlage hierfür wurden mehrere Ansätze zur Markierung von Erythrozyten vor der Transfusion getestet. Die Methode der in vivo-Biotinylierung zeigte sich nicht als geeignet zur mikroskopischen Detektion markierter Erythrozyten nach Transfusion. Eine Markierung der Zellen mittels Membranfarbstoffen als auch eine endogene Markierung der Zellen durch Expression eines Fluoreszenzproteins waren hingegen erfolgreich. Durchgeführte Transfusionsversuche auf Basis beider Methoden zeigten einen Anstieg des Lysophosphatidsäure-induzierten Ca2+-Einstroms in TRPC6-Knockout Erythrozyten nach Transfusion. Hierdurch kann auf einen Transfer des TRPC6 Kanals in die Membran der Knockout Erythrozyten von Zellen der Wildtyp Maus geschlossen werden. Der Transfer scheint dabei vermehrt oder auschließlich bei Retikulozyten vorzukommen. Eine Beteiligung der Milz an diesem Transfer wurde ebenfalls untersucht, konnte jedoch nicht belegt werden. Zum Ablauf, Ort und weiterem Verständnis des Proteintransfer müssen zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden. Ebenfalls soll die Frage geklärt werden, ob ein Austausch von Proteinen auch bei humanen roten Blutzellen auftritt.Calcium plays an important role as a second messenger, in red blood cells as well as in many other cell types. The aim of this study was to contribute to a further understanding of this role in the physiology and pathophysiology of red blood cells. In the first part of this thesis, pathologic human red blood cells from patients with rare hereditary anemias were analyzed for their intracellular calcium content. The results of this study showed that red blood cells from patients with hereditary spherocytosis, hereditary xerocytosis and Gardos
channelopathy have significantly increased levels of free intracellular calcium in comparison to red blood cells from healthy donors. For patients with enzymopathies and uncharacterized hemolytic anemia there was no clear change in the intracellular calcium. Together with data from the literature, these findings indicate that an increased intracellular calcium content might be responsible for the premature elimination of red blood cells from the blood stream. This mechanism seems to have to a general scope with different pathways of calcium entry
in different diseases. More research is needed for the development of drugs aiming on the inhibition of this calcium increase. The second part of this thesis deals with the lysophosphatidic acid signaling pathway, which
leads to an uptake of extracellular calcium in human and murine red blood cells. This increase in intracellular calcium is associated with an aggregation of red blood cells as an active part in thrombus formation. The lysophosphatidic acid signaling pathway is therefore also an interesting pharmacological target for the treatment of thrombosis. The results of the experiments on murine and human red blood cells show, that TRPC6, a channel involved in this pathway, is regulated by PKCα and a protein complex consisting of FKB12 and calcineurin. Furthermore, the results hint to the involvement of a mechanosensitive channel in the signaling cascade. To confirm that this channel is Piezo1, further research needs to be done. Based on the lysophosphatidic acid signaling pathway, the origin of the TRPC6 channel in the membrane of red blood cells was explored in the third part of this thesis. For human red blood cells, it was not yet possible to detect the channel on a proteome- or transcriptome level. Functional evidence is also limited to mature red blood cells and missing in reticulocytes. As a hypothesis of this project, a possible transfer of the channel between red blood cells and other cell types was investigated. For this purpose, transfusion experiments of red blood cells from TRPC6 knockout mice to wildtype mice were performed. Subsequently, the lysophosphatidic acid induced calcium entry was analyzed in the transfused cells to visualize the potential transfer of the channel. Beforehand, several methods to label red blood cells for transfusion were tested. The method of in vivo biotinylation was not suitable for the microscopic detection of the cells after transfusion. Labeling the cells with membrane dyes as well as the endogenous expression of a fluorescent protein were successful. The results from the transfusion experiments based on
both labeling methods showed an increase in the lysophosphatidic acid induced calcium signal in TRPC6 knockout cells after transfusion. From these results, it can be concluded that there is a transfer of the channel to the membrane of TRPC6 knockout red blood cells from cells of the wildtype mouse. This transfer seems to occur enhanced or exclusively in reticulocytes. The contribution of the spleen in this process was analyzed but could not be proven. More research is needed to resolve further questions, especially whether a transfer of proteins also occurs in human red blood cells
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