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Virulence regulation of the whooping cough agent, Bordetella pertussis : signaling by the BvgS sensor-kinase
No full textBordetella pertussis est l’agent responsable de la coqueluche. Pour coloniser le tractus respiratoire humain, cette bactérie à Gram négatif, aérobie stricte, produit de nombreux facteurs de virulence dont l’expression est sous la dépendance du système à deux composants BvgAS. BvgS est un senseur-kinase dimérique. Chaque monomère est constitué de trois domaines putatifs de perception - deux domaines Venus flytrap périplasmiques et un domaine PAS cytoplasmique -, suivis du domaine enzymatique et deux autres domaines, de phospho-transfert et receveur, impliqués dans la cascade de phosphorylation. L’expression du régulon de virulence est activée suite à la phosphorylation par BvgS du régulateur de réponse BvgA. BvgS est en mode kinase à l’état basal, et la perception de basses températures ou de signaux chimiques comme les ions sulfate ou nicotinate cause son passage en mode phosphatase. L’étude présentée dans ce manuscrit vise à caractériser le senseur-kinase BvgS en analysant les domaines putatifs de perception ainsi que la transduction de signal qui s’effectue au sein de la molécule. L’étude de la portion périplasmique a permis de mettre en évidence, à l’état basal, un gradient de dynamique décroissant. En se fixant au domaine VFT2 proximal à la membrane, le nicotinate induirait une diminution de la dynamique du second lobe du VFT1, causée par la formation d’un bloc compact entre le domaine VFT2 et le deuxième lobe du domaine VFT1. Cette rigidification exercerait une tension sur les hélices α qui précèdent les segments transmembranaires, provoquant une transition de la portion cytoplasmique vers l’état phosphatase. La perception de modulateurs par le domaine VFT2 - ou possiblement la fixation d’un ligand dans la cavité du VFT1- modifierait cette dynamique et causerait le changement d’activité de BvgS. Ainsi, nous proposons un modèle dans lequel le VFT1 est considéré comme le moteur du système, lui impulsant une dynamique qui serait relayée ou atténuée par le domaine VFT2. Une recherche de ligands antagonistes pour le domaine VFT1 a été entreprise, selon l’idée que la fixation d’un ligand réduirait la dynamique de ce dernier. Au sein du dimère, des connecteurs prédits pour former des enroulements d’hélices α (‘coiled coil’) relient entre eux les domaines VFT et PAS, et les domaines PAS et kinase de BvgS. La transduction d’information entre les domaines périplasmiques et le site enzymatique de BvgS a été analysée par mutagénèse dirigée et ‘cysteine scanning’. Des contacts proches sont observés entre les hélices constituant le segment transmembranaire, qui ne semblent pas être modifiés après perception de modulateur. Nous suggérons donc un modèle de piston symétrique pour la transmission d’information au travers de la membrane. Le coiled coil putatif précédant le domaine PAS présente une certaine dynamique rotationnelle à l’état basal. La perception de modulateurs semble induire l’écartement de ces hélices, ce qui pourrait permettre un changement de l’interface des domaines PAS. L’étude de la topologie du domaine PAS confirme une modification de cette interface entre les modes kinase et phosphatase de BvgS. Enfin, le coiled coil reliant les domaines PAS et kinase est sujet à une forte dynamique rotationnelle à l’état basal, en accord avec un modèle de régulation de l’activité kinase proposé dans d’autres systèmes. Suite à la perception de modulateur, une rigidification marquée de ce coiled coil est observée, permettant le passage en mode phosphatase. L’existence de deux états dynamiques différents de ce coiled coil a également été mise en évidence en absence du domaine PAS.Ces études ont permis d’avancer dans la compréhension de BvgS et de proposer un modèle de la signalisation au sein de ce senseur-kinase, qui pourrait s’appliquer aux autres membres de la famille de BvgS.Bordetella pertussis is the agent of an acute and highly contagious respiratory disease, whooping cough. In order to colonize the human respiratory tract, this strictly aerobic Gram negative bacterium produces many virulence factors, the expression of which is regulated by the BvgAS two-component system. BvgS is a sensor-kinase composed of three putative domains of perception –two periplasmic Venus flytrap domains and a cytoplasmic PAS domain -, followed by the enzymatic domain and two other domains called phosphotransfert and receiver involved in the phophorelay. The expression of the virulence regulon is activated after the phosphorylation by BvgS of the response regulator BvgA. BvgS is in a kinase mode at the basal state, and the perception of low temperatures or chemical signals like sulfate ions or nicotinate causes a shift to the phosphatase state. The study presented in this manuscript has focused on the characterization of the BvgS sensor-kinase. We have analyzed its putative domains of perception and the mechanisms of signal transduction.Investigations into the dynamics of the periplasmic moiety has provided evidence for a decreasing gradient of dynamics from N to C-terminus at the basal state. Nicotinate binding to the membrane-proximal VFT2 domains decreases the dynamics of the second lobe of VFT1. Tighter interactions between the latter and the VFT2 domain cause a tension on the α helices that precede the transmembrane segments, triggering the transition to the phosphatase state of the enzymatic portion. Perception of modulator by the VFT2 domains –or possibly binding of a ligand in the VFT1 cavity- thus appears to modify periplasmic dynamics, which shifts BvgS activity. We propose that the VFT1 domains are the motor for BvgS activity, and their dynamics are relayed or attenuated by the VFT2 domains. A search for antagonistic VFT1 ligands has been undertaken, along the idea that ligand binding may reduce their dynamics.The VFT and PAS domains, and the PAS and kinase domains are joined to each other by long α helices predicted to form coiled coils. We performed directed mutagenesis and cysteine scanning analyses to decipher signal transduction between the periplasmic domains and the enzymatic moiety of BvgS. The close contacts between the helices of the transmembrane segment are not modified after perception of the modulator, suggesting that signal transduction across the membrane is mediated by symmetrical piston motions. The putative coiled coil before the PAS domain shows rotational dynamics at the basal state. Modulator perception causes the helices to splay, and this motion may modify the PAS domains interface. Our topology analyses of the PAS domain confirm that changes occur at this interface between the kinase and phosphatase states of BvgS. Finally, the coiled coil between the PAS and kinase domains presents a strong rotational dynamics at the basal state, which is consistent with the model of regulation of kinase activity proposed for other sensor-kinases. After perception of a modulator, this coiled coil becomes more rigid, allowing the shift to the phosphatase state. The occurrence of two states of dynamics for this coiled coil has also been demonstrated in the absence of the PAS domain.These studies have advanced our understanding of BvgS and allow us to propose a model of signaling by this sensor-kinase, which may apply more broadly to other family members
Virulence regulation in Bordetella pertussis : Bvgs as an original model of sensor from a two- component system
No full textLa virulence de Bordetella pertussis, agent de la coqueluche, est liée à un arsenal de facteurs de virulence dont l’expression est régulée par le système à deux composants BvgAS. BvgA est le régulateur de réponse et BvgS le capteur du système, qui possède 3 domaines putatifs de perception de signaux. Il s’agit de 2 domaines périplasmiques « Venus FlyTrap » (VFT), reliés par un segment transmembranaire à un domaine PAS (Per-ARNT-Sim) cytoplasmique qui fait la jonction avec l’histidine-kinase. Les signaux perçus par ces domaines capteurs sont inconnus, mais une température de 37°C est suffisante pour maintenir le système actif en laboratoire. Cette activité peut être modulée négativement par des composés chimiques, comme le MgSO4 ou le nicotinate, qui à concentrations suffisantes entraînent le passage de la bactérie en phase avirulente.Nous nous sommes intéressés aux domaines VFT de BvgS. Ces domaines, ubiquitaires, sont composés de 2 lobes reliés par une charnière délimitant une cavité qui permet la fixation d’un ligand spécifique stabilisant le VFT sous une forme fermée.Les domaines VFT de BvgS ont pu être cristallisés et s’organisent en un dimère entrelacé définissant de larges interfaces entre les 4 VFTs. Les VFT2 sont fermés sans ligand et les VFT1 ouverts, et la fermeture artificielle de ces domaines par des ponts disulfure a montré qu’il s’agit de la conformation active de BvgS. L’importance des interfaces entre les domaines VFT pour la fonction de BvgS a été démontrée par mutagenèse dirigée. Un signal positif proviendrait du périplasme pour être transmis à travers la membrane par les interfaces entre les VFT et intégré via un couplage fonctionnel en trans entre ces domaines et les hélices pré-membranaires, dites H19.Ces hélices se prolongeraient à travers la membrane et dans le cytoplasme jusqu’au domaine PAS. Les domaines PAS sont ubiquitaires, avec une structure fortement conservée en feuillet à 5 brins recouvert d’hélices délimitant une cavité. Ils sont impliqués dans diverses fonctions biologiques, selon leur capacité de liaison d’un ligand. Certains domaines PAS fonctionneraient sans ligand et pourraient servir d’adaptateurs ou d’amplificateurs de signal.Nous avons pu mettre en évidence la capacité de dimérisation de PASBvg, confirmant la nature dimérique du capteur BvgS. Des substitutions de résidus de la cavité de PASBvg indiqueraient que l’intégrité de la cavité de PASBvg est nécessaire au passage de signaux positifs et négatifs provenant du périplasme. La fixation de ligand dans la cavité n’a pu être démontrée mais n’est pas exclue. D’autre part, certains résidus sont nécessaires au couplage du domaine PAS avec ses hélices flanquantes pour la transmission de signal. La perte de ces interactions déstabilise significativement PASBvg et rend BvgS inactif.Un message positif proviendrait du périplasme et serait maintenu par le domaine PAS, dans une conformation rigide, permettant aussi la transmission des signaux modulateurs.Virulence of Bordetella pertussis, the whooping cough agent, is due to a plethora of virulence factors which expression is regulated by the two-component system BvgAS. BvgA is a classical response regulator and BvgS the sensor. BvgS contains 3 putative sensor domains, 2 periplasmic Venus FlyTrap (VFT), linked through a transmembrane segment to a cytoplasmic PAS domain preceding the histidine-kinase. Signals perceived by those sensor domains are still unknown, but a 37°C temperature is sufficient to maintain the system active under laboratory conditions. This activity can be down-modulated by chemical compounds, such as MgSO4 or nicotinate, which at sufficient concentration allows the bacteria to switch to avirulent phase.We investigated the role of BvgS VFT domains. VFTs are ubiquitous domains composed of 2 lobes linked by a hinge hence forming a cleft where a specific ligand can bind and stabilize the VFT in its closed conformation.BvgS VFT domains were crystalized and form an intricate dimer defining large interfaces between the 4 VFTs. VFT2s are closed without a ligand and VFT1s are opened, artificial closure of these domains via a disulfide bond indicates that this is the active conformation of BvgS. The role of the interfaces was probed by site-directed mutagenesis. A positive signal might originate from the periplasm to be transmitted through the membrane by the interfaces and integrated by a functional coupling between the VFT2s and the helices preceding the membrane, H19.These helices should be continued through the membrane and the cytoplasm to the PAS domain. Pas domains are ubiquitous with a highly conserved structure, a 5 stranded sheet surrounded by helices defining a cavity. Pas domains are involved in a wide variety of physiological processes, depending on their ability to bind a ligand. Some PAS might function without a ligand and could then be signal adaptors or amplifiers.We demonstrated PASBvg was dimeric, confirming the dimeric nature of BvgS. Cavity residues were substituted indicating that integrity of the cavity is necessary to maintain activity and modulation capacity coming from the periplasmic moiety. Ligand binding wasn’t demonstrated but couldn’t be excluded. Some residues are needed for the correct coupling of the PAS domain to its flanking helices and hence signal transmission. Loss of these connections generates a strong destabilization of PASBvg and turns BvgS inactive.A positive signal might come from the periplasmic moiety and shoul be maintaines by the PAS domain, which is in a rigid conformation also allowing the transmission of negative signals
Functional analyses of the structural motifs of FhaC from Bordetella pertussis, prototypic transporter of high molecular weight proteins in Gram negative bacteria
No full textLa coqueluche est une maladie respiratoire aiguë, causée par la bactérie à Gram négatif Bordetella pertussis. L’hémagglutinine filamenteuse (FHA) est une adhésine responsable de la colonisation du tractus respiratoire de l’hôte, ainsi qu’un antigène vaccinal important. La FHA est transportée à la surface de la bactérie par une protéine de membrane externe, FhaC, selon la voie de sécrétion à deux partenaires (voie TPS). Le couple FHA/FhaC sert de modèle aux systèmes TPS. FhaC fait également partie de la superfamille de transporteurs TpsB/Omp85 qui regroupe des protéines de la membrane externe des bactéries et de certains organites eucaryotes (dont les chloroplastes et mitochondries). La structure cristallographique de FhaC est la première à avoir été obtenue parmi les protéines de cette superfamille. Le tonneau β de FhaC est composé de 16 brins anti-parallèles, reliés par des boucles extracellulaires ou périplasmiques. Le canal formé par FhaC est obstrué par une hélice amino-terminale (H1) et une boucle de surface conservée dans la superfamille repliée à l’intérieur du tonneau (L6). Le domaine périplasmique de FhaC contient deux domaines « POTRA » (pour Polypeptide Transport Associated) en tandem. Ces domaines sont conservés dans la superfamille et seraient responsables d’interactions protéine-protéine. Mon travail de thèse a consisté à appréhender, à partir de la structure de FhaC, les mécanismes moléculaires de la sécrétion de la FHA. J’ai étudié le rôle d’une tétrade de résidus conservés dans la boucle L6, puis j’ai caractérisé les déterminants d’interaction présents dans les domaines POTRA de FhaC. Nos travaux ont montré que la tétrade conservée VRGY localisée à l’extrémité de L6 est impliquée dans la fonction de FhaC. Les substitutions de l’arginine et de la tyrosine en alanine (FhaC-R450A et FhaC-Y452A) ont montré que l’arginine était essentielle à la sécrétion de la FHA. De plus, la structure cristallographique de FhaC-R450A indique que la substitution ne perturbe pas la position de L6. L’analyse des propriétés du canal de ces deux variants reconstitués en bicouche lipidique montre en revanche une perturbation des canaux de FhaC-Y452A. Les substitutions n’altèrent pas l’étape de reconnaissance de FHA par FhaC. L’arginine serait donc impliquée dans une étape tardive de la sécrétion, alors que la tyrosine semble participer au positionnement de L6 ou à la régulation de sa mobilité au cours de la sécrétion et pourrait stabiliser FhaC « au repos ». J’ai également caractérisé les déterminants d’interaction des deux domaines POTRA de FhaC et montré que des résidus de l’extrémité de POTRA1 sont impliqués dans le recrutement de la FHA, probablement par interaction électrostatique. Deux sites majeurs d’interaction ont été identifiés dans des sillons hydrophobes des POTRA1 et 2, qui seraient compatibles avec l’hypothèse que les deux protéines interagissent par « beta augmentation ». L’étude du couple FHA/FhaC est un modèle pour la voie de sécrétion TPS. Nos résultats indiquent que les motifs structuraux conservés sont impliqués dans la fonction de la protéine et apportent des précisions sur les mécanismes moléculaires de la voie TPS et des transporteurs de la superfamille TpsB/Omp85.Whooping cough is an acute respiratory disease caused by the Gram-negative bacterium Bordetella pertussis. The filamentous hemagglutinin (FHA) is an adhesin involved in colonization of the host’s respiratory tract, and a major vaccine antigen. FHA is transported to the cell surface by an outer membrane protein, FhaC by the two-partner secretion (TPS) pathway. The FHA/FhaC pair is a model for TPS systems. FhaC belongs to the TpsB/Omp85 superfamily whose members are found in the outer membranes of bacteria and organelles such as chloroplasts and mitochondria. The crystal structure of FhaC has been the first in this superfamily. The β barrel of FhaC is composed of 16 anti-parallel strands, linked by extracellular loops and periplasmic turns. The FhaC channel is blocked by an amino-terminal helix (H1) and a conserved extracellular loop (L6). The periplasmic domain of FhaC has two POTRA domains (“Polypeptide Transport Associated”) that are conserved in the TpsB/Omp85 superfamily and involved in protein-protein interactions. My PhD work aimed at investigating the molecular mechanisms of FHA secretion based on the FhaC structure. I analyzed the role of a conserved tetrad in the L6 loop, and I also characterized the determinants of interaction with FHA in the POTRA domains of FhaC. Our work has shown that the conserved VRGY tetrad of L6 is involved in FhaC’s function. Substitution of arginine and tyrosine by alanine (FhaC-R450A et FhaC-Y452A) indicated that the arginine residue is essential for FHA secretion. Moreover, the crystal structure of FhaC-R450A showed that the positioning of L6 is similar to that in the wild type protein. Channel analyses of both variants reconstituted in lipid bilayers indicated that the FhaC-Y452A channels are affected. Both substitutions have no effect on the recognition step in the periplasm. The arginine residue is thus most likely involved in a late step of FHA secretion, while the tyrosine residue might participate in the positioning of L6 positioning or the regulation of its mobility in the course of secretion; it could stabilize FhaC in its “resting state”. I also characterized the determinants of interaction with FHA of the POTRA domains of FhaC and showed that residues at the extremity of POTRA1 might be involved in FHA recruitment, probably by electrostatic interactions. Two major sites of interactions were identified in hydrophobic grooves in both POTRA1 and 2, which are in agreement with a model of interaction between the 2 proteins by “beta augmentation”. The FHA/FhaC pair is a model for the TPS pathway. Our results indicate that conserved structural motifs of FhaC are involved in the function of the protein and give new insights into the molecular mechanisms of the TPS pathway and of transporters of the TpsB/Omp85 superfamily
Conformational dynamics of FhaC, the TpsB transporter of filamentous hemagglutinin of Bordetella pertussis
No full textLa voie de sécrétion bactérienne de type V permet l’exportation à la surface cellulaire de protéines dont certaines ont été identifiées comme d’importants facteurs de la pathogénicité bactérienne. Le type V regroupe la sécrétion des autotransporteurs et la sécrétion à deux partenaires (TPS). Les autotransporteurs sont constitués d’un domaine en tonneau β; et d’un domaine passager. L’interaction de l’autotransporteur avec le complexe protéique Bam, dont la pièce centrale est le transporteur BamA, permet l’insertion dans la membrane externe du tonneau β; et la sécrétion du passager. En revanche, la sécrétion à deux partenaires fait intervenir deux protéines, l’une appelée TpsA correspondant à la protéine exportée et l’autre, TpsB, formant un tonneau β qui contrôle le transport à travers la membrane externe. Les protéines TpsB sont spécifiques à leur(s) TpsA associée(s), et font partie de la superfamille des transporteurs Omp85 qui effectuent l’insertion de protéines dans la membrane externe bactérienne comme BamA, et dans celles des organites eucaryotes dont les chloroplastes et les mitochondries. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressé à la sécrétion de l’hémagglutinine filamenteuse (FHA), qui est l’adhésine majoritaire de Bordetella pertussis, l’agent étiologique de la coqueluche. Cette adhésine qui permet à la bactérie de coloniser le tractus respiratoire de l’hôte est une protéine TpsA de 220 kD. Elle est très efficacement sécrétée par la voie de sécrétion à deux partenaires grâce à son transporteur spécifique TpsB nommé FhaC. L’étude cristallographique de FhaC a révélé un tonneau β; à 16 brins qui forme un canal dans la membrane externe obstrué par l’hélice-α; amino-terminale, H1, partagée par la majorité des TpsB, et par une boucle de surface, L6, conservée dans la superfamille Omp85. Cette conformation suggère un état au repos dans lequel le canal bouché ne pourrait pas transporter son partenaire. Afin de comprendre comment la FHA transite à l’intérieur du pore, il est donc nécessaire de connaître les changements de conformations que subit FhaC. Durant mon travail de thèse, nous avons apporté une vision plus dynamique de la sécrétion à deux partenaires en utilisant le couple FHA/FhaC comme modèle d’étude. Pour cela nous avons utilisé principalement la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE). Cette technique de biophysique permet d’étudier FhaC en solution ou réincorporée dans une bicouche lipidique et de rendre compte de la mobilité à un site donné par l’utilisation de sondes paramagnétiques. Ainsi nous avons pu montrer que FhaC est en équilibre entre plusieurs conformations, avec H1 dans le pore ou du côté périplasmique de FhaC. La présence de la FHA déplace cet équilibre, favorisant ainsi la sortie de l’hélice hors du pore. Nous avons, par ailleurs, pu démontrer expérimentalement que la FHA transitait bien à l’intérieur du pore formé par FhaC et que l’hélice H1 se trouvait alors dans le périplasme. L’étude de la boucle L6 nous a permis de montrer que la mobilité de cette boucle était fortement contrainte à l’intérieur du pore même lors de la reconnaissance avec la FHA. Ce ralentissement de mobilité est lié, en autre, à une interaction avec un résidu d’un motif conservé présent sur le brin β13 qui influence la taille du pore. De manière plus générale, cette étude de la dynamique de FhaC contribue à la compréhension des mécanismes moléculaires de la voie TPS et des transporteurs de la superfamille Omp85.Type V secretion in bacteria mediates the export to the cell surface of proteins, some of which have been identified as important factors of pathogenicity. Type V includes the secretion of autotransporters and the ‘Two-partner Secretion’ (TPS) pathway. Autotransporters consist of a β barrel domain and a passenger domain. The interaction of autotransporters with the Bam complex, of which the BamA transporter is the central component, allows the insertion of the β; barrel in the outer membrane and the secretion of passenger domain. In contrast, the two-partner secretion involves two proteins, the exported ‘TpsA’ protein and its TpsB partner that controls its transport across the outer membrane. TpsB proteins are specific to their associated TpsA(s) and belong to the superfamily of the Omp85 transporters, which carry out the insertion of proteins into the bacterial outer membrane, like BamA, or in the outer membranes of eukaryotic organelles including chloroplasts and mitochondria. For my PhD work, I have been interested in the secretion of filamentous hemagglutinin (FHA), which is the major adhesin of Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough. This adhesin allows the colonization by this bacterium of its host’s respiratory tract. This protein corresponds to a 220kD TpsA protein efficiently secreted by its specific transporter TpsB named FhaC. Crystallographic studies have revealed that FhaC harbours a 16-stranded β;-barrel occluded by both the N-terminal α;-helix, H1, shared by the majority of TpsB proteins, and by a surface loop, L6, that carries a conserved, hallmark motif of the Omp85 superfamilly. This conformation suggests that FhaC is in a resting state in which the channel does not transport its partner. To understand how the FHA passes through the FhaC pore, it is necessary to address the conformational changes undergone by FhaC. During my thesis work, we provided a more dynamic view of the TPS pathway using the FHA/FhaC couple as study model. For this we used Electron Paramagnetic Resonance (EPR). This biophysical technique allows to study of FhaC in solution or reincorporated into a lipid bilayer and it reports the mobility at specific sites of the protein by using paramagnetic probes. Thus we have shown that FhaC is in equilibrium between multiple conformations, with H1 in the pore or at the periplasmic side of FhaC. The presence of FHA displaces the conformational equilibrium, promoting the exit of the helix going from the pore. We have also experimentally demonstrated that FHA does transit through the pore formed by FhaC while helix H1 is then in the periplasm. The study of the L6 loop enabled us to show that the mobility of this loop is highly constrained in the pore and remains so upon the recognition of FHA. Its slow mobility is linked to an interaction between an invariant L6 residue and a conserved motif present on the β; strand 13 of the barrel. This interaction affects the size of the FhaC pore.More generally, the study of the dynamics of FhaC contributes to the understanding the molecular mechanisms of the TPS pathway and of transporters of the Omp85 superfamily
Study of a copper acquisition system in Bordetella pertussis : novel mechanism for post-transcriptional regulation and preliminary functional characterization
No full textLes métaux de transition sont des micronutriments essentiels dans le cycle de vie de nombreux organismes vivants, y compris les bactéries. Ils jouent un rôle important à l'interface hôte-pathogène : l'hôte restreint l'accès au fer, au manganèse et au zinc pour les bactéries qui l'infectent, tout en les intoxiquant avec du cuivre ou du zinc pendant la phagocytose. Les bactéries ont donc acquis différents mécanismes d'homéostasie afin de s'adapter à ces conditions. Alors que des systèmes d'importation du fer, du manganèse ou du zinc ont été caractérisés, peu de choses sont connues pour le cuivre, pour lequel les études se sont concentrées sur les mécanismes de défense. Par ailleurs, alors que plusieurs mécanismes de régulation post-transcriptionnels sont connus pour d'autres métaux, seuls des régulateurs transcriptionnels ont été identifiés en réponse au cuivre.Des travaux antérieurs menés sur l'homéostasie du cuivre chez le pathogène humain Bordetella pertussis, responsable de la maladie de la coqueluche, ont montré que cette bactérie a perdu la plupart des mécanismes de défense connus contre l'excès de cuivre. En revanche, nous avons identifié un opéron de trois gènes appelés bp2923-bfrG-bp2921, dans lequel les deux derniers gènes sont régulés négativement par un excès de cuivre. bfrG est prédit pour coder un transporteur TonB-dépendant, une famille de protéines connue pour l'importation de métaux à travers la membrane externe des bactéries à Gram négatif, et bp2921 a un homologue prédit pour coder une sidérophore réductase. Ceci indique que ce système pourrait être impliqué dans l'acquisition du cuivre. Nous avons montré que la protéine codée par le premier gène, membre de la famille de protéines DUF2946, représente un nouveau type d'upstream Open Reading Frame (uORF) impliquée dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes en aval. En l'absence de cuivre, l'opéron entier est transcrit et traduit. La perception du cuivre par la protéine naissante codée par bp2923 via un motif conservé CXXC déclenche la terminaison de transcription Rho-dépendante entre le premier et le deuxième gène en libérant le ribosome arrêté sur un motif conservé C-terminal RAPP. Les homologues de bp2923 sont répandus dans les génomes bactériens, dans lesquels ils sont en tête d'opérons prédits pour coder des mécanismes d'importation ou d'utilisation du cuivre. Nous avons donc identifié un nouveau mode de régulation génétique par un métal de transition et identifié une fonction de régulation pour un membre d'une famille de protéines bactériennes non caractérisées que nous avons appelé CruR, pour Copper responsive upstream Regulator. Des travaux supplémentaires sur ce système ont mis en lumière la complexité de la régulation bactérienne, car notre opéron est régulé non seulement par le cuivre, mais est aussi surexprimé par la modulation de la virulence et en phase stationnaire de croissance.Par ailleurs, nous avons commencé à caractériser la fonction de cet opéron. Nous avons montré que BfrG lie du cuivre in vitro, et des analyses phénotypiques ont montré le rôle de l'opéron pour la croissance bactérienne lorsque B. pertussis rencontre des conditions de faible oxygénation. Parmi les protéines à cuivre produites par B. pertussis, on trouve plusieurs cytochrome-oxydases de la chaîne respiratoire, ce qui suggère que BfrG et Bp2921 joueraient un rôle dans l'acquisition du cuivre pour leur assemblage. Combinées aux résultats de régulation, ces données suggère que notre opéron pourrait contribuer à dans la persistance bactérienne dans le tractus respiratoire lors de l'infection. Beaucoup d'aspects de ce système restent méconnus et nécessiteront d'être étudiés.Several transition metals are essential micronutrients for most living beings, including bacteria. In addition, they play important roles at the host-pathogen interface: the host tends to restrict bacterial access to iron, manganese and zinc, while intoxicating invading microorganisms with copper or zinc during phagocytosis. Bacteria have therefore acquired various homeostasis mechanisms in order to adapt to those conditions. Whereas iron, zinc or manganese import systems have been extensively characterized, very little is known for copper, for which studies have mostly focused on defense mechanisms. Besides, while several post-transcriptional regulation mechanisms are known for other metals, only transcriptional regulators have been identified in response to copper.Previous work performed in the laboratory on copper homeostasis in the human-restricted pathogen Bordetella pertussis, responsible for the whooping cough disease, has shown that this bacterium has shed most of its defense mechanisms against excess copper. On the other hand, we have identified a three-gene operon called bp2923-bfrG-bp2921, in which the last two genes are down-regulated by copper excess. bfrG is notably predicted to encode a TonB-dependent transporter, a protein family well-known for metal import across the outer membrane in Gram-negative bacteria, and bp2921 has a characterized homolog encoding a siderophore reductase, which hints at a system involved in copper acquisition. We have shown that the protein encoded by the first gene, a member of the DUF2946 protein family, represents a new type of upstream Open Reading Frame (uORF) involved in post-transcriptional regulation of the downstream genes. In the absence of copper, the entire operon is transcribed and translated. Perception of copper by the nascent bp2923-coded protein via its conserved CXXC motif triggers Rho-dependent transcription termination between the first and second genes by relieving translation arrest on a conserved C-terminal RAPP motif. Homologs of bp2923 are widespread in bacterial genomes, where they head operons predicted to participate in copper importation or utilization. We have thus identified a new mode of genetic regulation by a transition metal and identified a regulatory function for a member of an uncharacterized family of bacterial proteins that we have named CruR, for Copper responsive upstream Regulator. Additional work on this system has shed a light on the complexity of bacterial regulation, as our operon is regulated not only by copper, but is also overexpressed upon virulence modulation or in stationary growth phase.We have also initiated the characterization of the function of this operon. BfrG has been shown to specifically bind copper in vitro, and phenotypic analyses have shown a crucial role for the operon when B. pertussis is placed in low-oxygen conditions. Among the cuproproteins produced by B. pertussis are several cytochrome oxidases in the respiratory chain, which suggests that BfrG and Bp2921 could play a role in delivering copper for their assembly. Combined with results on the regulation, this suggests a possible role for copper and our operon in bacterial persistence in the respiratory tract during infection. Many aspects of this system remain to be further investigated
Characterization of a new family of ribosomally synthesized and post-translationally modified bacterial peptides involved in copper homeostasis
No full textPlus de 40 familles de RiPPs, des produits naturels peptidiques synthétisés par voie ribosomale et modifiés post-traductionnellement, ont été identifiées à ce jour. En particulier, les RiPPs bactériens impliquant des enzymes MNIO (multinuclear non-heme iron-dependent oxidative enzymes) constituent un groupe en pleine expansion. Les enzymes MNIO sont impliquées dans la biosynthèse de divers types de RiPPs où ils catalysent des modifications chimiques très inhabituelles et diverses, fréquemment sur des résidus cystéine. Une nouvelle classe de RiPPs impliquant une sous-famille d’enzymes MNIO, que nous avons appelée « bufferines », a fait l’objet de ces travaux de thèse. Les bufferines possèdent des cystéines conservées. Elles présentent aussi des propriétés originales, notamment la grande taille de leurs précurseurs et la présence de peptides signaux N-terminaux Sec-dépendants, qui sont inhabituelles parmi les RiPPs bactériens.Nous avons caractérisé deux bufferines modèles chez la bactérie environnementale Caulobacter vibrioides. Nous avons découvert que ces bufferines font partie des deux plus grandes familles de RiPPs modifiées par des enzymes MNIO, largement répandues dans différents phyla bactériens. Des travaux antérieurs rapportés dans la littérature avaient montré une régulation par le cuivre des opérons de biosynthèse des bufferines chez C. vibrioides. Le cuivre est un métal essentiel utilisé pour ses propriétés d’oxydo-réduction dans divers processus biologiques dont la respiration. Il est également toxique en excès car il cause indirectement du stress oxydant, inactive certaines protéines et joue ainsi un rôle dans les interactions hôte-pathogène. Les bactéries ont donc développé des mécanismes très bien régulés d’homéostasie du cuivre. Nos travaux ont permis d’identifier le rôle des deux bufferines produites par C. vibrioides pour la protection contre un excès de cuivre, ce qui représente une stratégie d’homéostasie originale. Nous avons montré que les bufferines chélatent le cuivre dans ses deux états d’oxydation. Nos travaux ont aussi permis de mettre en évidence une nouvelle modification catalysée par les enzymes MNIO. Les cystéines conservées des bufferines sont modifiées en hétérocycles thiooxazole, une modification rare dans les produits naturels et essentielle pour la fonction des membres de cette nouvelle famille de RiPPs. Enfin, nous avons commencé à caractériser la biogenèse des deux bufferines de C. vibrioides. La présence de peptides-signaux N-terminaux conditionne nécessairement la biogenèse des bufferines, qui sont modifiées dans le cytoplasme avant leur export. Nos premiers résultats indiquent que la reconnaissance du précurseur de bufferine par l’enzyme MNIO et son partenaire implique plusieurs régions du précurseur, dont le peptide signal, ce qui pourrait retarder l’export pour permettre la mise en place des modifications post-traductionnelles.De façon intrigante, nous n’avons pas pu mettre en évidence un rôle de la bufferine produite par Bordetella pertussis, un pathogène respiratoire humain, dans la protection contre le cuivre. Ceci suggère que les bufferines pourraient exercer différentes fonctions selon le style de vie des bactéries productrices. Son rôle chez B. pertussis reste à élucider.More than 40 families of RiPPs, ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides, have been identified. In particular, bacterial RiPPs involving MNIO enzymes (multinuclear non-heme iron-dependent oxidative enzymes) constitute a fast-expanding group. MNIO enzymes are involved in the biosynthesis of various types of RiPPs, where they catalyze unusual and chemically diverse modifications, generally on cysteine residues. A new class of RiPPs involving a subfamily of MNIO enzymes, which we have called «bufferins», has been the subject of this thesis. Bufferins harbour conserved Cys residues. In addition, they have original features, notably the large size of their precursors and the presence of Sec-dependent N-terminal signal peptides, which are unusual among bacterial RiPPs.We have characterized two model bufferins in the environmental bacterium Caulobacter vibrioides. We discovered that these bufferins belong to the largest two families of RiPPs modified by MNIO enzymes, and that they are prevalent in several bacterial phyla. It has been reported in the literature that the C. vibrioides bufferin operons are regulated by copper. Copper is an essential metal used for its redox properties in various biological processes including respiration. It is also toxic in excess because it causes oxidative stress, inactivates some proteins, and thus it plays a role in host-pathogen interactions. Bacteria have therefore developed finely regulated mechanisms of copper homeostasis. Our work allowed to identify a role in the protection against copper for the bufferins of C. vibrioides, which represents an original strategy of adaptation to excess copper. We showed that the bufferins chelate copper in both oxidation states. This work has also revealed a new modification catalyzed by MNIO enzymes. The conserved cysteines of bufferins are modified into thiooxazole heterocycles, a rare modification in natural products and essential for the function of the members of this new family of RiPPs. Finally, we have initiated the characterization of the biogenesis of the bufferins in C. vibrioides. The presence of a signal-peptide necessarily impacts their biogenesis, as bufferins are modified in the cytoplasm before their export. Our preliminary results indicate that recognition of the bufferin precursor by the MNIO enzyme and its partner involves several regions of the precursor including the signal peptide, which may delay export to allow installation of the post-translational modifications.Intriguingly, we could not establish that the bufferin produced by Bordetella pertussis, a human respiratory pathogen, is involved in protection against copper. This suggests that the functions of bufferins might depend on the lifestyles of the producing bacteria. Its role in B. pertussis remains to be elucidated
Mechanisms of copper homeostasis in a strict human pathogen, Bordetella pertussis
No full textLe cuivre est devenu un élément essentiel à la plupart des organismes vivants depuis l’apparition de l’oxygène dans l’atmosphère terrestre il y a 2,7 milliards d’années. Ce métal est utilisé dans de nombreux processus biologiques, mais les propriétés chimiques qui le rendent indispensable sont également à l’origine de sa toxicité. Cette ambivalence du cuivre a fait que tous les organismes ont développé divers systèmes permettant un maintien extrêmement strict de l’homéostasie de ce métal. Certains organismes comme les amibes ont également mis à profit ses propriétés toxiques pour la prédation d’autres organismes unicellulaires par la phagocytose. Un des mécanismes qui leur permet ensuite de tuer leurs proies est l’empoisonnement par les métaux, et en particulier par le cuivre. La phagocytose a perduré au cours de l’évolution jusqu’à constituer un acteur essentiel de l’immunité des métazoaires, dont l’humain fait partie. Les systèmes de détoxification du cuivre mis en place par les organismes procaryotes ont donc été sélectionnés par la pression exercée lors de la phagocytose. C’est ainsi que les bactéries pathogènes ont acquis des systèmes de survie à la phagocytose, dont des mécanismes de l’homéostasie du cuivre. Ces mécanismes sont variés et dépendent de la niche écologique de chaque bactérie. Les connaissances sur ce sujet se concentrent essentiellement sur les bactéries environnementales ainsi que sur quelques bactéries pathogènes, principalement intracellulaires. Ici, c’est l’homéostasie du cuivre chez Bordetella pertussis qui a été au centre de ces travaux de thèse. Cette bactérie est l’agent étiologique de la coqueluche et présente la particularité d’être un pathogène totalement dépendant de son hôte. De plus, sa niche écologique est extrêmement restreinte, se limitant à l’épithélium de l’arbre respiratoire supérieur de l’humain. Cette bactérie constitue donc un modèle nouveau pour l'étude du rôle du cuivre dans la relation hôte-pathogène. Ces travaux ont mis en évidence la perte de la plupart des systèmes de l’homéostasie du cuivre chez B. pertussis. Néanmoins, un système de détoxification original avec une régulation double a été découvert, composé de la métallochaperonne cytoplasmique CopZ et de deux enzymes impliquées dans la détoxification du stress oxydant. Les travaux de cette thèse ont permis d’émettre l’hypothèse que ce système propre aux Bordetella est impliqué dans la survie à la phagocytose par les cellules immunitaires, seule source d’excès de cuivre dans la niche écologique de B. pertussis. La métallochaperonne CopZ détoxifie le cuivre libre par complexation et les deux enzymes permettent de réduire la concentration de peroxyde d’hydrogène à l’origine du stress oxydant causé par les réactions de Fenton et d’Haber-Weiss. La co-régulation de ce système par le cuivre et le peroxyde d’hydrogène permet son activation sélective et très dynamique en réponse aux mécanismes liés à la phagocytose. Le rapport entre coût énergétique de ce système pour la bactérie et la protection qu’il lui assure doit être suffisamment favorable pour qu’il ait été spécifiquement sélectionné dans l’évolution de ce pathogène très spécialisé.Ces travaux ont permis de déterminer les mécanismes de tolérance au cuivre présents chez B. pertussis, ainsi que la sélection évolutive que ces systèmes ont subie chez Bordetella.Copper has become an essential element for most living organisms since the adventof oxygen in the Earth’s atmosphere, 2.7 billion years ago. This metal is used in manybiological processes. However, the electronic properties that make it crucial for life are alsowhat makes it poisonous. This ambivalent biological impact has forced organisms to acquirean increasing number of mechanisms dedicated to maintaining a strict control over copperhomeostasis. In addition, a few organisms such as amoebae have taken advantage of its toxicproperties. Those lower eukaryotes have developed a complex predation mechanism to feedon other unicellular organisms, phagocytosis, and make use of metal poisoning, in particularcopper, to kill their preys. Phagocytosis has persisted over the course of evolution to becomea key actor of innate immunity in metazoans, including humans. Copper detoxificationmechanisms developed by prokaryotic organisms have likely been selected through thepressure exerted by phagocytosis. In particular, copper homeostasis regulation mechanismsare part of the strategies adopted by pathogenic bacteria to survive phagocytosis. Thesemechanisms vary depending on the ecological niche of each species. Studies on this topichave mainly focused on environmental bacteria and on pathogenic bacteria, especially thosewith an intracellular lifestyle. Copper homeostasis in Bordetella pertussis is at the centre ofthis thesis. This bacterium is the etiologic agent of whooping cough whose peculiarity is to bestrictly dependent on its host. Furthermore, its ecological niche is very limited, as it onlyinfects the human upper respiratory epithelium. This bacterium represents a new model tostudy the role of copper in host-pathogen relationships. This work has revealed the loss ofmost copper homeostasis systems in B. pertussis. An original detoxification mechanism witha composite regulation has been identified that includes the cytoplasmic metallochaperoneCopZ and two enzymes catalyzing detoxification of peroxides. This thesis work has led to thefollowing hypothesis: this system, which is a distinctive feature of the Bordetella genus, isinvolved in survival to phagocytosis, the only situation where the bacterium experiencescopper excess in its ecological niche. The metallo-chaperone CopZ mediates thedetoxification of free copper by complexation, and together the two enzymes decrease theconcentration of hydrogen peroxide, which causes oxidative stress through the Fenton andHaber-Weiss reactions. The co-regulation of this system by copper and hydrogen peroxideresults in a very dynamic and selective activation, specific to phagocytosis-relatedmechanisms. This system offers a sufficiently favorable cost-benefit balance to have beenselected over the course of the evolution of this host-restricted pathogen.This work has led to the identification of copper tolerance mechanisms in B. pertussisand to the description of their evolutionary selection among Bordetellae
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
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