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New Innovative Diagnostic Approaches and New Challenges in Clinical Microbiology.
No full textInitial optimism about conquering infectious diseases in the mid-20th century was disrupted by new or re-emerging infections. The evolution of clinical microbiology, including automation, point-of-care testing (POCT), and advanced technologies like mass spectrometry and genomics, has significantly optimized diagnostic workflows and pathogen identification.
This thesis explores the transformative advancements in clinical microbiology over the past years and their critical role in infectious diseases management and pandemic response. More specifically, we investigate the implementation and impact of total laboratory automation (TLA) in a clinical microbiology laboratory, evaluating improvements in accuracy, efficiency, and reproducibility. This study also examines advanced antimicrobial susceptibility testing (AST) methods, highlighting innovative technologies such as nanomotion-based diagnostics.
Furthermore, the application of metagenomics in clinical studies is assessed for its effectiveness in predicting clinical outcome of patients with ventilator associated pneumonia (VAP). The rapid deployment of COVID-19 diagnostics faced significant challenges, and this thesis evaluates integrated diagnostic tools for their role in managing the pandemic.
The aims of this thesis include optimizing laboratory workflows through automation, enhancing AST methods, applying metagenomics in critical care settings, and evaluating diagnostic tools for COVID-19. By addressing these areas, this research contributes to advancing clinical microbiology practices and improving patient care and public health responses.
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L'optimisme initial concernant la conquête des maladies infectieuses au milieu du XXe siècle a été perturbé par l'apparition de nouvelles infections ou la réémergence de certaines maladies infectieuses. L'évolution de la microbiologie clinique, incluant l'automatisation, les point-of-care tests (POCT), ainsi que d’autres technologies avancées comme la spectrométrie de masse et la génomique, a optimisé le flux de travail et l'identification des pathogènes.
Cette thèse explore les avancées transformatrices en microbiologie clinique au cours des dernières années et leur rôle crucial dans la gestion des maladies infectieuses et la réponse aux pandémies. Plus spécifiquement, nous examinons la mise en œuvre et l'impact de l'automatisation totale dans un laboratoire de microbiologie clinique, en évaluant les améliorations en termes de précision, d'efficacité et de reproductibilité. Cette étude examine également des méthodes novatrices de tests de sensibilité aux antimicrobiens, en mettant en lumière des technologies innovantes telles que la nanomotion.
De plus, l'application de la métagénomique dans la prédiction de l’outcome clinique des patients atteints de pneumonie associée à la ventilation (VAP) est évaluée. Le déploiement rapide des diagnostics pour COVID-19 a rencontré des défis significatifs, et cette thèse évalue les outils diagnostiques et leur rôle dans la gestion de la pandémie.
Les objectifs de cette thèse incluent l'optimisation du flux de travail du laboratoire grâce à l'automatisation, l'amélioration de l’AST, l'application de la métagénomique en clinique et l'évaluation des outils diagnostiques pour le COVID-19. En abordant ces domaines, cette recherche contribue à l'avancement des pratiques de microbiologie clinique et à l'amélioration des soins prodigués aux patients
Tick-borne pathogen detection: what’s new?
No full textTicks and the pathogens they transmit constitute a growing burden for human and animal health worldwide. Traditionally, tick-borne pathogen detection has been carried out using PCR-based methods that rely in known sequences for specific primers design. This approach matches with the view of a ‘single-pathogen’ epidemiology. Recent results, however, have stressed the importance of coinfections in pathogen ecology and evolution with impact in pathogen transmission and disease severity. New approaches, including high-throughput technologies, were then used to detect multiple pathogens, but they all need a priori information on the pathogens to search. Thus, those approaches are biased, limited and conceal the complexity of pathogen ecology. Currently, next generation sequencing (NGS) is applied to tick-borne pathogen detection as well as to study the interactions between pathogenic and non-pathogenic microorganisms associated to ticks, the pathobiome. The use of NGS technologies have surfaced two major points: (i) ticks are associated to complex microbial communities and (ii) the relation between pathogens and microbiota is bidirectional. Notably, a new challenge emerges from NGS experiments, data analysis. Discovering associations among a high number of microorganisms is not trivial and therefore most current NGS studies report lists of microorganisms without further insights. An alternative to this is the combination of NGS with analytical tools such as network analysis to unravel the structure of microbial communities associated to ticks in different ecosystems
Application of nanomotion to investigate antibiotics tolerance in Escherichia coli and viability of Chlamydiales bacteria
No full textAntibiotic treatment failure is a global health issue, leading to more than one million deaths each year and having an effect on close to five million others1. lt is often caused by resistant bacteria, which have inherited the ability to grow at high antibiotic concentrations, independently of the duration of treatment. lt has been projected that by the year 2050, approximately ten million deaths each year will be attributed to microbial resistance2• Furthermore, certain bacterial strains have developed a degree of tolerance towards antibiotics, enabling them to subsist through episodic contact with concentrations of these drugs that otherwise would prove lethal for cells that are vulnerable.
To fight multidrug-resistant bacteria, a rapid antibiotic susceptibility testing (AST) has been developed and is currently tested in clinical trials. This test, called "nanomotion", is growth independent and measure vibrations of bacteria, which correlate with viability. Changes in nanomotion can be followed in real-time, and the impact of an antibiotic is assessed within minutes to hours, a significant saving intime compared to other ASTs.
Nanomotion has convincingly proved its efficacy in analyzing antibiotic susceptibility profiles of multiple bacteria. Nonetheless, it has never been used to measure either antibiotic tolerance of bacteria or the oscillations of fastidious and obligatory intracellular species such as the Chlamydia/es bacteria. ln the first part of this thesis, we measured the nanomotion signal of slow-growing Escherichia coli that are tolerant to 13-lactams and we noted that it furnishes insights into the bacteria phenotype and tolerance. Secondly, we developed a simple protocol to record specific nanomotion of elementary bodies, the extracellular infectious but non-dividing form of Chlamydia trachomatis and Waddlia chondrophi/a, two bacteria from the Chlamydia/es order. This is the first demonstration of elementary bodies nanomotion.
As a side project, we evaluated the efficacy of three distinct techniques (inclusion forming units counting, genome quantification and flow cytometry) for quantifying Chlamydia/es bacteria in a sample in order to emphasize their advantages and disadvantages. lndeed, depending on the different stages of their bacterial life cycle, bacteria are more accurately assessed through one procedure rather than another
Rhabdochlamydia: a new tick-borne pathogen?
No full textThe Chlamydialesis an order of obligate intracellular bacteria that share the same biphasic development cycle. It includes well-known human pathogens, like Chlamydia trachomatis, but also species causing diseases in other animals. This order has been continuously expanded in the past decades and it now appears that chlamydiae can infect a wide variety of hosts and can be found in diverse environments. The Rhabdochlamydiaceae is a recent addition to the order. It was initially discovered in cockroaches and woodlouse and could eventually be isolated in a culture system from the latter. After its initial discovery, two additional species were described, in ticks and spiders, respectively. Rhabdochlamydiaceae were also detected in respiratory samples of hospitalized patients, raising the question of its pathogenic role in lung infections. In this work, we tested the permissivity of various cell lines and determined that the host range ofR. Porcellionis is limited by its thermal sensitivity. In particular, this bacterium cannot grow at 33°C or 37°C and cannot withstand exposures as short as 6 h to 37°C. Mammalian cells were permissive to R. porcellionis only when their incubation temperature was lowered to 28°C, excluding a role of this bacterium in human infectious diseases. In a separate project, we confirmed the presence of Rhabdochlamydiaceae in questing ticks at a prevalence of 1.1%. The low copy numbers observed in this study contrasts with previous reports and suggest that ticks heavily infected with Rhabdochlamydiaceae may be less fit and less likely to be feeding on a human host. Finally, we sequenced the genome of 5 new rhabdochlamydiae species from different arthropods orders. Interestingly, the analysis of those genomes revealed that rhabdochlamydiae species likely have wide, overlapping host ranges. Ticks and woodlouse having similar thermal preferences and the genomes of arthropod-borne rhabdochlamydiae being closely related, it is likely that the evolutionary pressure that drove the adaptation of R. porcellionis towards lower temperatures was also at play for tick-borne species. Tick-borne Rhabdochlamydiaceae are thus unlikely to cause infections in humans.
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L’ordre des Chlamydiales est constitué de bactéries intracellulaires obligatoires et inclut des pathogènes d’importance médicale, tels queChlamydia trachomatis, mais aussi d’autres espèces importantes en médecine vétérinaire. Les dernières décennies ont été témoins d’une importante expansion desChlamydialeset il est aujourd’hui évident que ces bactéries se trouvent dans de nombreux hôtes. La famille des Rhabdochlamydiaceae est une addition récente à cet ordre initialement découverte chez les cafards et les cloportes, et dont seulement une espèce, R. porcellionis, a pu être cultivée. Deux nouvelles espèces, détectées chez les tiques et les araignées, sont venues agrandir cette famille, alors que sa présence dans des échantillons respiratoires de patients hospitalisés a soulevé la question de sa pathogénicité. Dans ce travail, nous avons étudié la permissivité de plusieurs lignées cellulaires à R. porcellionis et avons notamment démontré que cette bactérie ne peut pas se répliquer à 37°C ou à 33°C. Elle est de plus incapable de supporter des expositions de plus de 6 h à 37°C. Les cellules de mammifères sont permissives à R. porcellionis seulement si elles sont incubées à 28°C, excluant un rôle pathogène de cette bactérie. Nous avons également confirmé la présence de Rhabdochlamydiaceae dans des tiques prélevées sur des humains, à une prévalence de 1.1%. Toutefois, la charge bactérienne des tiques était moins élevée que dans de précédentes études, suggérant que les tiques très infectées sont moins susceptibles d’être trouvées sur des humains. Nous avonsfinalement séquencé le génome de cinq nouvelles espèces de Rhabdochlamydiaceae présentes dans différents ordres d’arthropodes. L’analyse de ces génomes suggère que ces espèces ont des hôtes communs et une capacité à infecter une large variété d’arthropodes. Les Ixodida partageant les mêmes préférences thermiques que le cloporte et les génomes des Rhabdochlamydiaceae étant très similaires, il est probable que la pression evolutive ayant mené à une adaptation de R. porcellionis à la température de ses hôtes ait aussi agi sur les autres espèces. Il est donc peu vraisemblable que les Rhabdochlamydiaceae de tique aient un rôle pathogène.
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Les chlamydiae forment un groupe hétérogène de bactéries dont la plus connue est certainementChlamydia trachomatis, une bactérie causant des infections sexuellement transmissibles et des infections oculaires pouvant mener à la cécité. Ce groupe inclut de nombreuses autres espèces ayant plusieurs points communs, notamment la nécessité d’envahir une cellule hôte pour pouvoir se répliquer, à la manière d’un virus. Ces bactéries ont souvent des préférences marquées pour les cellules d’un hôte précis. Telle bactérie préfèrera infecter des mammifères, alors que telle autre préfèrera les amibes. Les rhabdochlamydiae font partie du phylum des Chlamydiae et ont été découvertes dans les arthropodes, notamment dans les cloportes et les cafards, mais également dans les tiques. La détection de ces bactéries chez des patients souffrant d’infection respiratoire, ainsi que leur présence dans des tiques ont naturellement amené à la question de leur rôle dans les maladies humaines et du risque de transmission par piquˆres de tiques. Pour répondre à cette question, nous avons essayé d’infecter différents types de cellules avec la seule rhabdochlamydia isolée en laboratoire pour déterminer si les humains peuvent lui servir d’hôte. Il est apparu que cette bactérie s’est adaptée à la température corporelle plus froide des arthropodes et a perdu ou n’a jamais acquis la capacité de supporter les températures rencontrées dans le corps humain. Cette bactérie ne risque donc pas d’infecter des mammifères. Une autre partie du projet s’intéressait à la diversité des rhabdochlamydiae. Nous avons notamment découvert plusieurs nouvelles espèces infectant divers arthropodes comme les papillons et les coléoptères. Bien qu’il ne soit pas clair si ces nouvelles espèces sont elles aussi sensibles à la chaleur, leur ressemblance génétique à celle testée en laboratoire et les températures similaires de leur hôte favorisent cette hypothèse. Les rhabdochlamydiae ne seraient donc pas pathogènes pour les humains.
Etant donnée leur grande diversité, il est toutefois possible que des rhabdochlamydiae infectant d’autres organismes que les arthropodes puissent poser des risques pour la santé humaine
Chlamydiota phylum: molecular mechanisms of stress, gene regulation, and symbiosis
No full textThe Chlamydiota phylum is a group of obligate intracellular bacteria which includes both well known pathogens like Chlamydia trachomatis and lesser-studied species such as Waddlia
chondrophila and Simkania negevensis. These bacteria replicate through a unique biphasic
lifecycle, alternating between infectious elementary bodies (EBs) and replicative reticulate bodies
(RBs). This thesis explores Chlamydiota biology, revealing how these bacteria handle stress, adapt
across their lifecycle, and even form unexpected ecological partnerships.
In Waddlia chondrophila, I uncovered how a conserved effector, tied to the Type III Secretion
System, plays a critical role in surviving tough conditions like iron starvation and heat shock. During
aberrant body inducing stress, expression of the effector spikes, enhancing survival. This secreted
effector was found to be preserved in all members of the phylum, suggesting a highly conserved
and crucial role in stress response.
For Simkania negevensis, another member of the Chlamydiota phylum, RNA sequencing
uncovered dynamic shifts in gene expression. Thus, early after host cell infection, RBs boost
expression of genes necessary for nutrient uptake and biosynthesis to drive bacterial division.
Later, EBs switch on stress-response genes for extracellular survival, though some replication genes
continue to be expressed, suggesting a flexible lifecycle shaped by its environment.
Finally, I explored a novel Chlamydiota member, Candidatus Fritschea bemisiae, an endosymbiont
of the whitefly Bemisia tabaci living in communities with other intracellular bacteria, within
bacteriocytes. Its newly discovered genome encodes pathways for nutrients, which the host
cannot produced. When the bacterial metabolic pathways were examined further, a mutualistic
cooperation was documented, suggesting that some members of this phylum are non-pathogenic
endosymbionts.
Together, these findings illuminate the remarkable diversity of survival strategies within the
Chlamydiota phylum, showcasing their adaptation to stress responses, flexible lifecycles, and even
symbiotic relationships with other endosymbionts and their eukaryotic hosts. This not only
broadens our understanding of these enigmatic bacteria but also ignites a wave of intriguing
questions about their broader significance. For instance, could these newly revealed stress response mechanisms become targets for novel treatments to combat persistent chlamydial
infections? How common is lifecycle adaptability across different species in this group? Can
Chlamydiota members cooperate with their host or other bacteria
LAUSANNEVIRUS AND OTHER GIANT VIRUSES: CLINICAL AND BIOLOGICAL INSIGHTS
No full textLausannevirus is a member of the Marseilleviridae family, which belongs to the group of nucleocytoplasmic large DNA viruses (NCLDVs), also known as Megavirales. Lausannevirus was isolated in Lausanne, using Acanthamoeba castellanii amoeba as cell in a co-culture assay. Until now, no pathogenic rôle has been described in humans. Nevertheless, clinical investigations performed during this thesis revealed the presence of anti- Lausannevirus antibodies in the blood of Swiss asymptomatic men, suggesting that humans are exposed to this giant virus. The 346 kb Lausannevirus genome, harbors 450 genes. However, many open reading frames (ORFs) encoded by this giant virus are only present in the related Marseillevirus, and most of these ORFs are of unknown function. Functional genomics projects are thus warranted. From the genome in silico analysis emerged that Lausannevirus bears a dihydrofolate reductase-thymidilate synthase (DHFR-TS]. Thus, we investigated and demonstrated that the DHFR domain of this enzyme is functional and may represent a drug target, as it is susceptible to proguanil. This discovery opens perspectives for future treatment development. In parallel, experimental genomic évolution of Lausannevirus and Estrella lausannensis, another amoeba-resisting microorganism, were analyzed. Stable genomes and positive évolution characterized these two amoeba-resisting microorganisms. Surprisingly, fluctuation in viral population sizes were observed, which were not correlated with the detected viral mutations. This might suggest that bistable genetic switches may regulate Lausannevirus replication.
Finally, the amphora-shaped Doliivirus lausannensis, another amoeba-resisting virus, was discovered and characterized. This new giant virus is part of the Pithoviridae family and was isolated by amoebal co-culture. Beyond enlarging the NCLDVs group, the D. lausannensis discovery emphasizes the worldwide distribution of Pithoviruses.
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Lausannevirus est un membre de la famille des Marseilleviridae qui appartient au groupe des grands virus nucléocytoplamisques, aussi connu comme Megavirales. Lausannevirus a été isolé à Lausanne grâce à une technique de co-culture avec l'amibe Acanthamoeba castellanii. Jusqu'à présent, aucun rôle pathogénique n'a été décrit chez les humains. Cependant, les investigations cliniques menées durant cette thèse, ont révélé la présence d'anticorps anti-Lausannevirus dans le sang d'hommes suisses asymptomatiques, suggérant ainsi une exposition humaine à ce virus géant. A partir d'analyses in silico du génome, il a été démontré que Lausannevirus code pour une dihydrofolate réductase- thymidylate synthase (DHFR-TS). Dans ce contexte, nous avons investigué et démontré que le domaine DHFR de cette enzyme était fonctionnelle et pouvait représenter une cible thérapeutique, au vu de sa susceptibilité au proguanil, un antiparasitaire, fréquemment utilisé. Cette découverte ouvre des perspectives pour le développement de traitements futurs. Parallèlement, l'évolution expérimentale des génomes de Lausannevirus et d'Estrella lausannensis, un autre microorganisme résistant aux amibes, a été analysée. Ces deux microorganismes résistants aux amibes se caractérisent par la stabilité de leur génome ainsi qu'une évolution positive. Etonnamment, des fluctuations dans la taille des différentes sous-populations virales ont été observées ; celles-ci ne corrélaient pas avec les mutations virales détectées. Ces résultats suggèrent que des changements génétiques bistables peuvent réguler la réplication de Lausannevirus.
Finalement, utilisant la même technique de co-culture d'amibe, le Doliivirus lausannensis en forme d'amphore, un autre virus résistant aux amibes, a été isolé puis caractérisé. Ce nouveau virus géant est phylogénétiquement proche de Pithovirus sibericum. En plus de l'élargissement du groupe des grands virus nucléocytoplamisques, la découverte de D. lausannensis souligne la distribution mondiale des Pithoviridae
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR STUDIES OF CHLAMYDIAL DEVELOPMENTAL FORMS
No full textThe Chlamydia/es order is composed of obligate intracellular bacteria such as the well known human pathogen, Chlamydia trachomatis, responsible for genital infections or trachoma. All chlamydiae share a biphasic developmental cycle involving adhesion and internalization of infectious elementary bodies, which differentiate into proliferative reticulate bodies. ln presence of stress stimuli, such as -lactam antibiotics or iron starvation, reticulate bodies proliferation is inhibited, inducing the formation of enlarged and persistent aberrant bodies (ABs). The removal of stress stimuli allows these bacteria to re-enter the normal life cycle suggesting that ABs might play an important role in the onset of chronic infections by Chlamydia/es bacteria. While the stress stimuli inducing ABs are well described, no comprehensive morphological characterization of this persistent stage has been performed until now and the mechanisms leading toits formation remain unclear.
ln many prokaryotes, the protein ParB is part of the partitioning system ParAB-par5 implicated in chromosome and plasmid segregation. While ParB function has been investigated in different bacteria, its raie remains poorly understood in the Chlamydia/es bacteria.
To clarify these issues, the Chlamydia-related bacterium Waddlia chondrophila, a potential agent of human miscarriages and cattle abortion, was used as a model organism. ln this thesis, we aimed to characterize the ABs induced by different stress stimuli and monitor the transcriptional landscape of persistent W. chondrophila induced by iron deprivation. ln addition, we assessed the role of ParB in chromosome segregation and in transcriptional regulation.
According to their morphology and number, two distinct patterns of ABs couId be defined:
(i) small and multiple versus (ii) large and rare. These distinct subtypes probably reflect the presence of different mechanisms of AB formation. Using comparative transcriptome analysis, we showed that nearly 35% of the genome was differentially expressed in persistent W. chondrophila induced by iron starvation. Finally, our results suggest that ParB might act as a partitioning protein and as a transcriptional regulator in W. chondrophila.
This thesis work provides navel insights into the morphology of the ABs and their expression patterns. ln addition, these results give a first overview of the potential role of ParB in chromosome segregation and/or regulation of transcription in W. chondrophila.
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L'ordre des Chlamydia/es est composé de bactéries intracellulaires obligatoires telles que le pathogène humain, Chlamydia trachomatis, responsable d'infections génitales ou du trachome. Les Chlamydiae possèdent un cycle de vie biphasique impliquant l'adhésion et l'internalisation de corps élémentaires infectieux, qui se différencient en corps réticulés prolifératifs. En présence de stimuli de stress, comme les antibiotiques -lactame ou la privation en fer, la prolifération des corps réticulés est inhibée ce qui induit la formation de corps aberrants élargis et persistants. La suppression du stimulus de stress permet aux bactéries de reprendre un cycle de vie normal, ce qui suggère que les corps aberrants pourraient jouer un rôle important dans l'apparition d'infections chroniques dues aux chlamydia. Bien que les stimuli de stress induisant des corps aberrants soient bien décrits, aucune caractérisation morphologique de cette forme de persistance n'a été réalisée jusqu'à présent et les mécanismes conduisant à sa formation restent flous.
Chez de nombreux procaryotes, la protéine ParB fait partie du système ParAB-par5 qui est impliqué dans la ségrégation chromosomique et plasmidique. Bien que la fonction de ParB ait été étudiée chez de nombreuses bactéries, son rôle reste peu clair chez les Chlamydiae.
Pour clarifier ces points, la bactérie Waddlia chondrophila, apparentée aux chlamydia et potentiellement responsable de fausses couches chez les femmes ou d'avortements chez les bovins, a été utilisée comme organisme modèle. Dans cette thèse, nous avons caractérisé les corps aberrants induits par différents stimuli de stress et étudié la réponse transcriptionnelle chez des W. chondrophila persistantes induites par la privation en fer. De plus, nous avons étudié le rôle de ParB dans la ségrégation des chromosomes et dans la régulation de la transcription.
Deux modèles distincts de corps aberrants peuvent être définis selon leur morphologie et leur nombre : (i) petits et multiples ou (ii) grands et peu nombreux. Ces sous-types reflètent probablement la présence de mécanismes distincts lors de la formation des corps aberrants. Nous avons montré, avec des analyses comparatives du transcriptome, que près de 35% du génome est exprimé différentiellement chez des corps aberrants induits par la privation en fer comparé à des bactéries non traitées. Enfin, nos résultats suggèrent que ParB pourrait être impliquée dans la ségrégation des chromosomes et la régulation de la transcription chez W. chondrophi!a.
Cette thèse apporte de nouvelles perspectives sur la morphologie des corps aberrants et sur les gènes différentiellement exprimés chez cette forme de persistance. De plus, ces résultats donnent un premier aperçu du rôle de ParB dans la ségrégation des chromosomes et/ou dans la régulation de la transcription chez W. chondrophila
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