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Hacia la caracterización del epítopo del autoantígeno en el Síndrome de Goodpasture
No full textEl síndrome de Goodpasture (GP) es un desorden autoinmune que cursa con glomerulonefritis rápidamente progresiva y hemorragia pulmonar. El ataque inmunológico se lleva a cabo mediante (auto)-anticuerpos (anticuerpos GP) dirigidos contra el dominio C terminal, no colagenoso (NC1), de la cadena α3 del colágeno IV, presente en la membrana basal glomerular (GBM), así como en la membrana basal alveolar. Tres cadenas α se asocian para construir una molécula de colágeno IV, que recibe el nombre de protómero, dos protómeros de colágeno IV se unen a través de sus extremos NC1 para formar una estructura cuaternaria de naturaleza hexamérica (hexámero) en la red de colágeno IV.
Estudios cristalográficos han mostrado que en la estabilización del hexámero participan tanto interacciones hidrofóbicas, como interacciones hidrofílicas que junto con enlaces covalentes tipo sulfilimina entre protómeros opuestos sellan el hexámero.
Lo que se conoce del epítopo GP son dos regiones, llamadas EA y EB, en las que se identificaron los residuos Ala18, Ile19, Val27 y Pro28 conformando parte del epítopo patogénico. Así, éste parece ubicarse en la interfaz de los dominio NC1 que forman el hexámero de la red de colágeno de la GBM, resultando en un epítopo críptico e inaccesible para los anticuerpos GP. Cuando se disocia el hexámero, estos aminoácidos se tornan accesibles a los anticuerpos GP. En contraste, otros residuos que forman parte del epítopo, como los residuos hidrofílicos Ser21 y Ser 31, así como la Pro28, son accesibles a los anticuerpos GP tanto si el dominio NC1 se encuentra en forma hexamérica como monomérica.
Un aspecto relevante en la enfermedad GP, es el mecanismo mediante el cual los autoanticuerpos tienen acceso al epítopo. En este sentido, la proteína de unión al antígeno GP (GPBP) podría jugar un papel clave en el plegamiento de las cadenas de colágeno IV condicionando la diferente accesibilidad del antígeno GP.
Objetivos
El objetivo general de este trabajo persigue esclarecer la etiología de la enfermedad Goodpasture y profundizar en el conocimiento del epítopo de los autoanticuerpos y en la estructura 3D y ensamblaje de los componentes proteicos que forman el heterohexámero (α3,4,5)2(IV)NC1 y albergan el epítopo.
1 Caracterización mediante tecnología phage display y bioinformática del epítopo de los autoanticuerpos GP, ya localizado en el dominio α3(IV)NC1 del colágeno tipo IV.
Mientras el estudio del epítopo GP se había abordado clásicamente a partir del análisis del antígeno, aquí obtenemos información del epítopo GP a partir del análisis de los autoanticuerpos GP patogénicos.
Para ello, (1) ponemos a punto un sistema de expresión que usa células de insecto y baculovirus que permite la producción recombinante de α3(IV)NC1 y del resto de cadenas proteicas del colágeno tipo IV humano en forma abundante, funcional y estructuralmente competente; y (2) aplicamos la tecnología phage display y procedimientos bioinformáticos para cartografiar el epítopo para los anticuerpos circulantes de un paciente Goodpasture sobre un modelo de la estructura 3D del heterohexámero (α3,4,5)2(IV)NC1.
2 Establecer las bases estructurales de los dominios NC1 del colágeno IV para comprender la biología y patología asociadas al colágeno IV en las membranas basales.
Cristalizamos los seis α(IV)NC1 y varias asociaciones de ellos para, mediante la resolución de sus respectivas estructuras a nivel atómico, entender el proceso de ensamblaje y formación del protómero en el colágeno IV, así como de las interacciones que lo mantienen y que lo preservan del ataque de los anticuerpos GP.
3 Implicación de GPBP-1 en el ensamblaje del colágeno tipo IV y consecuencias inmunopatogénicas.
Mostramos mediante la coexpresión simultánea de α3(IV)NC1 y GPBP-1 y estudios de resonancia de plasmón de superficie, de estructura de proteínas por cristalografía de rayos X y de caracterización inmunoquímica y de mutagénesis dirigida, que GPBP-1 modifica el plegamiento de α3(IV)NC1 y la exposición del epítopo de anticuerpos patogénicos.
Resultados y conclusiones.
Objetivo 1.
Hemos aplicado la tecnología phage display por primera vez en la caracterización del epítopo de los anticuerpos GP. Hemos seleccionado péptidos específicos (fagotopos) para los autoanticuerpos GP a partir de dos librerías phage display-M13 de péptidos combinatoriales comerciales que hipotéticamente mimetizan las propiedades físico-químicas y la organización espacial de los auto-epítopos. En base a esta información, hemos generado quimeras, preparadas a partir de la proteína α2(IV)NC1, que son reconocidas por los anticuerpos GP con similar intensidad a como lo hacen con la diana natural α3(IV)NC1. Nuestros resultados, no sólo corroboraron hallazgos previos en la definición del epítopo sino que identificaron nuevos residuos (Thr26, Tyr30, Thr127, Pro131, His134, Lys141, Thr99 y Ala196) involucrados en la unión de los autoanticuerpos GP. Además de proporcionar nueva información estructural sobre los epítopos GP, proponemos el uso de nuevos compuestos (péptidos) con capacidad de bloquear la unión de los autoanticuerpos GP a su autoantígeno “in vivo” y aportamos datos cinéticos de la interacción antígeno-anticuerpo que, eventualmente, podrían resultar críticos en la generación de agentes bloqueantes terapéuticos.
Objetivo 2.
Pretendíamos establecer la estructura del heterohexámero (α3,4,5)2(IV)NC1, que es la diana de los autoanticuerpos en el síndrome de Goodpasture, y trasladar los hallazgos sobre el epítopo obtenidos en el objetivo 1 a una estructura hasta entonces desconocida.
No tuvimos éxito en cristalizar tal heterohexámero probablemente por la asombrosa facilidad de uno de sus componentes (α5(IV)NC1) para cristalizar de forma aislada. Sí resolvimos, sin embargo, la estructura atómica, mediante cristalografía de rayos X, de homohexámeros de (α1(IV)NC1), (α3(IV)NC1), (α4(IV)NC1) y α5(IV)NC1, así como de heterohexámeros de ((α1)2(α2))2(IV)NC1 y de (α5,6,6)2(IV)NC1.
La estructura de cada uno de los homohexámeros, excepto el de (α4(IV)NC1), junto con aquella de ambos heterohexámeros, resultó ser extremadamente similar, con un valor RMSD de superposición inferior a 0,8 Å. Todas tienen una estructura hexamérica cuaternaria típica para los α(IV)NC1, ya observada en el heterohexámero ((α1)2(α2))2(IV)NC1 encontrado en la placenta humana (PDB id:1LI1) y bovina (PDB id:1T61) y en la cápsula de cristalino bovino (PDB id:1M3D, 1T60). Esto demostraba que las nuevas estructuras aquí obtenidas poseen estructura cuaternaria fisiológica, validando, por tanto, el sistema de expresión que hemos usado, así como la idoneidad de los procesos de purificación y cristalización seguidos. El cristal del heterohexámero (α5,6,6)2(IV)NC1 reveló que este protómero no está constituido por dos moléculas de α5(IV)NC1 y una de α6(IV)NC1, como se creía, sino por dos moléculas de α6(IV)NC1 y una de α5(IV)NC1.
La estructura de α4(IV)NC1 mostró claras diferencias respecto al resto de homohexámeros, evidenciando que las proteínas α(IV)NC1 pares exhiben menor plasticidad, lo que probablemente sea la causa de y limite su tendencia a la autoasociación. Las diferencias estructurales en α4(IV)NC1 impiden la formación del protómero y del hexámero al cambiar y limitar las interacciones que se establecen entre diferentes regiones en el resto de proteínas α(IV)NC1. El análisis de los heterohexámeros ((α1)2(α2))2(IV)NC1 y (α5,6,6)2(IV)NC1 reveló unas estructuras muy similares al resto de monómeros α(IV)NC1 permitiendo comprender que, una vez los α(IV)NC1 pares interaccionan con α(IV)NC1 impares, modifican su conformación para favorecer la formación del protómero, así como para proveerle estabilidad.
La información estructural nos permitió concluir que los anticuerpos patogénicos GP se dirigen a dos regiones en α3(IV)NC1 que comprenden los residuos 15-TAIPSCPEGTVPLYS-29 (región EA) y 125-TDIPPCPHGWISLWK-139 (región EB), dos regiones estructuralmente rígidas situadas en el ápice de los dos dominios estructurales C4.
Objetivo 3.
Presentamos evidencias de que GPBP-1 influencia la estructura de α3(IV)NC1, como se observa, tras la co-expresión de ambas proteínas, en la estructura cristalina a nivel atómico de α3(IV)NC1, en la caracterización termodinámica de la interacción de α3(IV)NC1 con anticuerpos conformacionales y en su reconocimiento inmunoquímico. Mientras que los resultados inmunoquímicos y mediante SPR son indicativos de que GPBP-1 influencia la conformación de α3(IV)NC1, el estudio estructural de la proteína α3(IV)NC1 expresada y no expresada junto a GPBP-1, claramente revela la naturaleza de los cambios mediados por la presencia de la cinasa.
GPBP-1 promueve la generación de cristales diferentes (en términos de grupo espacial y moléculas en la unidad asimétrica) a aquellos constituidos por un solo tipo de moléculas de α3(IV)NC1 (obtenidas en ausencia de GPBP-1 y que son competentes para ensamblarse en hexámeros) por contener también un segundo tipo de molécula de α3(IV)NC1 modificada (α3(IV)NC1c), sólo encontrada cuando su expresión ocurre junto a GPBP-1, y cuya capacidad de interacción se restringe a trímeros. Los cambios estructurales observados se localizan esencialmente en dos lazos de las regiones I y VI del dominio C4 condicionando la capacidad de ensamblaje de los trímeros en hexámeros. Este hecho se evidencia mejor en el ensanchamiento general de los trímeros originados por α3(IV)NC1c que impide el ensamblaje con el trímero vecino para formar el hexámero. Además, uno de estos lazos alberga la Lys211 involucrada en un enlace sulfilimina que da estabilidad al hexámero y restringe la accesibilidad de los autoanticuerpos GP por lo que se le atribuye un papel substancial en la patogenia del síndrome GP. La predicción para un heterohexámero (α3,4,5)2(IV)NC1 que contuviese una molécula de α3(IV)NC1c apuntaría a que se produjese una perturbación de las interacciones con las moléculas de α4(IV)NC1 y α5(IV)NC1 vecinas dentro del heterohexámero y una abolición de los enlaces sulfilimina, convirtiéndolo, de este modo, más susceptible al acceso de los anticuerpos GPc.
La observación de que la reactividad de los autoanticuerpos GP sea mucho mayor hacia homohexámeros de α3(IV)NC1 que se han expresado simultáneamente con GPBP-1 que frente a homohexámeros de α3(IV)NC1 preparados en ausencia de GPBP o frente a formas monoméricas de α3(IV)NC1 bajo cualquier circunstancia, es consistente con el conocimiento presente del autoepítopo y refuerza la propuesta del papel de la cinasa en la etiología de la enfermedad Goodpasture, quizás facilitando la exposición del epítopo, la activación del sistema inmune y la producción de autoanticuerpos patogénicos. Los resultados de mutagénesis dirigida tanto en α3(IV)NC1 como en GPBP-1 se complementan y confirman que las modificaciones estructurales observadas en α3(IV)NC1 cuando se co-expresa junto a GPBP-1 se deben a la presencia de la cinasa.
Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión elevada de GPBP-1 in vivo desorganiza la MBG, lo que podría permitir la exposición de epítopos crípticos y desencadenar un proceso autoinmune en el síndrome de Goodpasture y/o un proceso inflamatorio que culminaría en una Glomerulonefritis
Role of gut microbiota glycosyl hydrolases in rotavirus and norovirus infection
Full text linkRotavirus (RV) and norovirus (NoV) are enteric viruses that cause acute gastroenteritis (AGE). The symptoms associated with this disease are diarrhoea, vomiting, malaise, fever, dehydration and in the most severe cases, mortality. In 2016, RV caused the death of 128,500 children under 5 and NoV of 218,800 people of all age groups, with the majority of the cases occurring in low-income countries. Despite a substantial decrease in deaths in the last 20 years after RV vaccine (RVV) introduction, the prevalence of this disease remains a concern.
RV is a double-stranded RNA virus that belongs to the Sedoreoviridae family. Its virion is a triple-layered particle (TLP), being the most external layer composed of the glycoprotein VP7 and the protease-sensitive protein VP4, which define the G and P genotypes respectively. The most reported strain worldwide is G1P[8], followed by G2P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8] and G12P[8]. VP4 is cleaved post-translationally into the subunits VP5* and VP8*, being the second one responsible for cellular receptor interaction.
As for NoV, the leading cause of viral AGE after RVV introduction, it is a single-stranded RNA virus, polyadenylated and with positive polarity, which belongs to the family Caliciviridae. Its capsid is composed of VP1 and VP2 proteins, with the P2 subdomain of the VP1 at the outermost part. The genotype GII.4 Sydney 2012 is the most prevalent strain. Contrary to RV, no vaccine is available.
Histo-blood group antigens (HBGAs) act as RV and NoV receptors or co-receptors. These are complex carbohydrates found on the mucosal surfaces of the gastrointestinal tract, among others. This means that both RV and NoV have lectin activity. The synthesis of HBGAs at the digestive tract is catalysed by an α1-2 fucosyltransferase (FUT2), an α1-3 or α1-4 fucosyltransferase (FUT3) and two glycosyltransferases (A and B enzymes). FUT2 determines the secretor status while FUT3 the Lewis status. These enzymes catalyse the production of Lewis antigens (lewisa, lewisb, lewisx and lewisy antigens), H type-1 and type-2 antigens, A type-1 and type-2 antigens and B type-1 and type-2 antigens. The absence of functional FUT2 leads to secretor negative individuals while the absence of FUT3 to Lewis negative individuals, and thus, the absence of specific HBGAs. RVs and NoVs recognize HBGAs in a genotype-dependent manner, thereby the presence or absence of specific antigens affects the viral ability to infect its host cells. Secretor status is reported to be a cause of P[8] and P[4] RVs and GII.4 NoVs susceptibility. Gut microbiota present a wide range of glycosyl hydrolases (GHs) that allow them to use the host glycans as a nutrient source. They possess fucosidases and sialidases to remove fucoses and sialic acid from the end of the glycan chains, as well as exo- and endo-β-N-acetylglucosaminidases, β-galactosidases, α-N-acetylglucosaminidases, endo-β1,4-galactosidases, and α-N-acetylgalactosaminidases. Many studies have stated the role of bacteria in the promotion of RV and NoV infections. Among other mechanisms, they might modulate viral replication by modifying the HBGAs.
The present work has been focused on the investigation of the role of the GHs of the gut microbiota on RV and NoV infections. It was hypothesized that bacterial fucosidases may modulate RV and NoV attachment and replication. To test this hypothesis, it was performed a metagenome study from infant faeces. A total of 10 bacterial fucosidases were selected and characterized. Finally, two fucosidases from the microbiota member Bifidobacterium bifidum JCM 1254, previously characterized, were chosen to perform further experiments, being AfcA, with α1-2 fucosidase activity and AfcB, with α1-3/4 fucosidase activity.
Later, two clinical RV isolates (RV7 and RV39) and the cell culture-adapted RV strain Wa were used to infect various cell lines with different HBGAs composition. Differentiated Caco-2 (dCaco-2), HT29, HT29 M6 and human intestinal enteroids (HIEs) were employed as cell lines bearing HBGAs, while MA104 and undifferentiated Caco-2 (uCaco-2) served as cell types without HBGAs. It was detected that clinical isolates replicated more efficiently on those cell lines displaying HBGAs on their surface, while Wa on MA104, cell type which lacks HBGAs on which Wa had been adapted. Once it was determined that HBGAs are relevant for human circulating RV infection, the role of fucosidases was studied. AfcA and AfcB fucosidases were used to treat dCaco-2 prior to RV infection. Results showed higher attachment, viral yield and replication for RV7 and RV39. A less but notable increase in viral yield was also detected for Wa. As for NoV, infections were performed on 3D HIEs. However, decreases in viral attachment, yield and replication were observed after fucosidase treatment. Fucosidases were also tested on mice. Those were infected with Wa and GII.4 NoV after treatment with AfcA, where it was detected significant increases of the viral shedding for the two viruses, even a more prolonged shedding in the case of RV.
Since both RV and NoV seemed to benefit from the fucosidase treatment, the effect of a fucosidase inhibitor, the 1-deoxyfuconojyrimicin, was also investigated. Once it was confirmed the specificity of the compound, viral stocks were incubated with different concentrations of the inhibitor. Many assays were performed in vitro an in vivo including the infection of clinical RV isolates and Wa in dCaco-2 cells, NoV infection of 3D HIEs, and RV Wa and NoV infection of mice. All the experiments gave the same result: viral treatment with the fucosidase inhibitor caused a decrease in viral replication.
We can conclude that the HBGAs binding activity (lectin) /fucosidase balance is relevant for both enteric viruses, RV and NoV. In the in vitro models the addition of bacterial fucosidases resulted in an increased RV replication and this effect was found in vivo in RV and NoV infections in mice. Furthermore, the fucosidase inhibitor 1-deoxyfuconojyrimicin HCl showed an antiviral effect in both viruses in vitro and in vivo pointing to a new antiviral target and opening new avenues for the development of new antiviral treatments.Beca predoctoral ACIF/2020/085 de Generalitat ValencianaBeca estancia en el extranjero CIBEFP/2022/42 de Generalitat Valencian
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
Descobrint les interaccions amb glicans de les espècies de rotavirus B, C i H en l'intestí humà
No full textRotaviruses (RV) are among the leading causes of acute viral gastroenteritis in young children and in bovine and porcine livestock worldwide, affecting both human and animal health. Their pathogenesis can lead to dehydration and death, particularly in children under five years of age in developing countries, and causes significant economic losses in the livestock industry. There is growing evidence that host cell glycans, such as histo-blood group antigens (HBGAs) and sialic acids (SAs), are recognized by the RV surface protein VP4.
Epidemiological studies have also shown that the absence of certain HBGAs reduces susceptibility to RVA infections. However, the exact mechanisms underlying these interactions and their impact on RV infection and pathogenesis remain unclear. Furthermore, knowledge regarding the receptors involved in RVB, RVC, and RVH infections is still limited, although their study is essential to understanding viral tropism and potential zoonotic events.
To investigate whether RVB, RVC, and RVH interact with host glycans, 16 VP8* proteins from different reference genotypes, both human and animal, were cloned and purified. These proteins exhibited diverse glycan-binding profiles. Several genotypes were found to recognize N-acetyllactosamine (LacNAc), the precursor of type 2 HBGAs. In addition, certain genotypes showed specific interactions with more specialized glycans, such as sialyl Lewisx or the A trisaccharide, as well as with the ganglioside GM3. The bovine P[3] genotype of RVC demonstrated a strong affinity for the H2 antigen and its LacNAc precursor, an interaction characterized by STD NMR spectroscopy and structural analysis through X-ray crystallography. The crystal structure of the VP8* protein revealed unique features distinguishing it from the human VP8*, findings that were further supported by structural predictions using AlphaFold2.
To assess the functional relevance of these interactions, CRISPR/Cas9 genome editing tools were used to generate knockouts of the GNE, SLC35A1, and EXTL3 genes in the MA-104 cell line. Results showed that SA synthesis is essential for productive RVA infection and that disruption of ganglioside synthesis affects the replication of specific RVA and RVC strains. Additionally, heparan sulfate was found to act as a potential cofactor in RVC infection.
Finally, population exposure to non-A RV species was evaluated in the Valencian Community by analyzing seroprevalence against RVA, RVB, RVC, and, for the first time, RVH. Overall, this study demonstrates the circulation of non-A RV species in the population and highlights the critical role of host glycan biology in viral infection mechanisms.Els rotavirus (RV) es troben entre les principals causes de gastroenteritis vírica aguda en xiquets menuts i en bestiar boví i porcí arreu del món, afectant tant la salut humana com la dels animals. La seua patogènesi pot provocar deshidratació i mort, especialment en xiquets menors de cinc anys en països en vies de desenvolupament, i suposa pèrdues econòmiques importants per a la indústria ramadera. Cada vegada hi ha més evidències que els glicans cel·lulars de l’hoste, com els antígens dels grups sanguinis histo (HBGAs) i els àcids siàlics (SAs), són reconeguts per la proteïna de superfície VP4 dels RV.
Estudis epidemiològics també han mostrat que l’absència de determinats HBGAs redueix la susceptibilitat a infeccions per RV de grup A (RVA). No obstant això, els mecanismes exactes que subjauen a aquestes interaccions, així com el seu impacte en la infecció i la patogènesi viral, continuen sense estar clars. A més, el coneixement sobre els receptors implicats en les infeccions per RV de grups B, C i H (RVB, RVC i RVH) encara és limitat, tot i que el seu estudi és fonamental per a entendre el tropisme viral i els possibles esdeveniments zoonòtics.
Per tal d’investigar si RVB, RVC i RVH interaccionen amb glicans de l’hoste, es van clonar i purificar 16 proteïnes VP8 de diferents genotips de referència, tant humans com animals. Aquestes proteïnes mostraren perfils d’unió a glicans diversos. Es va trobar que diversos genotips reconeixien N-acetillactosamina (LacNAc), precursor dels HBGAs de tipus 2. A més, alguns genotips presentaren interaccions específiques amb glicans més especialitzats, com Lewisx siàlic o el trisacàrid A, així com amb el gangliòsid GM3. El genotip porcí P[3] de RVC va mostrar una afinitat elevada per l’antigen H2 i pel seu precursor LacNAc, una interacció caracteritzada mitjançant espectroscòpia STD NMR i anàlisi estructural per cristal·lografia de raigs X. L’estructura cristal·lina de la proteïna VP8 va revelar trets únics que la diferencien de la VP8* humana, resultats que es van confirmar amb prediccions estructurals emprant AlphaFold2.
Per a avaluar la rellevància funcional d’aquestes interaccions, es van utilitzar eines d’edició genòmica CRISPR/Cas9 per generar línies cel·lulars MA-104 amb els gens GNE, SLC35A1 i EXTL3 inactivats. Els resultats mostraren que la síntesi d’àcids siàlics és essencial per a una infecció productiva per RVA i que la interrupció de la síntesi de gangliòsid afecta la replicació de determinades soques de RVA i RVC. A més, es va observar que el sulfat d’heparà podria actuar com un cofactor potencial en la infecció per RVC.
Finalment, es va avaluar l’exposició poblacional a espècies de RV no-A a la Comunitat Valenciana mitjançant l’anàlisi de la seroprevalença contra RVA, RVB, RVC i, per primera vegada, RVH. En conjunt, aquest estudi demostra la circulació d’espècies de RV no-A en la població i posa de manifest el paper clau de la biologia dels glicans de l’hoste en els mecanismes d’infecció viral.Los rotavirus (RV) se encuentran entre las principales causas de gastroenteritis vírica aguda en niños pequeños y en ganado bovino y porcino en todo el mundo, afectando tanto a la salud humana como a la animal. Su patogénesis puede provocar deshidratación y muerte, especialmente en niños menores de cinco años en países en desarrollo, y conlleva importantes pérdidas económicas para la industria ganadera. Cada vez hay más evidencias de que los glicanos celulares del hospedador, como los antígenos de los grupos sanguíneos histo (HBGAs) y los ácidos siálicos (SAs), son reconocidos por la proteína de superficie VP4 de los RV.
Estudios epidemiológicos también han demostrado que la ausencia de determinados HBGAs reduce la susceptibilidad a infecciones por rotavirus del grupo A (RVA). Sin embargo, los mecanismos exactos que subyacen a estas interacciones, así como su impacto en la infección y la patogénesis viral, siguen sin estar claros. Además, el conocimiento sobre los receptores implicados en las infecciones por rotavirus de los grupos B, C y H (RVB, RVC y RVH) todavía es limitado, aunque su estudio es esencial para comprender el tropismo viral y los posibles eventos zoonóticos.
Con el fin de investigar si RVB, RVC y RVH interaccionan con glicanos del hospedador, se clonaron y purificaron 16 proteínas VP8 de distintos genotipos de referencia, tanto humanos como animales. Estas proteínas mostraron perfiles de unión a glicanos diversos. Se observó que varios genotipos reconocían N-acetillactosamina (LacNAc), precursor de los HBGAs de tipo 2. Además, ciertos genotipos presentaron interacciones específicas con glicanos más especializados, como Lewisx siálico o el trisacárido A, así como con el gangliósido GM3. El genotipo porcino P[3] de RVC mostró una elevada afinidad por el antígeno H2 y su precursor LacNAc, una interacción caracterizada mediante espectroscopía STD NMR y análisis estructural por cristalografía de rayos X. La estructura cristalina de la proteína VP8 reveló características únicas que la distinguen de la VP8* humana, hallazgos que fueron confirmados mediante predicciones estructurales utilizando AlphaFold2.
Para evaluar la relevancia funcional de estas interacciones, se utilizaron herramientas de edición genómica CRISPR/Cas9 para generar líneas celulares MA-104 con los genes GNE, SLC35A1 y EXTL3 inactivados. Los resultados mostraron que la síntesis de ácidos siálicos es esencial para una infección productiva por RVA y que la interrupción de la síntesis de gangliósidos afecta la replicación de ciertas cepas de RVA y RVC. Además, se observó que el sulfato de heparán podría actuar como un cofactor potencial en la infección por RVC.
Finalmente, se evaluó la exposición poblacional a especies de rotavirus no-A en la Comunidad Valenciana mediante el análisis de seroprevalencia frente a RVA, RVB, RVC y, por primera vez, RVH. En conjunto, este estudio demuestra la circulación de especies de RV no-A en la población y pone de manifiesto el papel clave de la biología de los glicanos del hospedador en los mecanismos de infección viral.Generalitat Valenciana, ACIF-2020-076Instituto de Salud Carlos III, PI20/008013 - Salut i Benesta
koamabayili/VECTRON-author-checklist: VECTRON author checklist
No full textWe have done our best to complete the author checklist relating to the use of animals in the hut study. Note that the objective for the hut study was to evaluate the IRS treatment applications for residual efficacy against Anopheles mosquitoes, including the local An. coluzzii mosquito population. Cows were only used to attract mosquitoes into the huts and no tests were carried out directly on the cows. The author checklist is intended for use with studies where experiments are carried out on animals, which is why we have had such difficulty in completing this for the hut study, as many of the questions do not relate to how the cows were used
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