1,720,982 research outputs found
Quantitativer Ansatz zum Nachweis von RNA und Proteinen mittels Sandwich-Hybridisierungstechnologie
No full textThe detection and quantification of proteins and nucleic acids is an important procedure across a wide variety of biological disciplines and has forever changed and improved our ability to accurately determine unique traits in sample consistency. In this thesis, we show the applicability of a sandwich hybridization technology for the detection and quantification of (i) collagen prolyl-4-hydroxylase expression, (ii) Bacillus subtilis airborne spores and (ii) Salmonella in food samples. For collagen prolyl-4-hydroxylase detection, we developed a sandwich ELISA utilizing antibodies for two different subunits of the protein, optimized the procedure and the antibody concentrations using experimental design approach, and applied the method to monitor the recombinant protein concentration in crude cell extracts during its production in E. coli. To detect Bacillus subtilis spores from the air, we established a procedure that includes spore activation, germination, and enrichment cultivation, cell disruption, and RNA analysis using a sandwich hybridization assay (SHA). Using this process we were able to detect less than 10 spores in a single sample after 5 hours of enrichment cultivation. To analyze food samples for Salmonella contamination, we developed an improved enrichment cultivation procedure together with a SHA detection method. Salmonella 23S rRNA was selected as a target for the SHA. The SHA showed high selectivity toward S. Typhimurium, even in the presence of high concentration of background flora. Moreover, using the modified media, we achieved a significant improvement in the recovery of heat injured Salmonella cells. In this thesis we show that sandwich hybridization technology is a fast and convenient tool for the detection of a wide range of biomolecules in a variety of samples, demonstrating its potential and illustrating the possibilities for further development.Der Nachweis und die Quantifizierung von Proteinen und Nukleinsäuren ist ein wichtiges Verfahren in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen und hat unsere Fähigkeit, einzigartige Merkmale in der Probenkonsistenz genau zu bestimmen, für immer verändert und verbessert. In dieser Arbeit wird das Potential der Sandwich-Hybridisierungstechnologie für die Quantifizierung von Zielmolekülen in verschiedenen Anwendungen aufgezeigt: (1) die funktionelle Expression von Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase, (2) für den quantitativen Nachweis von Bacillus-Sporen und (3) für die Detektion von Salmonellen in Lebensmittelproben. Für den Nachweis von Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase wurde ein Sandwich-ELISA unter Verwendung von Antikörpern für zwei verschiedenen Untereinheiten des Enzyms entwickelt und mit Hilfe des statistisch basierten Experimentellen Designs (DoE) optimiert. Dieser Assay wurde dann zur Bestimmung der heterologen Expression der Kollagen-Prolyl-4-Hydroxylase in einem Escherichia coli Fed-batch Prozess angewandt. Zur Detektion von Bacillus-Sporen in der Luft, wurde am Beispiel von Bacillus subtilis ein Verfahren etabliert, das Sporenaktivierung, Keimung und Anreicherungskultivierung, Zellaufschluss und RNA-Analyse unter Verwendung eines Sandwich-Hybridisierungs-Assays (SHA) umfasst. Mit diesem Verfahren konnten nach fünf Stunden Anreicherungskultivierung in einer Probe weniger als 10 Sporen nachgewiesen werden. Schließlich wurde zur Detektion von Salmonellenkontaminationen in Nahrungsmittelproben ein verbessertes Anreicherungsanbauverfahren zusammen mit einer Sandwich-Hybridisierung als Nachweismethode entwickelt. Der auf der quantitativen Detektion von 23S rRNA basierende Assay zeigte eine hohe Selektivität gegenüber S. Typhimurium, sogar in Gegenwart einer hohen Konzentration der Hintergrundflora. Darüber hinaus wurde bei der Anreicherung durch die Verwendung modifizierter Medien eine signifikante Erhöhung der Ausbeute an Salmonella-RNA aus vorher hitzegeschädigten Proben erhalten und damit eine wesentliche Erhöhung der Sensitivität. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit das Potential der Sandwich-Hybridisierungstechnologie als eine einfach zu etablierende und sehr sensitive Methode zum quantitativen Nachweis von Biomolekülen für unterschiedliche Anwendungsbereiche in der mikrobiellen Diagnostik aufgezeigt werden, was trotz neuer alternativer Entwicklungen auf dem Gebiet, das Potential der Methode dokumentiert
Method validation of the plasticizers DEHT and DINCH due to the synthesis of their isotope standards
No full textDie Gesundheitsrelevanz von Phthalatweichmachern und die damit einhergehenden rechtlichen Einschränkungen des Gebrauches haben den Bedarf einer validen Rückstandsanalytik sowohl für ebendiese Weichmacher als auch für deren Substituenten DINCH und DEHT induziert. Insbesondere die Kontaminationsgefahr und die Blindwertproblematik durch die ubiquitäre Ausbreitung von Phthalatweichmachern sind für Analysenverfahren problembehaftet, sodass Expositionsabschätzungen für Weichmacher und Human-Biomonitoring-Studien in ihren Ergebnissen zum Teil differieren. Zur Entwicklung kontaminationsfreier, robuster und valider Analysenverfahren für DINCH und DEHT erfolgte die Syntheseentwicklung der vier stabilen Isotopenstandards 1,2-D2-(di-1-Nonyl)1,2-dicyclohexandicarboxylat („D-1-NCH-D2“), 1,2-D2-Diisononyl-1,2-dicylcohexandicarboxylat („DINCH-D2“), 1,2,4,5-D4-Diisononyl-1,2-dicylcohexandicarboxylat („DINCH-D4“) 2,3,5,6-D4-Bis(2-ethylhexyl)terephthalat („DEHT-D4“). Die Standards wurden charakterisiert und ihre Eignung durch Lagerungs- und Probenaufarbeitungsexperimente in Worst-Case-Szenarien wurde gezeigt. Darüber hinaus erfolgte die Synthese des Haptens 4-Hydroxycyclohexan-1,2-dicarbonsäure-diisononylester („4-Hydroxy-DINCH“). Anhand dieser Standards erfolgte unter Korrektur der Reinheit und der Markierungsgrade der Standardsubstanzen die Etablierung und Methodenabsicherung der Analytik von DINCH und DEHT aus Bedarfsgegenständen, Hausstaub-, Boden- sowie Wasserproben mittels GCEI+-MS anhand der SIM-Spuren m/z 261 und m/z 279 für DEHT sowie m/z 155 und m/z 299 für den Weichmacher DINCH. Als einzige wesentliche Störkomponenten konnten die Weichmacher DINP und DIDP ausgemacht werden, die die Analytik des DINCH bei hohen Konzentrationsunterschieden, wie sie in Bedarfsgegenständen erfolgen können, stören. Zur Umgehung der Problematik konnte gezeigt werden, dass eine Analytik von DINCH den Störsubstanzen mittels GC-MS/MS möglich ist. Die Analyse von 78 Bedarfsgegenständen zeigte keinen Fall, in welchem DINP oder DIDP neben DINCH verwendet wurden. Die verifizierten Arbeitsbereiche der Matrixkalibrierungen betrugen aus Bedarfsgegenständen für DEHT 20 – 4000 mg/kg und bezüglich DINCH 60 – 4000 mg/kg. Die Analytik aus Hausstaubproben zeigte verifizierte Bereiche von 0,4 – 80 mg/kg für DEHT sowie 1,2 – 40 mg/kg für DINCH. Die Analytik aus Bodenproben hatte verifizierte Arbeitsbereiche von 0,9 mg/kg – 600 mg/kg für DEHT sowie 9 – 300 mg/kg für DINCH. Die verifizierten Arbeitsbereiche aus Wasserproben betrugen 0,2 – 20 mg/kg DEHT sowie 0,8 – 12 mg/kg für DINCH. Die angegebenen Arbeitsbereiche sind nicht signifikant für die Messempfindlichkeit der entwickelten Analysenmethoden. Diesbezüglich werden die nicht verifizierten Bestimmungsgrenzen angegeben. Aus Kunststoffbedarfsgegenständen betrugen ebendiese 0,6 mg/kg für DEHT und 11,4 mg/kg aus DINCH. Für Hausstaub wurden Bestimmungsgrenzen von 0,016 mg/kg für DEHT sowie 0,1 mg/kg für DINCH ermittelt. Die Bestimmungsgrenzen aus Bodenproben betrugen 0,12 mg/kg für DEHT sowie 1,5 mg/kg für DINCH. Aus Wasser wurden Bestimmungsgrenzen von 0,004 mg/kg für DEHT sowie 0,09 mg/kg für DINCH ermittelt. Neben der Robustheit der Analysenmethoden konnte die Eignung der Analytik für Migrationsuntersuchungen aus Lebensmittelkontaktmaterialien gezeigt werden. Die Untersuchung von Realproben zeigte, dass 24 % der Bedarfsgegenstände den Weichmacher DINCH und 37 % DEHT enthielten. Demgegenüber enthielten von 204 Hausstaubproben aus Kindertagesstätten, Schulen, Wohnungen, Büros und Innenräume von öffentlichen Einrichtungen 74,0 % DINCH und 69,6 % den DEHT. 21,6 % der Hausstaubproben enthielten Gehalte, die unterhalb des verifizierten Arbeitsbereiches lagen.The health issues of phthalate plasticizers are well known, so are the regulations of different plasticizers. The most important concern of analyzing plasticizers is the danger of contamination due to its ubiquity. The most common mistake in analyzing non-phthalate plasticizers is using phthalates or deuterated phthalates as internal standards. This is why results from human-monitoring-studies in some cases do not fit with its equivalent studies which analyze the total exposure. As a result from this is a need of valid methods of quantifying phthalates and its substitutes DINCH and DEHT.
In order to realize robust an valid methods of analyzing DINCH and DEHT the deuterated internal standards 1,2-D2-Bis-1-nonyl)-1,2-cyclohexanedicarboxylate („D-1-NCH-D2“), 1,2D2Bisisononyl-1,2-dicylcohexanedicarboxylate („DINCH-D2“), 1,2,4,5-D4-Bisisononyl-1,2-dicylcohexanedicarboxylate („DINCH-D4“)and 2,3,5,6-D4-Bis(2-ethylhexyl)terephthalate (“DEHT-D4”) were synthesized. The characterization, storage and extraction experiments of the standards showed that the purity, stability and isotope tracing ratio suit verifiably to be used as internal standards in isotope dilution analysis (SIDA). These isotope standards were used to develop valid and robust analysis of the plasticizers DEHT and DINCH in articles of daily use, house dust, soil samples and water samples by GC-EI+-MS. The SIM chromatograms of m/z 261 and m/z 279 were used for DEHT, m/z 155 and m/z 299 were used to analyze DINCH. The analysis of DINCH from articles of daily use showed matrix effects with the plasticizers DINP and DIDP. It could be shown that these plasticizers can be analyzed from in the same samples by transferring the analysis to GC-MS/MS. The investigation of 78 different article of daily use showed not a single article in which DINCH and DINP or DIDP occured in the same sample. In addition to the synthesis of the isotope standards 4Hydroxy-bis-(isononyl)-1,2-dicylcohexanedicarboxylate („4Hydroxy-DINCH“) was synthesized as a hapten.
The method development showed verified ranges of calibration from 20 – 4000 mg/kg of DEHT and from 60 – 4000 mg/kg of DINCH in articles of daily use. The analysis from house dust resulted in verified ranges of calibration from 0,4 – 80 mg/kg of DEHT and 1,2 – 40 mg/kg of DINCH. The verified rages of calibration from soil samples reached 0,9 mg/kg – 600 mg/kg of DEHT and 9 to 300 mg/kg of DINCH. The ranges of calibration from water samples were verified between 0,2 – 20 mg/kg for DEHT and between 0,8 – 12 mg/kg for DINCH. In addition to that the not-verified limits of quantification were determined to get reliable parameters about the measuring sensitivity of the methods to compare these analyses to other matrices and different applications. The developed methods showed high robustness, trueness and accuracy. They are suitable for being used in migration experiments from articles of daily use into foodstuff simulants. The limits of quantitation were determined. Articles of daily use showed limits of quantitation for DEHT of 0,6 mg/kg and 11,4 mg/kg as for DINCH. House dust samples showed limits of quantitation of 0,016 mg/kg and 0,1 mg/kg for DEHT and DINCH. The limit of quantitation of DEHT from soil samples was 0,12 mg/kg, the limit of quantitation of DINCH from soil samples was 1,5 mg/kg. The limits of quantitation of DEHT from water samples were 0,004 mg/kg and 0,09 mg/kg for DEHT and DINCH. The analysis of 78 articles of daily use showed that 24 % of the samples included the plasticizer DINCH and 37 % of the tested articles included DEHT. The analysis of 204 house dust samples from nurseries, schools, apartments, offices and indoor dust from public institutions showed that 74,0 % of the samples included DINCH above the lowest verified concentration and 69,6 % of the samples included DEHT above the lowest limit of quantitation. 21,6 % of the samples neither included DINCH nor DEHT above the lowest verified concentration
Synthesis und reactivity of the 4-epoxy-2E-decenals in beer
No full textFettsäuren sind wesentliche Bestandteile aller Organismen. Sie dienen als Energiespeicher, Strukturelemente oder Ausgangsstoffe für weitere Stoffwechselprozesse. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (Linolsäure, Linolensäure) zeichnen sich durch eine hohe Reaktivität aus. Die (Abbau-)Produkte dieser Fettsäuren können Träger intensiver Aromen sein. Einige dieser Produkte werden wegen des intensiven Geruchs als Fehlaromen wahrgenommen und können mit entsprechender Quantifizierung als Marker für die Alterung in Bier und anderen Lebensmitteln dienen. Diese sehr geruchs- und geschmacksaktiven Komponenten werden daher auch als Alterungscarbonyle bezeichnet. Zu diesen gehören 4Z- und 4E-Epoxydecenal. Für das 4E-Epoxydecenal wird ein extrem niedriger Schwellenwert von 15x10-4 ng/L in Luft und 15 ng/L (entspr. 0,015 ppb) in Wasser, retronasal, berichtet. Beide Epoxydecenal-Isomere sind sehr reaktiv, dadurch sind sie sehr schwer exakt quantifizierbar, da sie schnell mit Luftsauerstoff oder anderen Matrixbestandteilen reagieren. Abhilfe schafft hier die Stabilisotopen-Verdünnungsanalyse (SIDA). In der vorliegenden Arbeit werden Synthesewege für die Herstellung beider Isomere entwickelt, die es ermöglichen geeignete Isotopenmarkierungen einzubringen. Für das 4Z-Isomer ist bisher kein Weg beschrieben, um es in reiner Form in guten Ausbeuten herzustellen. Mit diesen isotopenmarkierten Standards wird gezeigt, dass die Bildung von 4E- und 4Z-Epoxydecenal in Bier stark temperaturabhängig ist und bei forcierter Alterung bei 40°C nach 60 Tagen ein Maximum von 0,09 (4Z-) bzw. 0,14 ppb (4E-Epoxydecenal) erreicht. Bei niedrigeren Temperaturen ist die Reaktion langsamer, wie der flachere Verlauf der Kurve zeigt. Weiterhin wird der Einsatz von 13C-markierter Linolsäure und einer 18O2-Atmosphäre beschrieben. Damit wird gezeigt dass 4-Epoxydecenal während der Lagerung von Bier durch Abbau von Linolsäure in einem oxidativen Prozess unter Verbrauch von Sauerstoff gebildet wird. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit ist die Untersuchung der Reaktivität von 4-Epoxydecenal an Modellnucleophilen. Es wird gezeigt, dass der Hauptweg des Abbaus über die Bildung Schiffscher Basen stattfindet. Ein weiterer Abbauweg über die Retro-Aldol-Reaktion / Aldolspaltung wird hier nachgewiesen. Ein alternativer EI-MS-Fragmentierungsweg zu dem bisher in der Literatur beschriebenen Mechanismus wird aufgrund neuer Befunde vorgeschlagen. Dieser hat Folgen für die Einbringung von 18O-Markierungen an der Epoxygruppe oder, falls erforderlich, an der Carbonylgruppe, auch für andere Moleküle mit ähnlichen Strukturmerkmalen.Fatty acids are fundamental building blocks of all organisms. They represent energy sources, structural elements or precursors for varying metabolic processes. Poly unsaturated fatty acids (linoleic acid, linolenic acid) are characterized by their high reactivity. The (degradation) products are in parts highly aroma active substances, with some of these substances being off-flavor compounds. They can be utilized by quantification methods as markers for aging of beer and other dietary products. Therefore they are called aging carbonyls. 4Z- and 4E-Epoxydecenal belong to that group of carbonyls. For 4E-Epoxydecenal extremely low odor thresholds of 15x10-4 ng/l air and 15 ng/l (0,015 ppb) in water; detected retronasally are reported. Both Epoxydecenal isomers are highly reactive. Because they react with oxygen from the atmosphere or other matrix compounds, an exact quanification is difficult. A solution is provided by using stable isotope dilution analysis (SIDA). In this work synthesis processes for both isomers are developed, making isotopic labeling possible. So far no synthesis description to gain the pure form and adequate yields of the 4Z-isomer can be found in literature. By using these isotope labeled standards the formation of 4-Epoxydecenal is shown to be strongly temperature dependent. Forced aging tests at 40 °C show a maximum of 0.09 ppb (4Z-) and 0.14 ppb (4E-Epoxydecenal) after 60 days of reaction time. At lower temperatures the reaction proceeds slower, as it is shown by a less steep curve progression. Furthermore the use of 13C-labeled linoleic acid and of an 18O2-atmosphere is described. Thereby it was shown that 4-Epoxydecenal is produced from linoleic acid under consumption of oxygen during storage of beer by oxidative processes. A focus was put on the reactivity of 4-Epoxydecenal with model nucleophiles. It is shown that the main route of degradation is via Schiff base formation. Another way of degradation is identified as a retro-aldol cleavage. Due to results of this work, an alternative EI-MS fragmentation mechanism, differing in the cleavage sites cited in literature, is proposed. This has consequences for introducing 18O-labels to the epoxy group or if needed to the carbonyl function for other molecules with similar structural characteristics, too
Kontinuierliches Maischen und Echtzeitqualitätskontrolle
No full textContinuous beer mash production and near-infrared (NIR) spectroscopy for the in-line quantification of free amino nitrogen (FAN) was investigated in this thesis. Mashing conducted in a continuous stirred tank reactor (CSTR) cascade can potentially enable a flexible adaption on substrate properties. In a CSTR, volume level variations affect the residence time and hence the reaction time. Additionally, an efficient real-time quality control system is needed to monitor changes of critical quality parameters in the mashing system. To gather a basic understanding of the continuous mashing process, a primary study aimed to investigate the mechanism of starch hydrolysis in the continuous ”β-amylase rest” was conducted. The result was a semi-empirical model that represents the extract formation in the mashing process. It was then shown, that based on a combination of this semi-empirical model and the residence time distribution (RTD) of a CSTR system, extract concentrations in a continuously conducted “β-amylase rest” can be predicted. This confirmed the relation between residence time and fermentable sugar (FS) formation. In a subsequent study, it was found that the mean residence time (tm) can replace RTD as a control parameter for the FS concentration in the “β-amylase rest”. Costly tracer experiments are necessary to obtain the RTD. The effort to obtain tm (quotient of volume and flow rate) is minor compared to the experimental effort needed for the RTD determination. Furthermore, the results of this investigation revealed that a setup with a single CSTR for the “β-amylase rest” allows a more sensitive FS concentration control compared to a setup with two CSTRs in a cascade. The entire mashing system consisting of further mashing steps such as “saccharification rest” was however only partially controllable by tm. Additionally, different temperature settings were found to be a further efficient FS control parameter in the continuous mashing process. A study in the field of real-time quality control revealed, that FAN can be predicted with NIR spectroscopy by using an in-line probe. In that regard, linear machine learning algorithms were proven to be suitable as a NIR data evaluation technique, that can be applied without elaborate data pre-processing steps. The relatively high water content in beer mash was found to be a complicating boundary condition concerning the quality of NIR spectra. However, it could be efficiently compensated by algorithms such as Ridge Regression or Bayes Ridge Regression. The results of this thesis support the future development of continuous mashing systems that depend on real-time quality control systems.In dieser Dissertation wurde die kontinuierliche Biermaischherstellung und die Verwendung der Nahinfrarot-(NIR)-Spektroskopie zur inline-Quantifizierung von freiem Aminostickstoff (FAN) untersucht. Das Maischen in einem kontinuierlich gerührten Tankreaktor (CSTR) realisiert als CSTR-Kaskade ermöglicht eine flexible Anpassung an die Substrateigenschaften. In einem CSTR beeinflussen Volumenvariationen die Verweilzeit und somit auch die Reaktionszeit. Außerdem ist ein effizientes Echtzeit-Qualitätskontrollsystem erforderlich, um Änderungen kritischer Qualitätsparameter im Maischsystem zu überwachen. Um ein grundlegendes Verständnis des kontinuierlichen Maischprozesses zu erlangen, wurde eine primäre Studie durchgeführt, die darauf abzielte, den Mechanismus der Stärkehydrolyse im kontinuierlichen "β-Amylaserast" zu untersuchen. Das Ergebnis war ein halbempirisches Modell, das die Extraktbildung im Maischprozess darstellt. Es wurde gezeigt, dass auf der Grundlage einer Kombination aus diesem halbempirischen Modell und der Verweilzeitverteilung (RTD) eines CSTR-Systems die Extraktkonzentrationen in einer kontinuierlich durchgeführten "β-Amylaserast" vorhergesagt werden kann. Dies bestätigt den Zusammenhang zwischen Verweilzeit und der Bildung von fermentierbarem Zucker (FS). In einer anschließenden Studie wurde festgestellt, dass die mittlere Verweilzeit (tm) die RTD als Steuerungsparameter für die FS-Konzentration in der "β-Amylaserast" ersetzen kann. Aufwendige Tracer-Experimente sind notwendig, um die RTD zu bestimmen. Der Aufwand zur Bestimmung von tm (Quotient aus Volumen und Durchflussrate) ist im Vergleich zum experimentellen Aufwand für die RTD-Bestimmung gering. Darüber hinaus ergaben die Untersuchungsergebnisse, dass ein einzelner "β-Amylaserast" CSTR im Vergleich zu einer CSTR-Kaskade eine sensiblere FS-Konzentrationssteuerung ermöglicht. Das gesamte Maischsystem, das weitere Maischschritte wie den "Saccharifikationsrast" umfasst, ist jedoch nur teilweise durch tm steuerbar. Unterschiedliche Temperatureinstellungen wurden als weiterer effizienter FS-Steuerungsparameter im kontinuierlichen Maischprozess identifiziert. Eine Studie im Bereich der Echtzeit-Qualitätskontrolle zeigte, dass FAN mit NIR-Spektroskopie durch Verwendung einer Inline-Sonde vorhergesagt werden kann. In diesem Zusammenhang erwiesen sich lineare maschinelle Lernalgorithmen als geeignete NIR-Datenauswertetechniken, die ohne aufwendige Datenverarbeitungsschritte angewendet werden können. Der relativ hohe Wassergehalt in Biermaisch erwies sich als erschwerende Randbedingung in Bezug auf die Qualität der NIR-Spektren. Der störende Einfluss des Wassers konnte jedoch effizient durch Algorithmen wie Ridge Regression oder Bayes Ridge Regression kompensiert werden. Die Ergebnisse dieser Dissertation tragen zur Weiterentwicklung von kontinuierlichen Maischsystemen bei, die auf einer Echtzeitqualitätskontrolle basieren.BMBF, 3FH3I01IA, smartFoodTechnologyOW
Nahinfrarotspektroskopie als Inline-Analytiktool zur Optimierung des Pasteurisationsprozesses flüssiger Lebensmittel
No full textThe process of thermal preservation of liquid foods is a safety-relevant process step in the processing of products such as fruit juices and is associated with a high-energy expenditure and safety margin. There are already various approaches to improve this conventionally managed process step in terms of product and resource preservation. Compared to these novel technologies, the use of real-time process analytics offers great potential to improve already existing process plants by implementing inline capable process analytical tools. This allows direct control of the reactions taking place and changes during the running process. Instead of post process, random product control, quality control during the process can be made rendered. The chemical and pharmaceutical industry serves as a reference industry for the use of process analytical tools, although the reactions and product matrices are less complex. In the food industry, on the other hand, there is a greater variation in raw materials and intermediate products. In addition, a large number of reactions can take place in parallel within a process, and the physical states and properties of the individual components can vary. A uniform set of rules for the use of process analytical tools does not exist here. Each product, each process provides its own research potential, so that a large research gap opens up in the area of the food industry.
In order to contribute to closing this gap, this thesis presents a novel approach to improve the process of pasteurization of liquid food. For fruit juices as an application, near infrared spectroscopy in combination with chemometric methods was applied to make the process more product specific. Based on known weaknesses of the process, the relevant aspects for a product-specific treatment were identified. In the further course, the suitability of near infrared spectroscopy as a process analytical tool in the process of pasteurization was verified. Moreover, it was investigated whether a sufficiently accurate identification of the product type as well as the microbiologically relevant properties can be achieved by the application of chemometric methods. In the course of this, the suitability of the measurement methodology was confirmed and solutions were established for any process influences. The product classification and description of the microbiologically relevant parameters extract content and pH value were also implemented with sufficient accuracy. Knowing the destruction kinetics of relevant microorganisms, the product-specific determination of target values for the necessary lethal heat input could be realized. In addition, an analysis of the actual values was carried out on the basis of a chemometric regression method by inferring the microbiological pasteurization effect through the chemical reaction of acid hydrolytic sucrose degradation by means of the indirect approach. This required knowledge of the chemical reaction kinetics and mahematical modeling of the degradation behavior. The novel approach could be confirmed by calculations using results from off-line analysis, whereas the use of near infrared spectroscopy as an inline method still revealed potential for optimization with respect to measurement accuracies.
In summary, the results of this work provide a promising opportunity to make conventional processes for the preservation of liquid foods more product-specific by using near-infrared spectroscopy as an inline-capable and multimodal sensor technique, leading to an increase in process efficiency and product quality.Der Prozess der thermischen Haltbarmachung von flüssigen Lebensmitteln ist ein sicherheitsrelevanter Prozessschritt in der Verarbeitung von Produkten wie Fruchtsäften und ist mit einem hohen energetischen Aufwand und Sicherheitszuschlag verbunden. Um diesen konventionell geführten Prozessschritt hinsichtlich Produkt- und Ressourcenschonung zu optimieren, gibt es bereits verschiedene Ansätze. Im Vergleich zu neuartigen Technologien bietet der Einsatz von Echtzeit-Prozessanalytik großes Potential bereits bestehende Prozessanlagen durch die Implementierung inlinefähiger Prozessanalysetools zu verbessern. Dies ermöglicht eine Kontrolle ablaufender Reaktionen im laufenden Prozess. Anstelle nachgelagerter, stichprobenartiger Produktkontrolle kann eine Qualitätslenkung im Prozess erfolgen. Vorbildindustrie bezüglich des Einsatzes von Prozessanalysetools ist die pharmazeutische Industrie, wo Reaktionen und Produktmatrices allerdings weniger komplex sind. In der Lebensmittelindustrie gibt es eine größere Schwankungsbreite der Rohstoffe und Zwischenprodukte. Zudem können innerhalb eines Prozesses eine Vielzahl an Reaktionen parallel ablaufen und die Zustandsformen und Eigenschaften der einzelnen Komponenten variieren. Ein einheitliches Regelwerk zum Einsatz der Prozessanalysetools existiert nicht. Jedes Produkt, jeder Prozess liefert eigenes Forschungspotential, sodass sich im Bereich der Lebensmittelindustrie eine große Forschungslücke auftut.
Um einen Beitrag zur Schließung dieser Lücke zu leisten, zeigt diese Arbeit einen neuartigen Lösungsansatz auf, um den Prozess der Pasteurisation flüssiger Lebensmittel zu verbessern. Am Anwendungsfall von Fruchtsäften wurde der Einsatz von Nahinfrarotspektroskopie in Kombination mit chemometrischen Methoden genutzt, um den Prozess produktspezifischer zu gestalten. Ausgehend von bekannten Schwachstellen des Prozesses wurden die relevanten Aspekte identifiziert, deren Kenntnis für eine produktspezifische Behandlung relevant sind. Angefangen mit der Überprüfung der Eignung von Nahinfrarotspektroskopie als Prozessanalysetool im Prozess der Pasteurisation, wurde untersucht, ob eine Identifikation des Produkttyps sowie der mikrobiologisch relevanten Eigenschaften durch die Anwendung chemometrischer Methoden erfolgen kann. In diesem Zuge konnte eine Eignung der Messmethodik bestätigt werden und für etwaige Prozesseinflüsse Lösungsansätze etabliert werden. Auch die Produktklassifizierung und Beschreibung der mikrobiologisch relevanten Parameter Extraktgehalt und pH-Wert wurden hinreichend genau umgesetzt. Unter Kenntnis der Abtötungskinetiken entsprechend relevanter Mikroorganismen konnte die produktspezifische Ermittlung für Sollwerte des notwendigen letalen Hitzeeintrags realisiert werden. Im Weiteren wurde eine Analyse der Ist-Werte auf Basis einer chemometrischen Regressionsmethode durchgeführt, indem mittels des indirekten Ansatzes über die chemische Reaktion der säurehydrolytischen Saccharosedegradation auf den mikrobiologischen Pasteurisationseffekt geschlossen wurde. Dazu war die Kenntnis der chemischen Reaktionskinetik notwendig und die mathematische Modellierung des Abbauverhaltens. Der neuartige Ansatz konnte mittels Berechnungen unter Verwendung von Ergebnissen der Offline-Analytik bestätigt werden. Der Einsatz von Nahinfrarotspektroskopie als Inline- Methode hingegen offenbarte Optimierungspotenzial hinsichtlich der Messgenauigkeiten.
Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Arbeit eine vielversprechende Möglichkeit herkömmliche Prozesse zur Haltbarmachung von flüssigen Lebensmitteln durch den Einsatz von Nahinfrarotspektroskopie als inlinefähige, multimodale Sensortechnik produktspezifischer zu gestalten, was zur Steigerung der Prozesseffizienz und Produktqualität führt.BMBF, 13FH024IX6, IngenieurNachwuchs 2016: Cyber-Physisches System (CPS) zur thermischen Entkeimung von Getränken unter Nutzung der NIR-Sensorik als Schlüsseltechnologi
Identifikation neuartiger bakterieller Antigene und Charakterisierung der linearen Epitope
No full textIm Zuge der stets wachsenden Zahl an multiresistenten bakteriellen Pathogenen weltweit bleibt die Suche nach einer zuverlässigen Schnelldiagnostik eine der Hauptaufgaben der klinischen Forschung. Obwohl bereits unterschiedlichste Nachweisverfahren im Umlauf sind, so erscheint ein Schnelltest, welcher die Existenz von artspezifischen Oberflächenantigenen ausnutzt, als eine geeignete Herangehensweise. Leider ist die Kenntnis über das vielschichtige und teils hoch komplexe Repertoire an potentiellen Antigenen aus Bakterien recht begrenzt. Vor diesem Hintergrund sollte eine Methode entwickelt werden, die es ermöglicht, schnell und zuverlässig, neue bisher unbekannte bakterielle Antigene von relevanten humanpathogenen Keimen zu identifizieren. Dazu wurden vier der am häufigsten vorkommenden Erreger verwendet: Campylobacter jejuni, Salmonella enterica, Extended-spectrum-beta-lactamasen (ESBL) Klebsiella pneumoniae und Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA). Zu diesem Zweck sollten aus diesen Bakterien cDNA Bibliotheken generiert und anschließend über immunologische Screenings, schnell und zuverlässig neuartige Antigene aufgedeckt werden. Da die Herstellung von cDNA Bibliotheken aus Bakterien eher selten ist, mussten bestehende Methoden für eukaryontische Zellen abgewandelt, neu entwickelt und adaptiert werden, um den besonderen Anforderungen bakterieller RNA gerecht zu werden. Dabei ist vor allem die Isolierung geringer Mengen bakterieller mRNA aus Gesamt-RNA, welche hauptsächlich aus rRNA gebildet wird, eine der zentralen Herausforderungen. Darüber hinaus besteht die Problematik darin, dass im anschließenden Screening auf Antigene mit polyklonalen Seren oder Antikörpern hauptsächlich kreuzreaktive Signale auftreten, die eine eindeutige Identifikation erschweren. Um dem Einhalt zu gebieten, wurde eine neue Methode entwickelt, die auf Microarrays basiert und einen speziellen Protein-Tag, den HaloTag®. Dieser Tag weist einzigartige Eigenschaften auf und ermöglicht auf Grund seiner irreversiblen, kovalenten Bindung, die hoch spezifisch und selektiv erfolgt, eine direkte Immobilisierung der Zielproteine aus Zelllysaten auf der Oberfläche des Microarrays, ohne eine vorherige Proteinaufreinigung durchführen zu müssen. Das stellt eine signifikante Weiterentwicklung und Verbesserung bestehender Methoden dar, die durch die notwendige Proteinaufreinigung von tausenden Proben zeit- und kostenintensiv sind. Somit wurden Screenings durchgeführt und für alle vier Bakterienarten konnten neue zuvor unbeschriebene Proteine mit immunogenem Verhalten identifiziert werden. Anschließend wurden diese neuen Proteine analysiert und eine Auswahl der vielversprechendsten Kandidaten mittels Epitopkartierung und Alaninaustausch auf das Vorhandensein linearer Epitope untersucht. Durch Analyse der Spezifität der gefundenen Epitope konnten solche isoliert werden, die spezifisch für das jeweilige Bakterium waren. Die experimentellen Daten wurden durch bioinformatische Anwendungen komplettiert. Dadurch war es möglich, die Spezifität der Epitope zu bestätigen sowie die Zugänglichkeit und Anwendbarkeit der identifizierten Epitope zu verifizieren. Durch diesen dualen Ansatz ist die vorgestellte Methode gut geeignet schnell und zuverlässig neue bakterielle Antigene zu identifizieren und zu charakterisieren. Diese geben die Möglichkeit unterschiedlicher Anwendungen. Dazu gehört zum Einen die Entwicklung monoklonaler Antikörper gegen die identifizierten Epitope, welche in einem diagnostischen Testsystem Anwendung finden könnten. Zum Anderen, sind lineare Epitope für die Impfstoffherstellung geeignet. Hinzu kommt, dass zuvor unbeschriebene Proteine, deren Funktion und Struktur teilweise unbekannt ist, die sich aber oftmals an der Bakterienmembran befinden, u.U. neue Virulenzfaktoren darstellen, die bislang nicht aufgeklärt werden konnten. Ein tieferer Einblick in die Funktionsweise von Virulenzfaktoren kann dazu beitragen die Pathogenität und Virulenz dieser Bakterien besser zu verstehen. Abschließend bleibt zu vermerken, dass diese Methode leicht auf andere bakterielle Erreger übertragen werden kann, wie hier anhand von vier relevanten Keimen gezeigt wurde. Somit liefert diese Technik ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug für die Enthüllung neuer Antigene.In the wake of continuous spreading of multiple-resistant bacteria causing harm to individuals across the globe, the search for rapid and reliable point-of-care diagnostics remains a dire need. Although different approaches exist, a fast assay relying on the presence of species-specific antigens seems plausible. Still, the knowledge of bacteria's vast spectra of potential antigens is scarce, as only a select few structures have been revealed. In this context, a method was devised to illuminate novel immunogenic proteins of pathogens. As relevant pathogens Campylobacter jejuni, Salmonella enterica, Extended-spectrum-beta-lactamase (ESBL) Klebsiella pneumoniae and Methicillin-resistant Staphylococcus aureus were used, comprising four of the major bacteria causing millions of infections worldwide annually. To achieve this, cDNA libraries were generated. The construction of cDNA libraries has hardly been done with bacterial transcriptomes, thus existing methods had to be revamped, optimized and adapted to suit the unique characteristics of prokaryotic RNA. Predominantly, the isolation of minute amounts of mRNA within a total RNA bristling with rRNA was a major challenge. Furthermore, after successful library construction, one main issue with immunoscreening of bacterial expression libraries is the paramount cross-reactivity when using polyclonal antibodies. Thus, a novel screening approach was constructed using microarrays and a specific protein tag, HaloTag®. This tag features irreversible, covalent, highly specific and selective binding allowing to directly immobilize the proteins of interest on the microarray surface without the need of prior purification. This is a significant upgrade over previously used methods, as protein purification of hundreds and thousands of samples in parallel is labor-intensive and costly. Consequently, immunoscreenings were performed on different libraries comprising the four pathogens mentioned and several proteins were revealed which had not been shown to be immunogenic before. Further analyses and characterization led to a small subset of proteins deemed most likely to be specific. In turn, linear epitope mapping and subsequent alanine scan helped to illuminate linear epitopes within these proteins. While not all proved to be specific, a number of linear epitopes showed both specificity in the experimental stage as well as in bioinformatic assessment through alignments. Moreover, the accessibility and suitability of the identified epitopes was examined by several well established bioinformatic tools and algorithms. Hence, this dual approach quickly delivers hard experimental facts with the strong support of software prediction. Therefore, the present work is effective in quickly revealing novel bacterial antigens that can be used for a number of future applications. First, generation of monoclonal antibodies to the revealed targets and subsequent utilization of these within a point-of-care tool is worth pursuing. Secondly, specific linear epitopes might be well suitable for vaccine development. Finally, revelation of previously unknown and uncharacterized proteins showing a strong immunogenicity and association with the outer membrane might unveil novel virulence-factors to gain insight into the bacteria's pathogenicity and virulence. Last but not least, this technique is readily transferred to other bacterial pathogens of relevance as the investigation using four different kinds has shown. Thanks to a quick turn-around time, identification of novel antigens starting from a pathogen of interest can be achieved in a few weeks. Conclusively, this provides researchers with an easy-to-handle and reliable tool in antigen illumination
Starterkulturen und Autoinduktion
No full textOne of the prime objectives of any bioprocess development is to enhance the microbial growth and product yields. Correspondingly, for recombinant proteins it is the aim increase the yields of the soluble, active and correctly folded molecule. There are many factors that could influence the product yield like medium optimization and the performance of the bioprocess itself. The aim of this study is; (i) to investigate the enzymatic glucose feeding system as a pre-cultivation system for recombinant E. coli, (ii) To proof the scalability of this system as a main cultivation system for the production of a recombinant nucleoside phosphorylase, (iii) The application of autoinduction jointly with the enzyme based fed-batch technique with different induction protocols and (iv) to investigate the cell physiology upon exposure to a multi-substrate system during the diauxic growth.
Regarding the first point, robust pre-cultures of recombinant E. coli strains were obtained by fed-batch cultivations using the enzymatic glucose feeding system. According to the time plan of the expression experiment or bioreactor cultivation, potent short term (6-8 hours) or overnight pre-cultures were performed. Preparation of the pre-culture as a fed-batch process provides a well-controlled starter culture in a growing state instead of commonly applied overnight stationary phase cultures.
A scalability study for the enzymatic glucose feeding system (Enpresso B growth system) was performed with the optimized conditions using a nucleoside phosphorylase (NP) as a model protein. The results showed a more than three-fold increase in the protein activity and a 30% increase of the cell density from the well plate scale to the shake flask level. While about 25% increase was obtained by application of this system in the benchtop-bioreactor scale.
The effect of the IPTG on the expression of recombinant nucleoside phosphorylases was observed in autoinduced and single shot induced cultures. IPTG-autoinduced Enpresso cultures reached nearly the same nucleoside phosphorylase activity (≈ 3.0 - 3.5 U mL-1) as obtained by single shot induced cultures in 15 hours shorter cultivations. However, the cell density in cultures with autoinduction was less than half of that of single shot induced cultures. Optimal concentrations for autoinduction were 70-100 μM IPTG or 2.0 g L-1 lactose, respectively.
Autoinduction is based on the de-repression of the lac promoter in glucose deficient conditions under diauxic regulation. A clear diauxic lag phase after the end of the batch phase (time of glucose consumption) was observed in E. coli diauxic growth. The length of this lag phase was around 30 minutes. By applying the diauxie cultivation at the benchtop-bioreactor scale, more than one lag phase was observed upon consumption of different substrates. Eventually, three phases seem to be relevant, related to the consumption of different substrates: (i) batch on glucose, (ii) consumption of lactose and metabolism of the glucose part, and finally (iii) consumption of the galactose part. Additionally, acetate as the metabolic byproduct was consumed as a fourth substrate (i) in the diauxic lag phase and (ii) at the end of the cultivation.Die Erhöhung des mikrobiellen Wachstums und des Produktionsertrages gehören zu den wichtigsten Zielen jeder Bioprozessentwicklung. Entsprechend ist es für rekombinante Proteine das Ziel, die Ausbeuten des löslichen, aktiven und korrekt gefalteten Moleküls zu erhöhen. Es gibt viele Faktoren, die den Produktionsertrag beeinflussen können, wie die Optimierung von Medien und die Leistung des Bioprozesses. Die Ziele dieser Studie sind folgendermaßen zusammenzufassen: (i) Erforschung des enzymatischen Glukose-Zufütterungssystems als ein Vorkultivierungs-System für rekombinaten E. coli, (ii) Nachweis der Skalierbarkeit dieses Systems als Hauptkultivierungs-System für die Herstellung einer rekombinanten Nukleosidphosphorylase, (iii) Die Anwendung der Autoinduktion gemeinsam mit der Enzym-basierten Fed-Batch Technik mit verschiedenen Induktionsprotokollen und (iv) Erforschung der Zellphysiologie nach Exposition gegenüber einem Multi-Substrat-System während des diauxischen Wachstums.
Das erste Ziel betreffend, wurden robuste Vorkulturen eines rekombinanten E. coli Stammes in Fed-Batch Kultivierungen unter Verwendung des Glukose-Freisetzungssystems generiert. Je nach Zeitpunkt des Expressionsexperiments oder Bioreaktor-kultivierung, potente Kurzzeit- (6-8 Stunden) oder Über Nacht-Vorkulturen durchgeführt wurden. Die Vorbereitung der Vorkultur als Fed-Batch-Prozess bietet eine gut kontrollierte Starterkultur in einem wachsenden Zustand anstelle von üblicherweise angewandten über Nacht stationären Phasenkulturen.
Eine Skalierbarkeitsstudie für das enzymatischen Glukose-Zufütterungssystems (Enpresso B Wachstums-System) wurde unter optimierten Bedingungen Verwendung der Nukleosidphosphorylase (NP) als Modellprotein durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eine mehr als dreifache Anstieg der Proteinaktivität beziehungsweise eine 30% Zelldichte vom Well-Platten-Maßstab bis zum Schüttelkolben-Maßstab. Während die Anwendung dieses Systems in dem Auftisch-Bioreaktor-Maßstab einen Anstieg von etwa 25% erreichte.
Die Wirkung des IPTG auf die Expression rekombinanter Nukleosidphosphorylasen in Autoinduktions- und Single-Shot-induzierten Kulturen beobachtet wurde. IPTG-autoinduzierte Enpresso Kulturen fast dieselbe Nukleosidphosphorylase-Aktivität (etwa 3,0 - 3,5 U mL-1) erreichten, wie die durch Single-Shot-induzierten Kulturen, die eine 15 Stunden kürzere Kultivierungszeit aufwiesen. Jedoch war die Zelldichte, die durch Autoinduktion erreicht wurde, weniger als die Hälfte von Single-Shot-induzierten Kulturen. Optimale Konzentrationen für die Autoinduktion waren jeweils 70-100 μM IPTG bzw. 2,0 g L-1 Lactose.
Die Autoinduktion basiert auf der De-Repression des lac-Promotors in glukose-defizienten Zustände unter diauxischer Regulation. Eine deutliche diauxischer Lag-Phase nach dem Ende der Batch-Phase (Zeit des Glukoseverbrauchs) wurde bei einem diauxische Wachstum von E. coli beobachtet. Diese Zeitdauer dieser Lag-Phase betrug etwa 30 Minuten. Durch Anwendung der Diauxie-Kultivierung in dem Bioreaktor-Maßstab wurde mehr als eine Lag-Phase beim Verbrauch unterschiedlicher Substrate beobachtet. Schließlich waren drei Phasen scheinen relevant zu sein, bezogen auf den Verbrauch verschiedener Substrate: (i) Batch-Phase auf Glukose, (ii) Verbrauch von Laktose und Metabolismus des Glukose-Teils und schließlich (iii) Verbrauch des Galactose-Teils. Zusätzlich wurde Acetat, ein metabolisches Nebenprodukt, als viertes Substrat (i) in der diauxischen Lag-Phase und (ii) am Ende der Kultivierung verbraucht
Chemical synthesis of isotopically labeled standards for analysis of unwanted substances (NIAS) from food contact materials
No full textEins der Hauptziele dieser Arbeit ist die Synthese von neuen Referenzsubstanzen für nicht absichtlich hinzugefügte Substanzen (NIAS) aus Polymeren, die in Lebensmittelkontaktmaterialien Einsatz finden, dem Epoxidharz und dem Polyamid-6. Durch Einsatz von Schutzgruppenstrategien konnten vier neue oligomere Referenzsubstanzen von Bisphenol A (BPA) erfolgreich synthetisiert werden: BADGE∙BPA, BADGE∙2BPA, BADGE∙BPA∙H2O und BADGE∙BPA∙HCl. Die Versuche zur Synthese von Cyclo-di-BADGE, des cyclischen Dimers von Bisphenol A, waren aufgrund der eintretenden Polymerisationsreaktion nicht erfolgreich. Bezüglich der Synthese von isotopenmarkierten Referenzmaterialien von Bisphenol A-Oligomeren konnte in allen BADGEˑBPA-Derivaten mindestens eine einfache Isotopenmarkierung eingebracht werden. Die Einführung einer d4-Markierung in dem Monomer des Polyamids-6, dem ɛ-Caprolactam, gelang in einer H/D-Austauschreaktion von einer Vorstufe in schwerem Wasser. Mittels Standardtechniken der Peptidchemie konnten zunächst aus dem nichtmarkierten ɛ-Caprolactam die linearen Di- und Tri-6-Aminohexansäuren sowie aus der d4-markierten Verbindung die zugehörigen isotopenmarkierten Standards hergestellt werden. Die Identität aller Syntheseprodukte konnte mittels 1H-, 2H-, 13C- und 2D-Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Gaschromatographie- (GC-) oder Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) bestätigt werden. Weiterhin wurden beide, die isotopenmarkierten und die nicht markierten Substanzen, vor dem Einsatz in der Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA) als Referenzmaterialien auf Reinheit mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit UV-Detektion getestet.
Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand in dem Einsatz der synthetisierten Referenzsubstanzen und deren Isotopologen in der Spurenanalytik von NIAS in Lebensmitteln. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei LC-MS/MS-Methoden entwickelt, eine für hydrophile und eine für lipophile Matrices. Die erste Methode wurde speziell für das Bier als Matrix entwickelt. Die Methode umfasste vier höhermolekulare BADGEˑBPA-Derivate sowie Cyclo-di-BADGE, wovon vier eine Quantifizierung zuließen. Von den zwanzig untersuchten Pilsner-Bieren konnten in zwei Proben positive Befunde von Cyclo-di-BADGE nah der Bestimmungsgrenze festgestellt werden, in zehn Fällen lag der Gehalt an Cyclo-di-BADGE unter der Bestimmungsgrenze. Bei keiner der untersuchten Proben wurde der Grenzwert für Cyclo-di-BADGE überschritten. Die zweite Methode wurde für lipophile Matrices validiert und konnte erfolgreich in der Routineanalytik eingesetzt werden. In diese Methode wurden relevante niedermolekulare BADGE- sowie BPA-Derivate aufgenommen, um den Informationsgehalt über die zu untersuchenden Lebensmittel zu erhöhen. Die Matrixkalibrierung wurde in Pflanzenöl als Simulanz für fettreiche Lebensmittel durchgeführt. Damit konnte die Eignung der Methode für die Analytik von NIAS in Lebensmitteln, die in ölhaltigen Medien haltbargemacht werden, wie z.B. Früchte, Gemüse, Fisch und Fleisch, bestätigt werden. In die Methode konnten insgesamt 23 Analyten aufgenommen werden: die Bisphenole A, B, BP, E, FL, G, M, TMC und Z; BADGE und seine Reaktionsprodukte mit Wasser und Chlorwasserstoff: BADGE∙2H2O, BADGE∙HCl∙H2O, BADGE∙HCl, BADGE∙2HCl; BFDGE und seine Reaktionsprodukte mit Wasser und Chlorwasserstoff: BFDGE∙2H2O und BFDGE∙2HCl; 3-Ring NOGE sowie die höhermolekularen Oligomere. Insgesamt wurden 25 fetthaltige Lebensmittel analysiert, davon konnten in 16 Proben positive Befunde von mindestens einem der untersuchten BADGE- oder BPA-Derivat nachgewiesen werden. In den untersuchten Lebensmittelproben wurden kleine Mengen von Bisphenol A, BADGE, BADGE∙2H2O, BADGE∙HCl∙H2O, Cyclo-di-BADGE und hohe Mengen an Bisphenol G gefunden. Die Lebensmittelproben enthielten auch BADGE∙HCl, BADGE∙2HCl, BFDGE, BADGE∙BPA, BADGE∙2BPA, BADGE∙BPA∙H2O und BADGE∙BPA∙HCl, die Befunde lagen jedoch unter der Bestimmungsgrenze. Da das Bisphenol G nicht toxikologisch bewertet ist, kann seine Konzentration in einem Lebensmittel oder einer Lebensmittelsimulanz einen Wert von 10 µg/kg nicht übersteigen.[1] Jeder der vier positiven Befunde von Bisphenol G lag über dem Migrationsgrenzwert.
Eine Methode zum Nachweis von NIAS aus Polyamid-6 in Lebensmitteln, die die synthetisierten Verbindungen wie ɛ-Caprolactam-d4 und die Oligomere der 6-Aminohexansäuren sowie die zugehörigen isotopenmarkierten Standards enthält, befindet sich in einer frühen Entwicklungsphase und bleibt ein Ziel zukünftiger Arbeiten.One of the main goals of this work was the synthesis of new reference materials for non-intentionally added substances (NIAS) from polymers which are used in food contact materials, the epoxy resin and polyamide-6. The application of protecting group strategy allowed synthesis of four new oligomer reference materials of bisphenol A (BPA): BADGE∙BPA, BADGE∙2BPA, BADGE∙BPA∙H2O and BADGE∙BPA∙HCl. The attempts to synthesize the cyclic dimer of bisphenol A, the cyclo-di-BADGE were not successful because of the polymerization reaction that occurred. Regarding the synthesis of isotopically labeled reference materials of bisphenol A based oligomers at least one single isotope label could be introduced in all BADGEˑBPA-derivatives. The introduction of a d4-isotopic label in the polyamide-6 monomer, ɛ-caprolactam, succeeded in a H/D exchange reaction of a precursor with heavy water. With the standard methods of peptide chemistry, it was possible to initially synthesize the di- and tri-6-aminohexanoic acids from ɛ-caprolactam and then the corresponding isotopically labeled standards from the d4-labeled compound. The identity of the synthesis products could be confirmed with 1H, 2H, 13C and 2D nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and gas chromatography (GC-) or electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Furthermore, the purity of both the isotopically labeled and not labeled compounds were proven by high performance liquid chromatography (HPLC) using a UV detector before the use of the standards in the stable isotope dilution analysis (SIDA) as reference materials.
A further goal of this work was the application of the synthesized reference materials and their isotopologues in the trace analysis of NIAS in food. Within the framework of this study, two LC-MS/MS methods have been developed, one for the hydrophilic and one for the lipophilic matrices. The first method was specially developed for beer as a matrix. The method involved four higher molecular BADGEˑBPA derivatives as well as the cyclo-di-BADGE, of which four could be quantified. Of the twenty investigated Pilsner beers, two contained cyclo-di-BADGE at a concentration level near the limit of quantification, in ten cases the findings were below the limit of quantification. In no case was the migration limit for cyclo-di-BADGE exceeded. The second method was validated for lipophilic matrices and could be successfully used in routine analyses. To increase the information content about the investigated food sample, some relevant low-molecular BADGE as well as bisphenol A derivatives were included in this method. The matrix calibration was performed for vegetable oil, which is a simulant for fatty foods. Therefore, the suitability of the method for the analysis of NIAS in foods which are preserved in oil medium like fruits, vegetables, fish and meat could be confirmed. In this method 23 analytes overall could be included: the biphenols (A, B, BP, E, FL, G, M, TMC and Z), BADGE and its reaction products with water and hydrogen chloride (BADGE∙2H2O, BADGE∙HCl∙H2O, BADGE∙HCl, BADGE∙2HCl), BFDGE and its reaction products with water and hydrogen chloride (BFDGE∙2H2O and BFDGE∙2HCl), 3-Ring NOGE as well as higher molecular oligomers. In total, 25 fatty foods have been analyzed. Positive findings of at least one of the investigated BADGE or bisphenol A derivatives were detected in 16 samples. The investigated food samples contained bisphenol A, BADGE, BADGE∙2H2O, BADGE∙HCl∙H2O and cyclo-di-BADGE in small quantities and bisphenol G at concentrations between 11.5 and 451 µg/kg. The samples also contained BADGE∙HCl, BADGE∙2HCl, BFDGE, BADGE∙BPA, BADGE∙2BPA, BADGE∙BPA∙H2O and BADGE∙BPA∙HCl, but the findings were below the limit of quantification. Since Bisphenol G is toxically not regulated, its concentration is not allowed to exceed 10 µg/kg food or food simulant.[1] Therefore, the migration limits were exceeded in all four food samples.
A method for the quantification of NIAS from polyamide-6 in food, which would contain the synthesized compounds like ɛ-caprolactam-d4 and the oligomers of 6-aminohexanoic acids as well as the corresponding isotopically labeled standards is in an early stage of development and ramains a goal for future works
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
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