6,953 research outputs found
La via del vizio
No full textPrima traduzione italiana del romanzo "The Primrose Path" di Bram Stoker, corredata di introduzione e note di Elisa Bolchi e di una postfazione di Giorgio Leonard
Riunioni, associazioni e partiti politici nel pensiero di giorgio arcoleo
No full textIl saggio costituisce una riflessione critica sul costituzionalismo di Giorgio Arcoleo, a partire dagli scritti dell'autore su riunioni, associazioni e partiti politiciThe essay is a critical analysis of Giorgio Arcoleo's constitutionalism, starting with the author's writings on freedom of assembly and association and on political parties
Conclusioni
No full textSi traggono le conclusioni dell'analisi SROI di Avis, sia con riferimento alle lezioni manageriali apprese che al contributo generato per la letteratura di riferimento
Elisa Marroni, I culti dell’Esquilino. Rome, Giorgio Bretschneider, 2010
No full textVan haeperen Françoise. Elisa Marroni, I culti dell’Esquilino. Rome, Giorgio Bretschneider, 2010. In: L'antiquité classique, Tome 81, 2012. pp. 340-342
Genetic variations in the MeCP2 3'UTR and in the ARX gene influence the pathogenesis of neurodevelopmental disorders
No full textNeurodevelopmental disorders are a large group of common and complex disorders seen in paediatric, child-neurological and clinical genetic practice. They include a wide set of clinically diverse and genetically heterogeneous disorders of varying severity. Even when the clinical and behavioural phenotypes of these disorders are known, the complete mechanisms of these pathologies are still not completely elucidated. The MECP2 and
ARX genes are two fundamental genes for a proper evelopment of the brain, pathogenic sequence variations in these genes are known to be responsible respectively of Rett syndrome (RTT) and early epileptic encephalopathies (EIEE).
Pathogenic variations in the MECP2 coding region are responsible for 90-95% of classical RTT and for the 40-60% of atypical RTT. The effect and the impact of sequence variations in the very long 3'UTR MECP2 non-coding region in RTT are still not known. This project investigated the possible role of the MECP2 3'UTR in the pathogenesis of RTT through the analysis of the expression levels of MECP2 isoforms, the sequencing of the MECP2 3'UTR, in silico analysis and in vitro functional analysis of 3'UTR sequence alterations. Our results showed altered expression levels of both isoforms among a cohort of 22 RTT patients, without sequence variations in the MECP2 coding region. Two SNPs, one known and one unreported sequence variations were identified as a consequence of screening of the proximal part of the MECP2 3'UTR. The functional analysis of a few variations in the 3'UTR showed that luciferase reporter protein expression levels were increased in neuronal and in non-neuronal cell lines. Pathogenic variations in the ARX gene are responsible of a broad spectrum of neurodevelopmental disorders with and without malformations. Initially only expansions of the polyalanine tracts in this gene were associated with Ohtahara syndrome. As a result of the ARX gene analysis, two previously unreported pathogenic point mutations, in a
well-conserved domain, were detected in three boys with Ohtahara syndrome futher confirming the pathogenic role of this gene. The complexity of the etiopathogenesis of the neurodevelopmental disorders remains to be further elucidated and other studies will be necessary to expand our understanding of these disorders to provide accurate diagnosis and genetic counselling for the patientsI disordini del neurosviluppo sono un gruppo di patologie viste nella pratica pediatrica, neurologica e genetica. Includono disordini eterogenei dal punto di vista clinico e genetico. Anche se il fenotipo clinico è noto, i meccanismi molecolari alla base di queste patologie non sono del tutto noti. MECP2 e ARX sono due geni fondamentali per il corretto sviluppo del cervello; variazioni di sequenza in questi geni sono responsabili rispettivamente della sindrome di Rett (RTT) e dell’ encefalopatia epilettica precoce (EIEE).
Variazioni nella regione codificante di MECP2 sono responsabili del 90-95% dei casi di RTT classica e del 40-60% in quelli di RTT atipica. L’effetto di variazioni di sequenza nel lungo 3’UTR di MECP2 sull’eziologia della RTT non è noto.
Questo progetto studia il possibile ruolo del 3’UTR di MECP2 attraverso l’analisi dell’ espressione delle due isoforme del gene, lo screening mutazionale del 3’UTR, predizioni in silico e studi funzionali utilizzando vettori con alterazioni di sequenza nel 3’UTR. I nostri risultati dimostrano che 22 pazienti RTT, negative all’indagine molecolare della porzione codificante del gene, hanno livelli di espressione variabili delle due isoforme. Lo screening della porzione prossimale del 3’UTR ha portato all’identificazione di due SNPs e due variazioni di cui una non nota in letteratura. Lo studio funzionale dimostra che variazioni di sequenza in questa regione non trascritta portano ad un aumento dell’ espressione della proteina reporter in cellule neuronali e non neuronali.
Mutazioni nel gene ARX sono responsabili di un vasto spettro di disordini del neurosviluppo con e senza malformazioni. Inizialmente, solo espansioni dei tratti di polyalanina erano associate alla sindrome di Ohtahara. Lo screening molecolare della porzione codificante del gene ARX ha portato all’identificazione di due nuove punto mutazioni, in un dominio conservato della proteina, in tre pazienti con sindrome di Ohtahara confermando il ruolo patogenetico di questo gene.
L’eziopatogenesi dei disturbi del neurosviluppo deve essere chiarite e altri studi saranno necessari per espandere le nostre conoscenze e per poter fornire un’ accurata diagnosi e counselling genetic
A possible role of superoxide dismutase 2 in the pathogenesis of parkinson disease
No full textParkinson disease is the second most common neurodegenerative disorder after Alzheimer disease. Less than the 5% of the cases are associated with recessive or dominant Mendelian inheritance. It is characterized by tremor at rest,
bradykinesia, postural instability and rigidity. The pathogenesis is still unknow but evidence suggests multifactorial mechanisms. In particular, mitochondrial dysfunction and oxidative stress are believed to have a central role in the pathology.
The hallmark of PD is the loss of dopaminergic neurons of substantia nigra pars compacta, hence dopamine may play an important role in the etiology due its metabolism. In fact, the cytosolic oxidation of dopamine may be very deleterious
to neurons. This neurotransmitter, once synthesized, is sequestered in acid vesicles. However, mitochondrial dysfunction, in particular the inhibition of the complex I, causes ATP depletion, which can perturb the H+-ATPase necessary to
drive the dopamine into vesicles. The consequence will be a redistribution of the neurotransmitter in cytoplasm, where it can auto-oxidize spontaneously at alkaline pH yielding reactive dopamine quinones (DAQs) and reactive oxygen species
(ROS) contributing to oxidative stress. DAQs are suggested to be involved in dopaminergic neurotoxicity because they can form adducts with cysteine residues exposed at the surface of proteins to generate 5-S-cysteinyl-DA. The covalent
modification of proteins could lead to the impairment of their functional properties.
The cells have different mechanisms to protect from oxidative stress: catalase, glutathione peroxidise and superoxide dismutase (SOD). The function of SOD enzymes consists in the dismutation of superoxide anions to hydrogen peroxide and molecular oxygen. Among the three different isoforms of SOD,
SOD2 is particularly important due its mitochondrial localization. Mitochondria are in fact the main source of superoxide anions.
The aim of this thesis is to investigate if SOD2 is a target of DAQs in vitro, the effects of this interaction on the enzymatic function of the protein and the residue/s target of DAQs.
The starting point was the cloning of the cDNA of the human SOD2 in the pET28a+ vector. Since E.coli present 3 different SOD that could potentially interfere with the purification, a second cloning was obtained, in which the cDNA was inserted downstream a cleavable His-tag. A protocol of SOD2 purification
was set up but a control purification, where the cells were transformed with empty vector, led to purify an endogenous SOD of E.coli demonstrating that a E.coli SOD co-purify with the human recombinant enzyme. To avoid the co-purification,
a protocol of purification was optimized for the protein with the His-tag leading to obtain 40-60 mg of protein per 1 liter of culture.
The interaction between SOD2 and DAQs was investigated using different biochemical and biophysical techniques. Dopamine oxidation was induced by the addition of tyrosinase, which prevented the formation of radical species normally
produced during dopamine auto-oxidation. It was verified that the protein did not interact with tyrosine residues of SOD2. The protein was incubated with dopamine at different ratio SOD2: dopamine in the presence of tyrosinase, following by UV-vis spectroscopy the formation of DAQs. The interaction of these products with the protein was studied by mass spectrometry analysis, which revealed the formations of new species whose molecular masses are compatible with the covalent modification of one cystiene residue with dopamine-o-quinone and with the indole 5,6 quinone. Other species were detected, however they were not attribuible to a specific DAQ, hence they might result from more complex interactions. Moreover, the presence of +287.8 Da product suggested the interaction of both the cystiene residues. SDS-PAGE analysis of the reaction products revealed the presence of the protein dimer and aggregates. Native-PAGE showed multiple bands and aggregates upon the interaction with DAQs. The multiple band profile was assigned to the combination of tetramers with monomers of SOD2 with different modifications (as demonstrated by mass analysis). This was supported by 2 dimensional gel, where at least 4 products of SOD2 with different isoelectric point appeared. Activity assay indicated inhibition of proten covalently modified by DAQs. Hence, pulse radiolysis measurements were performed to determine the kinetic parameters of the dismutation reaction.
Data are currently under processing.
To identify the site of DAQs interaction, the cysteine residues were mutagenized obtaining the following mutated proteins: C140A, C196A and C140A/C196A. Incubation of the mutants incubated C14 labeled dopamine demonstrated that the cysteine 196 was the primary target of DAQs. This result was confirmed also by mass spectrometry. The enzymatic activity of the mutant C140A upon interaction of dopamine proved to be lower in comparison with the unmodified protein.
A weakly positive radioactivite signal was found also in association with the mutant C196A and the C140A/C196A suggesting secondary site of DAQs interaction. Since two covalent DAQ-derivatives were found by mass spectrometry after the incubation of the mutant C140A with dopamine, the
existence of a second site of interaction probably another nucleophilic residue is suggested.
Structural changes of SOD2 upon DAQs modification suggested protein precipitation and a possible change in tertiary structure. HFEPR spectra did not show any significant changes in metal coordination.
The results presented in this thesis demonstrate that SOD2 is covalently modified by DAQs in vitro. This suggests a possible role of SOD2 in the PD. The idea is that SOD2 can be covalently modified by DAQs in mitochondria. This would increase the oxidative stress in mitochondria, due to the decrease of dismutase activity of the target protein, ultimately determining mitochondrial dysfunction and contributing to the neuron cell death.La malattia di Parkinson è la malattia neurologica degenerativa più diffusa dopo la malattia di Alzheimer. Meno del 5% dei casi presenta una correlazione genetica (ereditarietà autosomica dominante o recessiva). I sintomi principali caratteristici sono tremore a riposo, bradicinesia, instabilità posturale e rigidità.
L’eziologia rimane ancora sconosciuta ma evidenze perimentali suggeriscono che la malattia sia multifattoriale. In particolare due fattori, disfunzione mitocondriale e stress ossidativo, sembrano avere un ruolo chiave nella patogenesi.
La caratteristica della malattia di Parkinson è la perdita dei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta. Questo fa presupporre che la dopamina abbia un ruolo importante nell’eziologia attraverso il suo metabolismo.
Infatti, l’ossidazione citosolica della dopamina può contribuire alla tossicità neuronale. Questo neurotrasmettitore, una volta sintetizzato, in condizioni normali è sequestrato nelle vescicole sinaptiche. Tuttavia, la disfunzione mitocondriale, in particolare l’inibizione a livello del complesso I riscontrata nella malattia di Parkinson, porta a causare una diminuzione dei livelli di ATP. Questo può influenzare il trasporto di dopamina nelle vescicole che è ATP-dipendente. La conseguenza sarebbe una ridistribuzione del neurotrasmettitore nel citoplasma,
dove può auto-ossidarsi spontaneamente a pH alcalini producendo dopaminochinoni (DAQs) e specie reattive dell’ossigeno (ROS) che contribuiscono allo stress ossidativo. E’ stato suggerito che i DAQs possano essere coinvolti nella
neurotossicità dei neuroni dopaminergici. Questo perchè possono interagire con le cisteine esposte sulla superficie di proteine generando 5-S-cisteinil-DA e la loro modificazione covalente da parte dei DAQs può compromettere la funzionalità e stabilità di queste proteine.
Le cellule possiedono differenti meccanismi per proteggersi dallo stress ossidativo: catalasi, glutatione perossidasi e superossido dismutasi (SOD). La funzione delle SOD consiste nel dismutare l’anione superossido a perossido d’idrogeno e ossigeno molecolare. Tra le tre isoforme di SOD presenti nell’uomo, la SOD2 è particolarmente importante a causa della sua localizzazione all’interno del mitocondrio.
Lo scopo di questa tesi è quello di investigare se la SOD2 sia un target dei DAQs in vitro, gli effetti di questa interazione sull’attività enzimatica della proteina e il/l residuo/i target dei DAQs.
Il punto di partenza è stato il clonaggio del cDNA della SOD2 umana nel vettore pET28a+. Dato che E.coli possiede tre differenti SOD che potrebbero interferire con la purificazione, un secondo clonaggio è stato effettuato, clonando l’inserto a valle di un histidine-tag. È stato messo a punto un protocollo di
purificazione della SOD2 ma la purificazione di controllo, dove le cellule erano state trasformate con il vettore senza l’inserto, ha portato alla purificazione di una SOD endogena di coli. Questo ha dimostrato che una SOD di coli co-purificava con l’enzima umano ricombinante. Per evitare questo, un protocollo di purificazione è stato ottimizzato con l’His-tag ottenendo 40-60 mg di proteina da un litro di coltura.
L’interazione tra la SOD2 e i DAQs è stata indagata utilizzando differenti tecniche biochimiche e biofisiche. L’ossidazione della dopamina è stata indotta dall’aggiunta di tirosinasi, che previene la formazione di specie radicaliche normalmente prodotte durante la sua auto-ossidazione. È stato verificato che la tirosinasi non interagisce con i residui tirosinici della proteina. La SOD2 è stata incubata con differenti rapporti SOD2:dopamina in presenza di tirosinasi, seguendo la formazione dei DAQs con spettroscopia UV-visibile. L’interazione di questi prodotti con la proteina è stata studiata tramite spettrometria di massa, che ha rilevato la formazione di nuove specie le cui masse erano compatibili con la modificazione covalente di una cisteina con il dopamino-o-chinone e con l’indolo 5,6 chinone. Altre specie sono state identificate ma non è stato possibile attribuirle ad uno specifico chinone, quindi queste potrebbero essere il risultato di interazioni più complesse. Inoltre, la presenza di una doppia modifica ha suggerito la possibile interazione di entrambe le cisteine della proteina. Analisi su SDS-PAGE dei prodotti di reazione ha mostrato la presenza di dimeri di proteina e aggregati.
Native-PAGE ha rilevato un pattern di bande multiple e aggregati, dopo interazione con i chinoni. Il profilo delle bande multiple è stato attribuito alla combinazione monomeri di SOD2 con differenti modifiche (come dimostrato dalle analisi di spettrometria di massa) associati a formare tetrameri. Questo è
supportato dal profilo nel gel bidimensionale, dove sono presenti 4 prodotti di SOD2 con differente punto isoelettrico. Il saggio enzimatico ha rilevato che la proteina modificata ovalentemente dai DAQs risulta essere inibita. Misure di radiolisi pulsata sono state effettuate per determinare i parametri cinetici della reazione di dismutazione.
Per identificare i siti di interazione dei DAQs, le cisteine sono state mutagenizzate in alanine ottenendo i seguenti mutanti: C140A, C196A e C140A/C196A. L’incubazione dei mutanti con C14-dopamina ha dimostrato che il target primario dei DAQs è la cisteina 196. Questo risultato è stato confermato anche da analisi di spettrometria di massa. L’attività enzimatica del mutante 140 dopo interazione con DAQs risulta essere minore rispetto alla proteina non modificata.
Un debole segnale di radioattività è stato trovato anche in associazione con il mutante 196 e il doppio. Ciò suggerisce la presenze di un sito di interazione con i chinoni secondario. Dato che due modificazioni dovute a DAQs sono state trovate incubando il mutante C140A, si deduce che il secondo sito di interazione coinvolga un altro residuo nucleofilo.
Cambiamenti strutturali della SOD2 suggeriscono precipitazione della proteina un possibile cambiamento della struttura terziaria. Inoltre modificazioni rilevanti nella coordinazione del metallo non sono state rilevate mediante HFEPR.
I risultati presentati in questa tesi dimostrano che la SOD2 è un target dei DAQs in vitro suggerendo l’idea che la SOD2 possa essere coinvolta nella malattia di Parkinson. Una volta modificata dai DAQs, lo stress ossidativo aumenterebbe nei mitocondri, a causa della inibizione dell’attività dismutasica
dell’enzima, determinando disfunzione mitocondriale e contribuendo alla morte neuronale
Caratterizzazione funzionale e ricerca di partners proteici cellulari della subunità accessoria, UL44, della DNA polimerasi del citomegalovirus umano
No full textThe human cytomegalovirus (HCMV) DNA polymerase consists of a catalytic subunit, UL54, and an accessory protein, UL44, that is thought to act as a processivity factor. UL44 has been shown to bind double-stranded DNA, to specifically interact with UL54 and to stimulate long-chain DNA synthesis by UL54.
The crystal structure of UL44 has recently been solved and has revealed that UL44 possesses a structural fold similar to that of other processivity factors, including herpes simplex virus UL42 and the eukaryotic sliding clamp PCNA. It has also been shown that UL44 forms a homodimer. Similarly to UL42, the putative DNA-binding face of UL44 contains multiple basic residues that could interact electrostatically with the phosphate backbone of DNA.
Residues important for the dimerization of UL44 have been identified: L86, L87 and F121. Indeed, the F121A and L86A/L87A mutants, which behave like monomers, are impaired in the ability to bind double-strand DNA.
In this work we performed some experiments to better understand the role of UL44 dimerization in vivo. We demonstrated that, as already shown for truncated UL44?C290, full-length UL44 can form dimers both in solution and in a cellular context. Moreover, while UL44 dimerization has been shown to be important for binding to DNA, it appears to be not required for binding to UL54 and for stimulation of DNA synthesis by UL54 in vitro. We also investigated the effect of the L86A/L87A and F121A mutations of UL44 on viral DNA replication through an in vivo assay. The homodimerization of UL44 turned out to be essential for the replication of the viral DNA in a cellular context. This observation suggests that the disruption of UL44 dimerization could represent a good strategy for the development of new antiviral compounds.
How UL44 binds to DNA and the role of DNA binding in processivity function have not been yet elucidated. To begin to understand these mechanism, we characterized the interaction of UL44 with DNA by means of filter-binding assays and electrophoretic mobility shift assays (EMSA). We found that, similar to HSV-1 UL42, UL44 binds directly to DNA with nanomolar affinity in a manner that does not require ATP hydrolysis or accessory proteins. UL44 binds DNA as a dimer in a sequence-non specific manner and displays higher affinity for ds DNA compared to ss DNA. Affinity of UL44 for ds DNA decreases with increasing ionic strength and this effect is mediated by ion release, suggesting that DNA binding entails electrostatic interactions between the negatively charged phosphates on DNA backbone and the positive charge of basic residues on the “back” face and disordered loops of UL44.
Finally, several observations suggest that UL44 could have other function(s) besides that of DNA processivity factor. Hence, we performed a two-hybrid system screening in order to identify cellular protein partners of UL44 using a cellular cDNA library. We were able to identify 7 cellular proteins which could represent UL44 functional partners
Le podocitopatie: analisi di varianti genetiche in forme familiari e sporadiche
No full textBackground and aims. The understanding of proteinuric glomerular diseases has greatly expanded in recent years, thanks to the advances in the filed of molecular biology. An increased number of podocyte-expressed genes have been identified, placing glomerular epithelial cell (podocyte) at the centre of the disease mechanisms of podocitopathies. Podocitopathies include a variety of causes and histopathologic findings, despite similar clinical presentation. Even though the development of the glomerulopathy that leads to proteinuria may not only be explained by a genetic alteration, the identification of a genetic disease may be essential to define a patient-tailored therapy (aimed to avoid unnecessary and potentially detrimental drugs, as immunosuppressants) and long-term prognosis (progression to end stage renal disease, risk of post-transplantation recurrence and necessity of specific therapy, possibility of living-related transplantation).
Patients and methods. Genetic testing by direct sequencing of the genes more frequently associated with podocitopathies (NPHS2, WT1, PLCE1, NPHS1) and Next Generation Sequencing (including 46 genes) were carried out in 40 children affected by familial or sporadic podocitopathy. Clinical and histopathological features, as well as outcomes, were also retrospectively and prospectively analysed.
Results. A genomic alteration was found in 20/40 patients (50%): 6/40 children (15%) had a variation in NPHS2 gene (associated with focal segmental glomerulosclerosis - FSGS); in 4/6 cases, the detected sequence variant was novel. 11 patients (27.5%) carried a mutation in WT1 gene (associated with FSGS in 6 and with diffuse mesangial sclerosis – DMS - in 5 children); in 4/11 cases, the detected variation was novel. 3 children had novel sequence variations in PLCE1 gene (the histological picture was FSGS in 2 and DMS in 1). The detected alterations were found to be pathogenetic in 18/20 patients. Genetic analysis was extended to parents in 12/20 cases.
Conclusions. The high frequency of mutation in our series of children affected by podocitopathies confirms the importance of genetic alterations in the pathogenesis of these diseases. Therefore, a correct diagnostic pathway cannot exclude a genetic screening, at least for genes more frequently associated with proteinuria and nephrotic syndrome (namely, NPHS2, WT1 e PLCE1). In clinical practice, the ethiological diagnosis is essential to an accurate work up of the patient (with direct outcomes on therapeutic strategies and prognosis) and may contribute to the optimization of health resources
Possibili traiettorie evolutive dell’attenzione visiva per gli stimoli sociali in bambini ad alto rischio per autismo nei primi mesi di vita.
No full text- …
