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Utilità della tecnica denaturing high performance liquid chromatography per la diagnosi di deficit di mevalonato chinasi nelle febbri periodiche di sospetta natura autoinfiammatoria
Full text linkMevalonate Kinase Deficiency (MKD) is a rare autosomic recessive autoinflammatory disorder characterized by recurrent fever and musculoskeletal manifestations. MKD is due to mutations in the gene for mevalonate kinase (MK), located on chromosome 12q24, which cause variable degrees of enzyme deficiency. Although genetic investigation became essential for the diagnosis, especially in patient with normal IgD values in serum, the analysis of the sequence of the whole coding region is expensive: determination of mutations by sequencing can be made more efficient using techniques of pre-screening able to identify the mutated exon.
OBJECTIVES:
In this study we have developed a genetic investigation using Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC), a pre-screening technique which is able to identify polymorphisms of the gene mvk in patients with autoinflammatory syndrome suspicion.
METHODS:
Starting from January 2007 we evaluated 10 healthy controls and 19 patients (mean age 33 years, range 13 – 61 years) affected by recurrent fevers and other clinical manifestations usually found in autoinflammatory syndromes and not correlated with infections or autoimmune disease. IgD level was measured in all patients.
Molecular testing was performed in DNA extracted from peripheral blood lymphocytes by standard methods. The 10 coding exons (from 2 to 11) of the mvk gene were analysed by means of denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) using the Wave® Fragment Analysis system (Transgenomic). Primers for PCR amplifications, amplicon lengths and PCR conditions were designed in our laboratory. Melting temperature (Tm) were calculated with Navigator Software 1.7.0 (Transgenomic). Sequences of the same amplified fragments were determined by means of an automatic sequencer ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (APPLIED BIOSYSTEMS).
RESULTS:
IgD level was normal in 14 patients.
Healthy controls did not show any alteration of the DHPLC-profiles and of the DNA sequences. Twelve patients had at least one altered DHPLC-profile and these data have been confirmed by sequencing. In particular we detected the mutations S52N (patient 2-13-15), S135S (pt 13-16), D170D, c.632-18A>G(pt 4-5-6-10-12-17-19), c.78+61A>G (pt 6-11-19), c.885+24G>A (pt 6-19) already described in literature and in the database INFEVERS (http://fmf.igh.cnrs.fr/infevers).
The screening with DHPLC has allowed us to get the results in shorter time (10 hours/patient) and with lower cost (40 euro / patient) in comparison to direct sequencing (time: 25 hours / patient and cost: 150 euro / patient).
CONCLUSION:
High serum levels of IgD do not represent an essential marker for diagnosis of MKD, as already reported in literature. DHPLC is a rapid low cost technique in order to screen mutations in patients with MKD suspicion. Nevertheless, being an indirect tecnique, DHPLC is able to show a polymorphism in the DNA sequence but it is not able to identify the position, and this still remains a limiting factor for the use of the DHPLC as an exclusive technique for genetic analysis.
Twelve patients of our cohort carried at the same time D170D and c.632-18A>G: such event suggests that these SNPs could be in linkage disequilibrium and that such mutations could induce a diminution in the activity of the MK predisposing therefore to the MKD.SCOPO DEL LAVORO
La Mevalonate Kinase Deficency (MKD), già nota come sindrome da Iper IgD (HIDS), è una rara malattia autoinfiammatoria di tipo autosomico recessivo caratterizzata da febbre ricorrente e disturbi muscoloscheletrici. La MKD è dovuta a mutazioni del gene mvk, mappato sul cromosoma 12q24, il quale codifica per l’enzima mevalonato chinasi (MK); polimorfismi nel gene mvk sono la causa di un’alterata attività enzimatica di MK.
L’individuazione della mutazione genica della mevalonato chinasi ha reso l’indagine genetica indispensabile per la diagnosi, soprattutto in pazienti con valori sierici di IgD normali, tuttavia il sequenziamento dell’intera regione codificante è costoso e la determinazione di mutazioni può essere resa più efficiente utilizzando tecniche di pre-screening in grado di identificare l’esone mutato. In questo studio è stata effettuata un’indagine genetica utilizzando l’analisi in DHPLC come tecnica di pre-screening per identificare le alterazioni nella regione codificante del gene mvk in pazienti con sospetta sindrome autoinfiammatoria.
MATERIALI E METODI:
A partire da gennaio 2007 sono stati presi in esame 19 pazienti (età media 33 anni, range 13 – 61 anni) seguiti presso la Cattedra e UOC di Reumatologia dell’Università di Padova per febbri ricorrenti non imputabili ad infezioni o a malattie autoimmuni e compatibili con sospetta MKD e 10 controlli sani. In ogni paziente è stato effettuato il dosaggio delle IgD nel siero. L’analisi del DNA, estratto da linfociti del sangue periferico, è stata effettuata mediante un protocollo di amplificazione per frammenti di 210-250 bp messo a punto da noi stessi, utilizzando primers specifici per le sequenze dei 10 esoni codificanti del gene mvk. I prodotti di amplificazione sono stati analizzati mediante DHPLC utilizzando il sistema Wave® Fragment Analysis (Transgenomic, Omaha, NE, USA). Le temperature di melting (Tm) sono state calcolate con Navigator Software 1.7.0 (Transgenomic). Le sequenze degli stessi frammenti amplificati sono state determinate mediante l’uso di un sequenziatore automatico ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (APPLIED BIOSYSTEMS, USA).
RISULTATI:
I valori sierici di IgD erano normali (<100 mg/L) in 14/19 pazienti. Nessun campione di controllo presentava alterazioni dei profili DHPLC e delle sequenze.
Dodici dei 19 pazienti esaminati presentavano almeno un profilo di DHPLC alterato e i dati sono stati confermati con il sequenziamento. Sono state evidenziate le mutazioni S52N (paziente 2-13-15), D170D e c.632-18A>G (paziente 4-5-6-10-12-17-19), S135S (pz 13-16) c.78+61A>G (pz 6-11-19), c.885+24G>A (pz 6-19) già descritte in letteratura e nel database INFEVERS (http://fmf.igh.cnrs.fr/infevers).
Lo screening con DHPLC ha permesso di ottenere i risultati in minor tempo (10 ore / paziente) e con costi inferiori (40 euro / paziente) rispetto alla tecnica di sequenziamento diretto (tempo: 25 ore / paziente , costi: 150 euro / paziente).
CONCLUSIONI:
Un elevato livello sierico di IgD non rappresenta più un marker per fare diagnosi di MKD, come già riportato in letteratura.
La DHPLC è una tecnica capace di effettuare uno screening rapido e a basso costo nell’analisi di mutazioni in pazienti con sospetta sindrome autoinfiammatoria legata al gene mvk.
Tuttavia, essendo una tecnica di analisi indiretta, è necessario considerare che la DHPLC aumenta l’efficienza dell’analisi ma non la sua sensibilità in quanto è in grado di evidenziare un polimorfismo di sequenza ma non la sua posizione.
Sette pazienti della nostra coorte sono risultati portatori delle varianti alleliche D170D e c.632-18A>G; tale evento suggerisce che questi SNP potrebbero essere in linkage disequilibrium e che tali mutazioni potrebbero indurre una diminuzione nell’attività della MK predisponendo quindi alla MKD
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Inibizione dell'espressione genica di iNOS ed effetto su IL-6 da parte della glucosamina solfato in condrociti umani.
No full textEspressione e modulazione della LIM mineralization protein in condrociti umani
No full textIntroduzione: la LIM mineralization protein (LMP) viene considerata una nuova proteina intracellulare coinvolta nel differenziamento degli osteoblasti. Nell’uomo, sono state identificate tre varianti di splicing che differiscono per la sequenza aminoacidica e per la diversa distribuzione tissutale. In particolare, l’isoforma LMP-1 è regolata dalla Bone Morphogenetic Protein (BMP)-6, molecola coinvolta nell’osteoinduzione, e sembra stimolare il processo di differenziamento nell’embriogenesi e la formazione ossea nell’adulto tramite la secrezione di fattori solubili della famiglia delle BMPs. Anche l’isoforma LMP-3 favorisce il processo di ossificazione inducendo la mineralizzazione ossea e l’espressione di geni specifici dell’osso.
Scopo dello studio: valutare se condrociti umani esprimano il gene LMP e a quale isoforma appartenga. Inoltre, se la sua espressione genica venga modulata da uno stimolo infiammatorio quale IL-1beta.
Materiali e metodi: sono state allestite colture primarie di condrociti da cartilagine della testa di femore proveniente da pazienti sottoposti ad intervento di artroprotesi. Le cellule al secondo passaggio sono state stimolate con IL-1beta umana ricombinante a diverse concentrazioni (5, 10, 20 ng/ml) in un terreno privo di siero; al termine delle 24 ore è stato estratto l’RNA totale e ne è stata valutata l’espressione tramite metodo semiquantitativo-comparativo RT/PCR, utilizzando come gene di riferimento rRNA 18S. Le sequenze sono state determinate mediante l’uso di un sequenziatore automatico ABI PRISM 310 Genetic Analyzer.
Risultati: i condrociti esprimono basalmente il gene LMP e l’analisi della sequenza dimostra che l’isoforma espressa è la 1. Il trattamento con IL-1beta stimola l’espressione di LMP-1 in maniera dose-dipendente, con un picco del 60% alla concentrazione di 20 ng/ml rispetto a cellule non trattate.
Conclusioni: questo studio dimostra per la prima volta l’espressione genica di LMP-1 in condrociti umani e una sua modulazione da parte di IL-1beta. Riteniamo che, visto il ruolo osteoinduttivo che sembra avere la proteina LMP-1, uno stimolo infiammatorio quale quello citochinico, possa contribuire, almeno in parte, al rimodellamento cartilagineo e al processo di neoapposizione ossea
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
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