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Investigating the involvement of histone modifications in the control of effector gene expression in Leptospharia maculans, the fungus causing stem canker of oilseed rape
No full textRegulation of effector gene expression in Leptosphaeria maculans
No full textLeptosphaeria maculans ‘brassicae’ (Lmb) est un ascomycète de la classe des Dothideomycètes faisant partie d’un complexe d’espèces présentant différents niveaux d’adaptation au colza. Lmb est responsable d’une des maladies les plus dommageables sur colza : la nécrose du collet. Lmb présente un cycle de vie complexe au cours duquel il alterne différents modes de vie, traduisant l’existence de mécanismes de régulation fine de l’expression des gènes lui permettant de s’adapter rapidement à de nouvelles conditions. Le séquençage de son génome a révélé une structure originale, avec l’alternance de deux types de régions : les isochores GC et les isochores AT. Alors que les isochores GC sont riches en gènes, les isochores AT sont pauvres en gènes et présentent des caractéristiques de l’hétérochromatine (régions génomiques riches en éléments transposables et présentant un faible taux de recombinaison). Bien que pauvres en gènes, les isochores AT représentent une « niche écologique » pour les gènes codant des effecteurs puisque 20 % des gènes des isochores AT codent des effecteurs putatifs contre seulement 4 % des gènes localisés en isochores GC. Les gènes codant des effecteurs situés en isochores AT présentent un comportement transcriptionnel différent de ceux localisés en isochores GC : une faible expression pendant la croissance mycélienne et une forte induction d’expression pendant l’infection primaire du colza. Sur la base de ces observations, l’objectif de ma thèse était de caractériser le déterminisme de la co-expression des effecteurs situés dans les isochores AT et en particulier d’évaluer si la régulation de l’expression de ces gènes se fait par un contrôle épigénétique lié à leur localisation particulière et/ou par l’intervention de régulateurs communs. Afin de déterminer le rôle de la structure des isochores AT, l’analyse fonctionnelle de protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine (i.e. HP1, DIM-5 et DMM-1) a été réalisée et leur implication dans la régulation de l’ensemble des gènes prédits dans le génome de L. maculans a été évaluée. Cette étude a permis de démontrer l’implication de la structure hétérochromatinienne des isochores AT dans la répression de l’expression pendant la croissance mycélienne des gènes situés dans cet environnement génomique, en particulier les gènes codant des effecteurs. Parmi les gènes sous contrôle épigénétique, nous avons pu observer qu’en plus des gènes localisés en isochores AT, des zones en isochores GC étaient aussi affectées et pouvaient constituer des « hot-spots » de contrôle épigénétique. Afin d’identifier des régulateurs candidats pouvant être impliqués dans le contrôle de l’expression des effecteurs pendant l’infection, le répertoire des gènes codant des facteurs de transcription (FTs) chez Lmb a été établi et l’analyse de la conservation de ce répertoire parmi les autres espèces du complexe d’espèces Leptosphaeria a permis d’identifier les FTs spécifiques, ou spécifiquement sur-exprimés pendant l’infection du colza, chez Lmb. Des candidats ont été sélectionnés pour réaliser leur analyse fonctionnelle : des gènes codant des FTs sur-exprimés pendant l’infection (9 FTs) ainsi que les orthologues de FTs qui avaient été décrits chez d’autres espèces comme régulateurs majeurs de la pathogénie (StuA, Sge1 et Fox1). L’analyse fonctionnelle de FTs candidats a permis d’établir que StuA, comme chez d’autres champignons phytopathogènes, joue un rôle important dans la mise en place de l’infection et l’expression des effecteurs chez L. maculans. Le « silencing » d’un FT de type AT-Hook, famille de FTs se fixant préférentiellement au niveau de séquences riches en AT, a un fort effet sur la pathogénie du champignon et entraîne une diminution d’expression de 2 effecteurs. Cette thèse a permis d’apporter de nouveaux éléments concernant la régulation des gènes codant des effecteurs chez un champignon phytopathogène impliquant, pour la première fois, un mécanisme épigénétique.Leptosphaeria maculans is an ascomycete belonging to the Dothideomycete class and is part of a species complex showing different level of adaptation toward oilseed rape. Within this species complex, Lmb is responsible for the most damaging disease of this crop: “stem canker”. Lmb presents a complex life cycle during which it alternates between different life styles and nutritional strategies underlying the involvement of precise regulatory networks for gene expression to rapidly adapt to new conditions. The sequencing of the Lmb genome has revealed an unusual structure, alternating two types of regions, GC- and AT-isochores. While GC-isochores are gene-rich, AT-isochores are gene-poor and have several characteristics of heterochromatin (they are rich in transposable elements and present a lower rate of recombination compared to GC-isochores). Although gene-poor, AT-isochores are “ecological niches” for effector genes as 20% of the genes in these regions encode for putative effectors against only 4% of the genes in GC-isochores. Effector-encoding genes located in AT-isochores present a different transcriptional behavior compared to those located in GC-isochores: a very low expression in axenic culture and a drastic increase in expression during primary leaf infection. On these bases, the aim of my thesis was to characterize the determinism of the concerted effector gene expression. Are AT-isochores targets of reversible epigenetic modifications that affect the regulation of effector genes? and/or are one or several common regulators involved in the control of the concerted expression of effector genes? To assess the role of the structure of AT-isochores, functional analysis of three key players involved in chromatin remodeling (i.e. HP1, DIM-5 and DMM-1) was performed and their role in global gene expression was assessed. This study validated that heterochromatic structure of AT-isochores represses expression of genes located in such a genomic environment, notably effector genes. Among genes under an epigenetic control, we also identified genes located in GC-isochores that were similarly influenced and may represent “hot spots” for epigenetic control. To identify putative regulators of effector gene expression, we established the complete repertoire of transcription factors (TFs) of Lmb and by analyzing the conservation of this repertoire among species of the Leptosphaeria species complex, we identified TFs specific of Lmb, or specifically induced during infection. Functional analysis of 12 TFs was set up: nine TF-encoding genes induced during infection and three orthologs of TFs described as required for pathogenesis in other phytopathogenic fungi (StuA, Sge1, Fox1). This functional analysis showed that StuA, as in other phytopathogenic fungi, plays a major role in infection and expression of effector genes in Lmb. The silencing of an AT-Hook type TF, family of TFs that specifically interact with AT-rich sequences, was associated with a reduction of the expression of two effector genes during infection and with pathogenicity defects. This study brought new insights into the regulation of effector genes in a phytopathogenic fungus involving, for the first time, an epigenetic mechanism
Deciphering the involvement of effector families from the plant pathogenic fungus Leptosphaeria maculans in oilseed rape infection
No full textLes organismes phytopathogènes sécrètent au moment de l'infection un ensemble de molécules collectivement regroupées sous le terme d'effecteurs, éléments clés de la pathogénie qui modulent l'immunité de l'hôte et facilitent l'infection. Un effecteur peut être reconnu par une protéine de résistance végétale, qu'on qualifiera alors de protéine d'avirulence (AVR). Les effecteurs fongiques ont généralement été décrits comme présentant peu ou pas d'homologies dans les bases de données. Cependant, ces dernières années, des familles d'effecteurs conservées entres les espèces fongiques ont pu être identifiées. C'est notamment le cas de Leptosphaeria maculans, l'ascomycète hémibiotrophe responsable de la nécrose du collet du colza, chez qui plusieurs protéines AVR appartiennent à des familles d'effecteurs. Ainsi, AvrLm10A et AvrLm10B, deux protéines AVR toutes deux nécessaires pour induire une reconnaissance par la protéine de résistance Rlm10, présentent quatre couples de paralogues chez L. maculans, ainsi que plusieurs homologues chez d'autres champignons phytopathogènes. De même, AvrLm3 et AvrLm5-9, présentent des homologies de séquence entre elles et ont également des homologues chez plusieurs champignons phytopathogènes. Sur ces bases, l'objectif de ma thèse était de caractériser fonctionnellement ces deux familles d'effecteurs. AvrLm10A et AvrLm10B sont des gènes voisins organisés en orientation inverse. Les quatre paralogues du couple identifiés chez L. maculans sont retrouvés dans différents environnements génomiques mais partagent tous cette même organisation ainsi qu'une coexpression des deux gènes formant chaque couple. AvrLm10A présente des homologues chez 30 champignons phytopathogènes de la famille des Dothidomycètes et des Sordariomycètes qui sont associés à au moins huit familles d'effecteurs putatifs distinctes, ce qui suggère une capacité d'AvrLm10A et de ses homologues à coopérer avec plusieurs familles d'effecteurs. Un des homologues d'AvrLm10A est l'effecteur SIX5 de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici qui interagit physiquement avec l'effecteur Avr2 qu'il transporte de cellule a cellule via les plasmodesmes afin de promouvoir la virulence. Nous avons mené des analyses fonctionnelles sur trois des couples de la famille AvrLm10 (AvrLm10A/AvrLm10B, Lmb_jn3_08094/ Lmb_jn3_08095 et Lmb_jn3_09745/Lmb_jn3_09746), révélant une forte analogie structurale entre AvrLm10A et ses homologues ainsi que SIX5. Lmb_jn3_09745 et Lmb_jn3_09746, tout comme AvrLm10A et AvrLm10B, ont la capacité d'interagir physiquement. AvrLm10A et ses homologues sont également capables de transporter de cellule à cellule, non seulement leur protéine partenaire (à l'exception de Lmb_jn3_08094), mais également Avr2. AvrLm10A et Lmb_jn3_09745 pourraient intervenir lors de l'infection sur cotylédons en limitant le développement des macules. Enfin, Lmb_jn3_08095 serait capable d'inhiber fortement la PTI. AvrLm3 et AvrLm5-9 sont des gènes AVR très conservés dans les populations de L. maculans. Des homologues de ces gène ont été identifiés chez d'autres champignons, dont un gène AVR de Fulvia fulvum ECP11-1 et des effecteurs de F. oxysporum et Zymoseptoria ardabiliae. J'ai montré qu'Ecp11-1 et un effecteur de F. oxysporum f.sp. narcissi étaient reconnus par Rlm3 et que cette reconnaissance était masquée par la présence du gène AVR AvrLm4-7. J'ai également identifié des acides aminés nécessaires à la reconnaissance d'AvrLm3 et d'Ecp11-1 par Rlm3. Mes travaux ont permis de mettre en évidence la conservation protéique ou structurale de famille d'effecteurs pouvant potentiellement cibler les mêmes protéines végétales ou processus cellulaire, ou être reconnues par un même gène de résistance. Il s'agit d'une première étape vers le développement de résistances à large spectre permettant une reconnaissance multi-effecteurs et / ou multi-pathogènes, ou de diminuer la sensibilité du colza à l'infection.During infection, plant pathogens secrete a set of molecules collectively called effectors, key elements of pathogenesis that modulate host immunity and facilitate infection. An effector can be recognized by a plant resistance protein, and is then called avirulence protein (AVR). Fungal effectors have generally been described as having few or no homologues in the databases. However, in recent years, effector families conserved between fungal species have been identified. This is notably the case for the hemibiotrophic fungus Leptosphaeria maculans, causal agent of oilseed rape stem canker, in which several AVR proteins belong to effector families. Indeed, AvrLm10A and AvrLm10B, two AVR proteins both required to induce recognition by the resistance protein Rlm10, have four paralogous pairs in L. maculans, as well as several homologues in other plant pathogenic fungi. Likewise, AvrLm3 and AvrLm5-9 display sequence homologies and also have homologues in several plant pathogenic fungi. The objective of my thesis was to functionally characterize these two effector families. AvrLm10A and AvrLm10B are neighboring genes organized in reverse transcriptional orientation. The four paralogues identified in L. maculans are found in different genomic locations but all share the same organization and coexpression of the two genes forming each pair. AvrLm10A has homologues in 30 plant pathogenic fungi, from the Dothidomycetes and Sordariomycetes, which are associated with at least eight distinct putative effector families, suggesting an ability of AvrLm10A and its homologues to cooperate with multiple effector families. One of the AvrLm10A homologues is the effector SIX5 from Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, which physically interacts with the effector Avr2, transporting it from cell to cell via plasmodesmata to promote virulence. I performed functional analyses on three of the AvrLm10 family pairs (AvrLm10A/AvrLm10B, Lmb_jn3_08094/Lmb_jn3_08095 and Lmb_jn3_09745/Lmb_jn3_09746), revealing a strong structural analogy between AvrLm10A and its homologues as well as SIX5. Lmb_jn3_09745 and Lmb_jn3_09746, like AvrLm10A and AvrLm10B, physically interact. AvrLm10A and its homologues are also able to transport, from cell to cell, not only their partner protein (excepted Lmb_jn3_08094), but also Avr2. AvrLm10A and Lmb_jn3_09745 could be involved in cotyledon infection and regulate fungal aggressiveness by restraining leaf lesion development. Finally, Lmb_jn3_08095 could strongly suppress PTI. AvrLm3 and AvrLm5-9 are highly conserved AVR proteins in L. maculans populations. Homologues of these proteins have been identified in other fungi, including an AVR protein from Fulvia fulvum ECP11-1 and effectors from F. oxysporum and Zymoseptoria ardabiliae. I have demonstrated that Ecp11-1 and an effector from F. oxysporum f.sp. narcissi were recognized by the resistance protein Rlm3 from oilseed rape and that this recognition was masked by the presence of the AVR gene AvrLm4-7. I also identified amino acids required for the recognition of AvrLm3 and Ecp11-1 by Rlm3. My PhD work allowed highlighting protein sequence or structural conservation of effector families that could potentially target the same plant proteins or cellular processes, or be recognized by the same resistance genes. This is a first step towards the development of broad-spectrum resistances allowing multi-effector and/or multi-pathogen recognition, or to decrease the susceptibility of oilseed rape to fungal infection
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Understanding the Involment of Fungal Effectors during Infection : Functional Characterization of Leptosphaeria Maculans Effectors, a Fungal Pathogen of Oilseed Rape
No full textPendant l’infection, les agents phytopathogènes sécrètent un arsenal de molécules, appelées effecteurs, éléments clés de la pathogénie qui modulent l’immunité innée de la plante et facilitent l’infection. Leptosphaeria maculans est le champignon responsable de la nécrose du collet du colza. Plus de 650 gènes codant des effecteurs potentiels ont été identifiés dans son génome, dont 7 ont un rôle reconnu dans l’avirulence du champignon. Les effecteurs fongiques correspondent principalement à de petites protéines potentiellement sécrétées (PPS), n’ayant pas d’homologues dans les bases de données et pas de motifs connus. Par conséquent, leur fonction biologique est difficile à prédire, et très peu de choses sont connues sur le mode d’action des effecteurs de L. maculans au cours de l’infection.L’objectif de ma thèse était de caractériser fonctionnellement des effecteurs de L. maculans afin de mieux comprendre leur rôle au cours du processus infectieux. Cette caractérisation fonctionnelle a consisté en : i) la détermination de la localisation subcellulaire de ces effecteurs dans Nicotiana benthamiana et Arabidopsis thaliana ; ii) la recherche de cibles végétales ciblées par ces effecteurs ; et iii) la détermination des processus cellulaires impactés par ces effecteurs par expression stable dans A. thaliana et tests de suppression de mort cellulaire dans N. benthamiana. Quatre effecteurs ont été choisis pour cette étude : AvrLm10-1, AvrLm10-2, AvrLm4-7 et AvrLm3.AvrLm10-1 et AvrLm10-2 sont tous les deux nécessaires pour induire une reconnaissance par le gène de résistance Rlm10. Des orthologues d’AvrLm10-1 et AvrLm10-2 ont été identifiés chez des Dothidéomycètes et des Sordariomycètes phytopathogènes ainsi que plusieurs paralogues exprimés spécifiquement pendant l’infection chez L. maculans. AvrLm10-1 et AvrLm10-2 présentent toutes les deux une localisation nucléo-cytoplasmique. Une interaction physique entre AvrLm10-1 et AvrLm10-2 a été mise en évidence, ainsi qu’une interaction potentielle de ces deux protéines avec une protéine PR1 (Pathogenesis-related 1) et une cystéine-protéase végétale.AvrLm4-7 est reconnu par deux gènes de résistance, Rlm4 et Rlm7, et sa présence empêche la reconnaissance d’AvrLm3 par Rlm3. AvrLm4-7 est capable de supprimer la mort cellulaire provoquée aussi bien par des inducteurs généraux de la mort cellulaire que par des inducteurs de la PAMP-Triggered Immunity (PTI) et de l’Effector-Triggered Immunity (ETI). AvrLm4-7 présente une localisation nucléo-cytoplasmique, qu’il soit exprimé avec ou sans son peptide signal, ce qui suggère un mode d’action intracellulaire. AvrLm4-7 interagit potentiellement avec une protéine ribosomale végétale, de la même manière qu’un effecteur de Blumeria graminis avec lequel il partage des analogies structurales. Cependant, des lignées d’A. thaliana exprimant AvrLm4-7 de façon constitutive ne présentent aucune différence morphologique ou de sensibilité aux maladies comparativement à l’écotype sauvage Col0.AvrLm3 est un gène d’avirulence très conservé dans les populations de L. maculans dont la reconnaissance par le gène de résistance Rlm3 est supprimée en présence d’AvrLm4-7. AvrLm3 est capable de supprimer la mort cellulaire associée à la PTI et à l’ETI. Cet effecteur est localisé dans l’apoplasme des cellules foliaires lorsqu’il est exprimé avec son peptide-signal, suggérant un mode d’action extracellulaire. AvrLm3 interagit potentiellement avec une myrosinase-associated proteine sécrétée impliquée dans le système myrosinase-glucosinolate, suggérant qu’AvrLm3 perturberait la synthèse des glucosinolates, ce qui est un mode d’action inédit pour un effecteur d’agent phytopathogène.Cette thèse a permis de mieux comprendre le mode d’action des effecteurs de L. maculans et de proposer de nouvelles stratégies de contrôle des maladies fongiques.During infection, plant pathogens secrete an arsenal of molecules collectively known as effectors that circumvent plant innate immunity and trigger infection. The phytopathogenic fungus Leptosphaeria maculans is the causal agent of stem canker of oilseed rape. More than 650 putative effector-encoding genes have been identified in its genome, 7 of them corresponding to avirulence genes. Fungal effectors mainly correspond to small secreted proteins (SSP) with no known homologs and no predicted functions. Their biological function is therefore difficult to predict, and very little is known about the mode of action of L. maculans effectors during infection.The objective of my thesis was to elucidate the role of L. maculans effectors during infection through their functional characterization which included: i) the determination of their subcellular localization in Nicotiana benthamiana et Arabidopsis thaliana; ii) a search for their plant targets; and iii) the determination of the cellular processes targeted by those effectors through their stable expression in A. thaliana and by testing their ability to suppress cell-death in N. benthamiana. We investigated four effectors in that study: AvrLm10-1, AvrLm10-2, AvrLm4-7 and AvrLm3.AvrLm10-1 and AvrLm10-2 are both necessary to trigger recognition by the Rlm10 resistance gene. We have identified orthologs for AvrLm10-1 and AvrLm10-2 in Dothideomycetes and Sordariomycetes phytopathogens, and several paralogs in L. maculans which are expressed specifically during oilseed rape infection. AvrLm10-1 and AvrLm10-2 both have a nucleo-cytoplasmic localization. AvrLm10-1 and AvrLm10-2 physically interact, and may also interact with a PR1 (Pathogenesis-related 1) protein and a secreted cysteine-protease. AvrLm4-7 is recognized by two resistance genes, Rlm4 and Rlm7, and suppresses recognition of AvrLm3 by Rlm3. AvrLm4-7 suppresses cell-death triggered by general inducers, PAMP-Triggered Immunity (PTI) and Effector-Triggered Immunity (ETI). AvrLm4-7 has a nucleo-cytoplasmic localization, whether expressed with or without its signal peptide, suggesting an intracellular mode of action. One of the potential plant targets for AvrLm4-7 is a ribosomal protein, just like a Blumeria graminis effector with structural analogy to AvrLm4-7. Transgenic lines of A. thaliana constitutively expressing AvrLm4-7 do not show any morphological phenotypes or any difference in their susceptibility to diverse fungal pathogens. AvrLm3 is an avirulence gene strongly conserved in L. maculans populations. Recognition of AvrLm3 by Rlm3 is suppressed by the presence of AvrLm4-7. AvrLm3 suppresses cell-death triggered by several inducers of PTI and ETI. AvrLm3 is localized in plant apoplasm when expressed with its signal peptide, suggesting an extracellular localization. AvrLm3 potentially interacts with a secreted myrosinase-associated protein implicated in the myrosinase-glucosinolate system, suggesting that AvrLm3 could disturb glucosinolate production, which is a novel mode of action never described for a plant pathogen effector.My thesis allowed us to improve our knowledge on fungal effector function during infection and to propose new strategies for plant diseases managemen
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
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