66 research outputs found
Estimació de la incertesa de mesura dels procediments de referència primaris per a la mesura de la concentració catalítica dels enzims en un laboratori de referència
No full textAquest treball s'ha realitzat al Laboratori de Referència d'Enzimologia Clínica (LREC) de la Unitat de Bioquímica de Medicina. El LREC és un laboratori de referència acreditat per les normes ISO 17025 i ISO 15195, i forma part de la xarxa internacional de laboratoris de referència del Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM). Un dels requisits dels laboratoris de referència es conèixer la contribució de les diferents fonts d'incertesa a la incertesa de mesura, el que es coneix amb el nom de "compilació de la incertesa". L'objectiu d'aquest treball és l'estimació de la incertesa de mesura, mitjançant un estudi de compilació de la incertesa, de dos procediments de mesura de referència primaris: - el procediment de referència primari per la mesura de l'enzim γ-glutamil transferasa (GGT), com a exemple de procediment amb una única reacció. -el procediment de referència primari per la mesura de l'enzim creatina cinasa (CK), com a exemple de procediment amb més d'una reacció. El càlcul de la incertesa s'ha realitzat a partir dels documents "Evaluation of measurement data - Guide to the expresion of uncertainty", més conegut com GUM i desenvolupat pel Joint Committee for Guides in Metrology (JCGM), i "Quantifying uncertainty in analytical measurement", recomanat per l'Eurachem. Això va implicar fer un estudi exhaustiu dels procediments de mesura de referència, que va consistir en els següents passos: a) definir el mesurant; b) identificar totes les possibles fonts d'incertesa; c) calcular la incertesa estàndard de cada font, mitjançant una avaluació de tipus A o de tipus B, d) calcular els coeficients de sensibilitat, els quals descriuen com varia el resultat del mesurant al produir canvis en cadascuna de les fonts de incertesa; e) calcular la incertesa combinada, tenint en compte la presència o no de fonts correlacionades i f) calcular la incertesa expandida amb un nivell de confiança d'aproximadament el 95 %. El valor de la incertesa de mesura estimada per el procediment de mesura de la GGT és d'un 2,2 % amb un factor de cobertura (k) de 2. De totes les fonts d'incertesa estudiades únicament 8 han contribuït a la incertesa de mesura. Aquestes fonts d'incertesa, ordenades per la importància en la contribució, són: la variabilitat expressada com la imprecisió en condicions intermèdies de mesura amb un 35,6 %, l'interferent glicina amb un 22,8 %, l'exactitud de les absorbàncies amb un 17,1 %, la longitud d'ona amb un 12,4 %, el pH amb un 8,61 %, la linealitat amb un 1,60 %, la fracció de volum de mostra amb un 1,18 %, i la temperatura amb un 0,68 %. La incertesa de mesura estimada del procediment de mesura de la CK és d'1,9 % (k=2). Les principals fonts d'incertesa amb una contribució significativa a la incertesa de mesura són: la variabilitat expressada com la imprecisió en condicions intermèdies de mesura amb un 50,1 %, l'exactitud de les absorbàncies amb un 23,2 %, el pH amb un 22,4 %, la fracció de volum de mostra amb un 2,16 %, la temperatura amb un 1,35 %, la longitud d'ona amb un 0,37 % i la linealitat amb un 0,34 %.This work has been carried out in the Laboratori de Referència d'Enzimologia Clinica (LREC) from de biochemistry and molecular biology department of the Universitat Autònoma de Barcelona (UAB). The LREC is a reference laboratory that is accredited for the ISO 17025 and ISO 15195 standards, and also it is part of the international network of references laboratories of the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine (JCTLM). One of the requirements of the reference laboratories is to know the contribution of the different sources of uncertainty to the measurement uncertainty, the so called "uncertainty budget". The aim of this work is the estimation of the measurement uncertainty, through an uncertainty budget study, of two primary reference measurement procedures: - the primary reference procedure for the measurement of the catalytic concentration of γ-glutamyltransferase (GGT), as an example of procedure with one reaction. - the primary reference procedure for the measurement of catalytic concentration of creatine kinase (CK), as an example of procedure with different reactions. The calculation of the uncertainty has been based on the documents "Evaluation of measurement data - Guide to the expression of uncertainty," which is known as GUM and was developed by the Joint Committee for Guides in Metrology (JCGM), and "Quantifying uncertainty in analytical measurement ", which is recommended by the Eurachem. So for the uncertainty estimation a comprehensive study of the reference measurement procedures was done. This study consisted of the following steps: a) definition of the measurand; b) identification of all possible sources of uncertainty; c) quantification of the standard uncertainty of each potential source of uncertainty identified, with a type A or type B evaluation; d) calculation of sensitivity coefficient, which describe how the value of the measurand varies with changes in each sources of uncertainty; e) calculation of combined uncertainty considering the presence or not of correlated sources of uncertainty, and f) calculation of expanded uncertainty with a level of confidence of approximately 95 %. The value of the measurement uncertainty estimated for the measurement procedure of GGT is 2,2 % with a coverage factor (k) of 2. From all the sources of uncertainty identified only 8 have contributed to the measurement uncertainty. This sources of uncertainty, ordered by importance in the contribution, are the following: the variability expressed as imprecision in intermediated conditions with a 35,6 %, the inhibition by glycine with a 22,8 %, the absorbance accuracy with a 17,1 %, the wavelength adjustment with a 12,4 %, the pH with a 8,61 %, the linearity with a 1,60 %, the sample volume fraction with a 1,18 % and the temperature with a 0,68 %. The measurement uncertainty estimated for the measurement procedure of CK is 1,9 % (k = 2). The main sources of uncertainty with a significant contribution to the measurement uncertainty are: the variability expressed as imprecision in intermediated conditions with a 50,1 %, the absorbance accuracy with a 23,2 %, the pH with a 22,4 %, the sample volume fraction with a 2,16 %, the temperature with a 1,35 %, the wavelength adjustment with a 0,37 % and the linearity with 0,34 %
Contribución del colesterol en las partículas sdldl y el perfil lipídico avanzado al riesgo cardiovascular residual y su respuesta a la dieta mediterránea
No full textLes estratègies per a la prevenció de les malalties cardiovasculars basades en la detecció de factors de risc cardiovascular (FRCV) i en el tractament centrat en la disminució de la concentració de C-LDL han aconseguit disminuir la morbimortalitat associada a aquestes malalties. No obstant això, tot i els esforços, segueixen tenint lloc esdeveniments isquèmics. Una possibilitat per explicar això, és que hi hagi un risc cardiovascular residual (RCVR). Aquest risc, està associat a la dislipèmia aterogènica (DA) i a alteracions en el metabolisme de les lipoproteïnes que afecten la seva concentració i composició. No obstant això, malgrat les eines per identificar-lo, encara hi ha pacients amb un RCV infraestimat. Tenint en compte les publicacions recents, és possible que l’estudi del perfil lipídic avançat pugui justificar aquest RCVR. Per això, en aquesta tesi es plantegen les següents hipòtesis: a) La determinació del perfil lipídic avançat podria ser d’utilitat per explicar el RCVR en pacients amb un perfil lipídic clàssic normal; b) La MedDiet podria tenir un impacte important en el perfil lipídic avançat i contribuir a millorar-lo La subfracció més aterogènica de les LDL són les sdLDL ja que s’infiltren més fàcilment en l’endoteli vascular causa de la seva petita mida i elevada densitat. Tot i l’evidència científica, no s’ha incorporat la seva determinació als laboratoris clínics causa de la falta d’estandardització d’un procediment de mesura practicable i de l’absència de valors de referència adequats. Dins el perfil lipídic avançat, també s’han pogut caracteritzar les diferents subclasses de lipoproteïnes i les seves subfraccions mitjançant les noves tècniques de Ressonància Magnètica Nuclear (RMN). A la primera part d’aquesta tesi es va estandarditzar un mètode de precipitació per a l’aïllament de les partícules sdLDL i mesurar la seva concentració de colesterol. Un cop realitzat aquest primer pas, es van calcular els valors de referència per C-sdLDL en una població sana. Posteriorment, es va demostrar la relació que hi havia entre el diàmetre de les LDL establert per RMN i la concentració de colesterol a les sdLDL. La relació entre ambdues propietats resultar ser que estaven relacionades inversament, i de forma significativa, de tal manera que a l’disminuir el diàmetre de les partícules augmenta la concentració de colesterol a les sdLDL. En tercer lloc, en aquesta tesi s’ha estudiat la influència del perfil lipídic avançat sobre el RCVR. Els resultats de la tercera part d’aquesta tesi doctoral han demostrat la contribució de la subfracció més voluminosa de les LDL (lLDL-P) i dels Tg continguts en les HDL (Tg-HDL) a el risc de patir un esdeveniment isquèmic prematur. Les lLDL-P tenen un efecte protector mentre que l’augment de Tg-HDL incrementa el risc de patir un esdeveniment isquèmic prematur. Finalment, per tancar aquesta tesi doctoral s’ha estudiat l’efecte de l’estil de vida sobre el perfil lipídic avançat amb l’objectiu d’estudiar si podria ajudar a millorar el RCVR un cop el C-LDL ja està controlat.L’estudi PREDIMED-PLUS està avaluant l’efecte de la MedDiet hipocalòrica, activitat física i teràpia conductual (erMedDiet + PA) enfront de la MedDiet i l’assistència sanitària tradicional. Els resultats obtinguts en el quart estudi d’aquesta tesi indiquen l’efecte beneficiós de la MedDiet en el perfil lipídic avançat, sobretot en la composició de les partícules LDL disminuint la concentració de C-sdLDL. També s’ha determinat que el programa erMedDiet + PA millora la composició de les lipoproteïnes LDL i de les VLDL enfront de la MedDiet tradicional. Tenint en compte els resultats obtinguts en aquesta tesi, es posa de manifest el valor afegit del perfil lipídic avançat en l’estudi del RCVR que no es pot abordar mitjançant un perfil lipídic clàssic.Las estrategias para la prevención de la enfermedad cardiovascular (ECV) basadas en la detección de factores de riesgo cardiovascular (FRCV) y en el tratamiento centrado en la disminución de la concentración de C-LDL han conseguido disminuir la morbimortalidad asociada a la ECV. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos, siguen teniendo lugar eventos isquémicos. Una posibilidad para explicar esto, es que exista un riesgo cardiovascular residual (RCVR). Este riesgo, está asociado a la dislipemia aterogénica (DA) y a alteraciones en el metabolismo de las lipoproteínas que afectan a su concentración y composición. Sin embargo, a pesar de las herramientas para identificarlo, aún existen pacientes con un riesgo cardiovascular (RCV) infraestimado. Por ello, en esta tesis se plantean las siguientes hipótesis: a) La determinación del perfil lipídico avanzado podría ser de utilidad para explicar el RCVR en pacientes con un perfil lipídico clásico normal; b) La MedDiet podría tener un impacto importante en el perfil lipídico avanzado y contribuir a mejorarlo. La subfracción más aterogénica de las LDL son las sdLDL ya que se infiltran más fácilmente en el endotelio vascular debido a su pequeño tamaño y elevada densidad. A pesar de la evidencia científica, no se ha incorporado su determinación a los laboratorios clínicos debido a la falta de estandarización de un procedimiento de medida practicable y a la ausencia de valores de referencia adecuados. Dentro del perfil lipídico avanzado, además de la concentración de C-sdLDL también se han podido caracterizar las diferentes subclases de lipoproteínas y sus subfracciones mediante las nuevas técnicas de Resonancia Magnética Nuclear (RMN). El primer objetivo de esta tesis fue estandarizar un método de precipitación para el aislamiento de las partículas sdLDL y medir su concentración de colesterol. Una vez realizado este primer paso, se calcularon los valores de referencia para C-sdLDL en una población sana. En una segunda etapa, se quiso estudiar la relación entre el colesterol de las partículas sdLDL y las características de las lipoproteínas valoradas mediante RMN. De esta forma, se demostró la relación que había entre el diámetro de las LDL y la concentración de colesterol de las sdLDL. Ambas propiedades estaban relacionadas inversamente, y de forma significativa, de tal modo que al disminuir el diámetro de las partículas aumentaba la concentración del colesterol en las sdLDL. En tercer lugar, se ha estudiado el papel del perfil lipídico avanzado en la valoración del RCVR. Los resultados de la tercera parte de esta tesis doctoral han demostrado la contribución de la subfracción más voluminosa de las LDL (lLDL-P) y de los Tg contenidos en las HDL (Tg-HDL) al riesgo de sufrir un evento isquémico prematuro. Las lLDL-P tienen un efecto protector mientras que el aumento de Tg-HDL incrementa el riesgo de sufrir un evento isquémico prematuro. Finalmente, para concluir esta tesis doctoral se ha estudiado el efecto del estilo de vida sobre el perfil lipídico avanzado. Actualmente, el estudio PREDIMED-PLUS está evaluando el efecto de la MedDiet con restricción calórica, actividad física y terapia conductual (erMedDiet+PA) frente a la MedDiet y la asistencia sanitaria tradicional. Los resultados obtenidos en el cuarto estudio de esta tesis indican el efecto beneficioso de la MedDiet en el perfil lipídico avanzado, sobre todo en la composición de las partículas LDL disminuyendo la concentración de C-sdLDL. También se ha determinado que el programa erMedDiet+PA mejora la composición de las lipoproteínas LDL y de las VLDL frente a la MedDiet tradicional. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en esta tesis, se pone de manifiesto el valor añadido del perfil lipídico avanzado en el estudio del RCVR que no se puede abordar mediante un perfil lipídico clásico.Cardiovascular disease (CVD) prevention is based on cardiovascular risc factors (CVRF) early detection and lowering C-LDL concentration. These strategies have shown to reduce the morbidity and mortality related to CVD. However, ischemic events still occur because of the residual cardiovascular risk (RCVR). Commonly, is associated with atherogenic dyslipemia (AD) and with alterations in lipoproteins metabolism that affect their concentration and composition as well. However, some patients still present an underestimated CVR. Recent publications show that it is possible to explain this RCVR thanks to the advanced lipid profile. On the other hand, the MedDiet and its effect on the traditional lipid profile and weight has proved to reduce ischemic premature events. For this reason, it would be interesting to find out the impact of MedDiet on the advanced lipid profile and the RCVR. Therefore, in this thesis the following hypotheses are raised: a) Advanced lipid profile could be useful to explain the RCVR in patients with a normal classical lipid profile; b) MedDiet could have a significant impact on the advanced lipid profile and contribute to its improvement. The most atherogenic LDL subfractions are sdLDL, due to their small size and high density; these particles can easily pass through the vascular endothelium. Despite scientific evidence, its determination has not been included in clinical laboratories due to the lack of standardization of a practicable measurement procedure and adequate reference values. In addition to C-sdLDL concentration, different subclasses of lipoproteins have been characterized using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) techniques. This method can provide information about the composition, concentration and particle number of lipoprotein subclasses. In the first part of this study, a precipitation method for sdLDL isolation was standardized and cholesterol concentration contained in these particles was measured. Reference values for C-sdLDL were calculated in a healthy population and published in a scientific journal. Subsequently, we study the relationship between C-sdLDL and LDL characteristics established by RMN. We find out that LDL diameter established by NMR is inversely correlated to C-sdLDL. These results are significant and proved that as the LDL diameter decreased, C-sdLDL increased. After that, the effect of advanced lipid profile on RCVR was also studied. Results obtained have demonstrated that large LDL subfraction (lLDL-P) and Tg contained in HDL (Tg-HDL) contribute to the risk of suffering a premature ischemic event. LLDL-P has a protective effect while Tg-HDL increases the risk of suffering a premature ischemic event. Finally, the effect of lifestyle on advanced lipid profile has been studied. The principal aim was to determine the effect on lipoprotein subclasses when C-LDL has achieved goal concentration. Considering that lifestyle changes are the first line on CVD treatment, it is important to determine the influence of healthy lifestyle habits and different types of diet on the advanced lipid profile. The PREDIMED study has already demonstrated the beneficial effects of MedDiet on reducing mortality related to CVD. Meanwhile, the PREDIMED-PLUS study is evaluating the effect of hypocaloric MedDiet, physical activity and behavioral therapy (erMedDiet + PA) versus MedDiet and traditional healthcare. Results obtained in this study indicate the beneficial effect of MedDiet on the advanced lipid profile, especially on the composition of LDL particles, reducing C-sdLDL. The erMedDiet + PA program has also improved LDL and VLDL lipoprotein composition over traditional MedDiet results. Taking into account results obtained in this research work, we have demonstrated the benefit of the advanced lipid profile on RCVR identification, which cannot be detected using the classic lipid profile.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicin
Gestión de los riesgos en los laboratorios de urgencias y su impacto en la seguridad del paciente
No full textDurante los últimos 4 años, se ha realizado un estudio sobre la Gestión de los Riesgos en Laboratorios de Urgencias y su impacto en la Seguridad del Paciente. El objetivo principal de dicho estudio, es mejorar la Seguridad del Paciente y fomentar la cultura de la misma. El punto de partida es estudiar todos los posibles riesgos que pueden suceder en estos laboratorios, y posteriormente planificar una serie de acciones preventivas y correctivas que formarán parte de la Gestión de los Riesgos. El estudio consta de 4 partes principalmente: -Identificación de los posibles modos de fallo en los procesos de los laboratorios. Se aplica la herramienta Análisis Modal de Fallos y Efectos (AMFE) que nos permite identificar todos los posibles riesgos potenciales e implantar acciones preventivas. -Control de los puntos críticos en los procesos de los laboratorios. Se realiza con la aplicación del la herramienta Registro de Errores, Análisis y Sistema de Acciones Correctivas (FRACAS), que nos permite detectar los errores que suceden e implantar acciones correctivas. -Evaluación de la Cultura de la Seguridad del Paciente entre los profesionales de los Laboratorios de Urgencias y los profesionales de los servicios con mayor demanda en el Laboratorio de Urgencias. Se planifican las acciones formativas necesarias para paliar las deficiencias detectadas. -Recomendación de acciones preventivas y correctivas para los riesgos potenciales o críticos identificados y los errores detectados. Implantación y evaluación de algunas de las acciones más relevantes. Todas estas acciones de mejora se recogerán en la de Gestión de los Riesgos y a partir de su evaluación, se podrá determinar su grado de eficacia. Este estudio nos ha permitido, implantar la Gestión de los Riesgos en los Laboratorios de Urgencias y crear un modelo a seguir en el tiempo para mejorar la Seguridad de los Pacientes, así como difundir la cultura y aumentar la competencia de los profesionales en relación con este tema.During de last 4 years, a study has been taken on the Risk Management in Laboratories of Emergency and its impact in the Patient Safety. The principal aim of the above mentioned study is to improve the Patient Safety and to promote the Culture of Patient Safety. The starting point is to study all the possible risks that can take place in these laboratories and to plan preventive and corrective actions that will form part of the Risk Management. Mainly, the study consists of 4 parts: - Identification of the possible failure modes in the processes of the laboratories. The applied is the Failures Modal and Effects Analysis (FMEA) that allows us to identify all the possible potential risks and to implement preventive actions. - The control of the critical points in the processes of the laboratories is realized with the application of the Failure Reporting, Analysis and Corrective Actions (FRACAS), which allows us to detect the mistakes that happen and to implement corrective actions. - Evaluation the Culture of the Patient Safety among the professionals of Emergency Laboratories and the professionals of the services with major demand in the Emergency Laboratory. The essential among training actions are planning to relieve to identify deficiencies. - Recommendation of preventive and corrective actions for the potential or critical risks identified and detected mistakes. Implantation and evaluation some of the most relevant actions. All these actions of improvement will be gathered in the Risk Management and from its evaluation it will be possible to determine the degree of efficiency. This study has allowed us to implement the Risk Management in the Emergency Laboratories and to create a model to be checked out in the future to improve Patient Safety, as well as to spread the culture and increase the competence of the professionals in relation with this topic
Influencia de variantes genéticas en la respuesta al tratamiento con estatinas. estudio prospectivo y multicéntrico
No full textLes estatines són fàrmacs inhibidors de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa), enzim limitant en la síntesi de colesterol. El seu ús està àmpliament estès en prevenció primària i secundària de la ateroesclerosi a causa del seu efecte hipolipemiant. No obstant això, la resposta terapèutica presenta gran variabilitat interindividual tant en la disminució de la concentració plasmàtica de colesterol LDL (c-LDL) com en l’augment de la concentració plasmàtica de colesterol HDL (c-HDL). Per això, en els darrers anys ha pres força la hipòtesi de l’existència d’una contribució genètica a la variabilitat interindividual observada.
En aquest context, s’ha proposat l’estudi d’algunes variants genètiques de gens implicats en el metabolisme i en el transport lipídic (CETP -cholesteryl ester transfer protein-, ABCA1 -binding cassette subfamily A member 1- i KIF6 -Kinesin Family Member 6- ) i en la farmacocinètica de les estatines (CYP2D6 -cytochrome P450 family 2 subfamily D member 6- i CYP2C9 -cytochrome P450 family 2 subfamily D member 9- ), l’evidència científica dels quals no està encara demostrada.
La hipòtesi de la present tesi és que les variants genètiques seleccionades influeixen en l’eficàcia del tractament amb estatines. La confirmació d’aquesta relació permetria millorar la individualització del tractament, duent a terme una medicina personalitzada i cost efectiva.
S’ha realitzat un estudi prospectiu i multicèntric que ha inclòs 344 pacients i s’ha estudiat la influència de variants genètiques dels gens esmentats en l’eficàcia al tractament amb simvastatina, atorvastatina i rosuvastatina. Les variants genètiques incloses han estat: rs708272 i rs5882 del gen CETP, rs2230806 del gen ABCA1, rs20455 del gen KIF6, rs35742686, rs3892097 i rs5030655 del gen CYP2D6 i rs1799853 i rs1057910 del CYP2C9.
Per a estudiar la influència genètica sobre l’eficàcia del tractament, es van realitzar models de regressió multivariant que van analitzar la consecució dels objectius terapèutics basats en les concentracions plasmàtiques de c-LDL o colesterol no-HDL (c-NoHDL), així com també la variació percentual en el perfil lipídic post-tractament.
S’ha comprovat que les variants rs2230806 del gen ABCA1 i rs35742686 del gen CYP2D6 influeixen en la resposta al tractament amb estatines. Els pacients portadors d’aquestes variants tenen menor probabilitat d’arribar als objectius terapèutics per a la concentració plasmàtica de c-LDL o de c-NoHDL. Quantitativament, el genotip TT de la variant ABCA1 (rs2230806) condiciona un descens de c-LDL un 12% menor en el cas de la simvastatina i atorvastatina que els CT o CC. D’altra banda, les variants rs708272 i rs5882 del gen CETP també influeixen en la resposta al tractament amb rosuvastatina, encara que es requereix d’una major grandària mostral per a corroborar aquests resultats.
També s’ha demostrat que la variant rs20455 del gen KIF6 influeix en la resposta al tractament amb simvastatina i atorvastatina. Concretament, els homozigots de la variant (genotip CC) presenten una disminució un 8,1% menor de les concentracions plasmàtiques de c-LDL o de c-NoHDL, i per tant responen pitjor al tractament hipolipemiant que els pacients amb els genotips TT o CT. En relació a la rosuvastatina, els pacients portadors de la variant genètica després del tractament farmacològic tenen un augment de c-HDL un 22% menor comparat amb els pacients que no tenen la variant.
Tenint en compte els resultats de la present tesi doctoral, la inclusió de l’estudi de les variants genètiques en la pràctica clínica podria ser de gran interès per a la individualització del tractament amb estatines, aconseguint una millora en la consecució dels objectius terapèutics c-LDL o de c-NoHDL en aquests pacients, la qual cosa permetria reduir, en definitiva, el risc cardiovascular.Las estatinas son fármacos inhibidores de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A reductasa (HMG-CoA reductasa), enzima limitante en la síntesis de colesterol. Su uso está ampliamente extendido en prevención primaria y secundaria de la ateroesclerosis debido a su efecto hipolipemiante. Sin embargo, la respuesta terapéutica presenta gran variabilidad interindividual tanto en la disminución de la concentración plasmática de colesterol LDL (c-LDL) como en el aumento de la concentración plasmática de colesterol HDL (c-HDL). Por ello, en los últimos años ha ido creciendo la hipótesis de la existencia de una contribución genética que explicaría esta variabilidad.
En este contexto, se ha propuesto el estudio de algunas variantes genéticas de genes implicados en el metabolismo y en el transporte lipídico (CETP -cholesteryl ester transfer protein-, ABCA1 -binding cassette subfamily A member 1- y KIF6 -Kinesin Family Member 6- ) y en la farmacocinética de las estatinas (CYP2D6 -cytochrome P450 family 2 subfamily D member 6- y CYP2C9 -cytochrome P450 family 2 subfamily D member 9- ), cuya evidencia científica no está aún demostrada.
La hipótesis de la presente tesis es que las variantes genéticas seleccionadas influyen en la eficacia del tratamiento con estatinas. La confirmación de esta relación permitiría mejorar la individualización del tratamiento, llevando a cabo una medicina personalizada y coste efectiva.
Se ha realizado un estudio prospectivo y multicéntrico que ha incluido 344 pacientes y se ha estudiado la influencia de variantes genéticas de los genes mencionados en la eficacia al tratamiento con simvastatina, atorvastatina y rosuvastatina. Las variantes genéticas incluidas han sido: rs708272 y rs5882 del gen CETP, rs2230806 del gen ABCA1, rs20455 del gen KIF6, rs35742686, rs3892097 y rs5030655 del gen CYP2D6 y rs1799853 y rs1057910 del CYP2C9.
Para estudiar la influencia genética sobre la eficacia del tratamiento, se realizaron modelos de regresión multivariante que analizaron por un lado la consecución de los objetivos terapéuticos en base a las concentraciones plasmáticas de c-LDL o colesterol no-HDL (c-NoHDL), y por otro el cambio porcentual en el perfil lipídico post-tratamiento.
Se ha comprobado que las variantes rs2230806 del gen ABCA1 y rs35742686 del gen CYP2D6 influyen en la respuesta al tratamiento con estatinas. Los pacientes portadores de estas variantes tienen menor probabilidad de llegar a los objetivos terapéuticos para la concentración plasmática de c-LDL o de c-NoHDL. Cuantitativamente, el genotipo TT de la variante ABCA1 (rs2230806) condiciona un descenso de c-LDL un 12% menor en el caso de la simvastatina y atorvastatina que los CT o CC. Por otro lado, las variantes rs708272 y rs5882 del gen CETP parecen también influir en la respuesta al tratamiento con rosuvastatina, aunque se requiere de un mayor tamaño muestral para corroborar estos resultados.
También se ha demostrado que la variante rs20455 del gen KIF6 influye en la respuesta al tratamiento con simvastatina y atorvastatina. Concretamente, los homocigotos de la variante (genotipo CC) presentan una disminución un 8,1% menor de las concentraciones plasmáticas de c-LDL o de c-NoHDL, y por tanto responden peor al tratamiento hipolipemiante que los pacientes con los genotipos TT o CT. En relación con la rosuvastatina, los pacientes portadores de la variante genética después del tratamiento farmacológico tienen un aumento de c-HDL un 22% menor comparado con los pacientes que no tienen la variante.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral, la inclusión del estudio de las variantes genéticas en la práctica clínica podría ser de gran interés para la individualización del tratamiento con estatinas, consiguiendo una mejora en la consecución de los objetivos terapéuticos c-LDL o de c-NoHDL en estos pacientes, lo que permitiría reducir, en definitiva, el riesgo cardiovascular.Statins are drugs that inhibit 3-hydroxy-3-methyl-glutaril- CoA reductase, a rate limiting enzyme of the colesterol synthesis pathway. Statins are widely used for the primary and secondary prevention of atherosclerosis. However, patient responses to these drugs are highly variable with respect to reducing plasma concentrations of LDL cholesterol (LDL-C) and increasing plasma concentrations of HDL colesterol (HDL-C). The impact that genetic variants may have on the effectiveness of statins therapy is currently being investigated with the aim of reaching personalized and cost-effective treatments.
In this context, the study of genetic variants within genes involved in lipid transport and metabolism (CETP -cholesteryl ester transfer protein-, ABCA1 -binding cassette subfamily A member 1- and KIF6 -Kinesin Family Member 6- ) and in statin pharmacokinetics (CYP2D6 -cytochrome P450 family 2 subfamily D member 6- and CYP2C9 -cytochrome P450 family 2 subfamily D member 9- ), whose scientific evidence remains unconfirmed.
In order to more deeply understand the impact of these gene variants on the efficacy of statin treatment, a prospective and multicenter study including 344 patients was performed to determine the influence of the following gene variants on patient response to simvastatin, atorvastatin, and rosuvastatin: the CETP variants rs708272 and rs5882, the ABCA1 variant rs2230806, the CYP2D6 variants rs35742686, rs3892097, and rs5030655, and the CYP2C9 variants rs1799853 and rs1057910.
The efficacy of statin treatment was determined using multivariate regression models to analyze both the achievement of lipid therapeutic targets and the percentual variation in lipid profiles before and after therapy.
ABCA1 variant rs2230806 and CYP2D6 rs35742686 influence patient response to treatment with statins. Variant carriers are less likely to achieve LDL-C or cholesterol non-HDL (non-HDL-C) therapeutic targets. In addition, carriers of the TT genotype of rs2230806 have a 12% lower LDL-C in response to treatment with simvastatin and atorvastatin than CT or CC genotype. CETP gene variants rs708272 and rs5882 affect patient responses to rosuvastatin, however a larger sample size is required to corroborate these results.
The rs20455 C variant of the KIF6 gene also influences treatment response when using simvastatin and atorvastatin. Homozygous patients for the variant (CC genotype) had a smaller decrease (8.1%) in the LDL-C and non-HDL-C. Therefore, these patients did not respond as well to hypolipidemic therapies as patients who were homozygous (TT) or heterozygous (TC). Regarding to rosuvastatin treatment, C variant is associated with a less pronounced increase (22%) in HDL-C compared to patients without the variant.
Taking into account the results obtained in the present doctoral thesis, the study of these genetic variants in the clinical practice could be a powerful tool to personalize patient treatment, improving the achievement of therapeutical goals and, ultimately, decreasing the overall cardiovascular risk.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicin
Desarrollo de nuevas herramientas en biopsia líquida aplicadas a cáncer de mama y gliomas
No full textEl càncer de mama i els gliomes són dos dels tumors amb més impacte en la societat actual: un per ser el més prevalent i amb més incidència i l’altre per la dificultat de detecció i l’alt índex de mortalitat. Tot i els avenços en el camp de l’oncologia clínica, diagnòstic, pronòstic, monitorització i predicció de teràpia, encara queda molt camí per assolir una medicina personalitzada. L’auge de noves eines com la biòpsia líquida (BL), es presenta com una oportunitat per reforçar la detecció precoç; el seguiment de l’evolució del tumor; l’avaluació de la resposta a un tractament determinat; la detecció de mutacions accionables i el descobriment de nous biomarcadors.
El gran repte de la BL és la detecció dels compostos que realment han estat alliberats pel tumor. Les tecnologies que, amb un límit de detecció suficient, permeten detectar alteracions genètiques procedents del tumor, suposen una inversió econòmica ingent per gran part dels laboratoris. En aquest sentit, les vesícules extracel·lulars (VEs) són una de les fonts de biomarcadors més investigades, ja que el seu aïllament pot augmentar la representació d’àcids nucleics procedents del tumor. Tot i això, el seu aïllament i detecció suposa d’uns requeriments tècnics no disponibles per a tots els laboratoris.
En aquesta tesi presentem un protocol d’aïllament de VEs amb un rendiment superior als mètodes de referència més utilitzats. Així mateix, analitzem dos tipus de biomarcadors genètics extrets a partir de les VEs aïllades: miARN als tumors mamaris i ADN als tumors glials.
De totes les molècules presents a les VEs, els miARNs són els que estan captant més interès dins de la comunitat científica. En aquesta investigació, proposem per primera vegada l’anàlisi d’expressió relativa de miARNs de VEs per a l’estratificació de la resposta a la quimioteràpia neoadjuvant en pacients amb càncer de mama d’aquells fenotips que presenten una clínica més agressiva, que els hem anomenat fenotips extrems: HER2 sobreexpressat, luminal B amb HER2 sobreexpressat i triple negatiu.
També s’ofereix una alternativa cost-efectiva per a la detecció de la mutació IDH1R132H en ADN de VEs procedents pacients amb glioma. La tecnologia aquí descrita és independent tant de mètodes clàssics (seqüenciació i RT-q-PCR), com de tecnologies d’última generació (PCR digital i seqüenciació de nova generació) podent-se instaurar en qualsevol laboratori mínimament equipat. Encara més, aquesta tècnica és extensible a altres alteracions genètiques d’interès en gliomes i altres patologies.El cáncer de mama y los gliomas son dos de los tumores con más impacto en la sociedad actual: uno por ser el más prevalente y con una mayor incidencia y el otro por su dificultad de detección y su alto índice de mortalidad. A pesar de los avances en el campo de la oncología clínica, diagnóstico, pronóstico, monitorización y predicción de terapia, aún queda mucho camino para alcanzar una medicina personalizada. El auge de nuevas herramientas como la biopsia líquida (BL), se presenta como una oportunidad para reforzar la detección precoz; el seguimiento de la evolución del tumor; la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento; la detección de mutaciones accionables y el descubrimiento de nuevos biomarcadores.
El gran reto de la BL es la detección de aquellos compuestos que realmente han sido liberados por el tumor. Las tecnologías que, con un límite de detección suficiente, permiten hallar alteraciones genéticas procedentes del tumor, suponen una inversión económica ingente por parte de los laboratorios. En este sentido, las vesículas extracelulares (VEs) son una de las fuentes de biomarcadores más investigadas, ya que su aislamiento puede aumentar la representación de ácidos nucleicos procedentes del tumor. Sin embargo, su aislamiento y detección, supone de unos requerimientos técnicos no disponibles para todos los laboratorios.
En esta tesis presentamos un protocolo de aislamiento de VEs con un rendimiento superior a los métodos de referencia más usados. Asimismo, analizamos dos tipos de biomarcadores genéticos extraídos a partir de las VEs: miARN en los tumores mamarios y ADN en los tumores gliales.
De todas las moléculas presentes en las VEs, los miARNs son los que están captando mayor interés dentro de la comunidad científica. En esta investigación, proponemos por primera vez el análisis de expresión relativa de miARNs en VEs para la estratificación de la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante en pacientes con cáncer de mama con fenotipos que presentan una clínica más agresiva, que denominamos fenotipos extremos: HER2 sobreexpresado, luminal B con HER2 sobreexpresado y triple negativo.
También se ofrece una alternativa coste-efectiva en cuanto a la detección de la mutación IDH1R132H en ADN de VEs procedentes de pacientes con glioma. La tecnología aquí descrita es independiente tanto de métodos clásicos (secuenciación y RT-q-PCR), como de tecnologías de última generación (PCR digital y secuenciación de nueva generación), pudiéndose instaurar en cualquier laboratorio mínimamente equipado. Más aún, esta técnica es extensible a otras alteraciones genéticas de interés en gliomas y otras patologías.Breast cancer and gliomas are two of the tumors with the greatest impact on today’s society. Breast cancer is the most prevalent tumor and has the highest incidence, and gliomas for its difficulty in detection and its high mortality rate. Despite advances in the field of clinical oncology, diagnosis, prognosis, monitoring and therapy prediction, there is still a long way to go to achieve personalized medicine. The rise of new tools such as liquid biopsy (LB), is presented as an opportunity to reinforce early detection; monitoring of tumor evolution; the evaluation of the response to a treatment; the detection of actionable mutation changes and the discovery of new biomarkers.
The great challenge of LB is the detection of those compounds that have truly been released by the tumor. The technologies that, with a sufficient detection limit, make it possible to find genetic alterations derived from the tumour, represent a huge economic investment by laboratories. In this way, extracellular vesicles (EVs) are one of the most investigated sources of biomarkers since their isolation can increase the representation of tumor nucleic acids. However, its isolation and detection entail technical requirements that are not available to all laboratories.
In this thesis we present a protocol for isolating EVs with a higher yield than the most used reference methods. We also analysed two types of genetic biomarkers extracted from isolated EVs: miRNA in breast tumors and DNA in glioma.
Out of all the molecules contained in the EVs, miRNAs are the ones that are attracting the most interest within the scientific community. Here, we propose for the first time the analysis of relative expression of miRNAs in VEs for the stratification of response to neoadjuvant chemotherapy in patients with most aggressive breast cancer types: HER2 overexpressed, luminal B with HER2 overexpressed and triple negative. Which we call them extreme phenotypes.
In addition, we present a cost-effective alternative for the detection of the IDH1R132H mutation in DNA from EVs from glioma patients. The technology described here is independent of both classical methods (sequencing and RT-q-PCR) and cutting-edge technologies (digital PCR and next-generation sequencing), so it can be installed in any minimally equipped laboratory.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicin
An approach to establish the uncertainty budget of catalytic activity concentration measurements in a reference laboratory
No full textEl Gen ANRIL com a marcador d'episodis cardiovasculars en pacients amb malaltia renal crònica
No full textAquesta tesi doctoral s'ha centrat en l'estudi de la relació entre diversos polimorfismes dels gens ANRIL i CARD8 i l'aparició d'episodis cardiovasculars en una població de pacients amb malaltia renal crònica constituïda per pacients en hemodiàlisi i receptors d'un trasplantament de ronyó. Per tal de poder estratificar correctament aquests pacients en funció del seu risc cardiovascular, la hipòtesi del treball ha estat que la informació relativa a la presència de certes variants genètiques relacionades amb l'arterioesclerosi s'ha d'afegir als factors de risc cardiovasculars clàssics. Concretament, el projecte de tesi s'ha dividit en dues parts: en una primera part l'objectiu ha estat estudiar el paper dels polimorfismes del gen ANRIL en el risc d'episodis cardiovasculars en pacients amb malaltia renal crònica terminal en hemodiàlisi. I a la segona part s'ha estudiat si el polimorfisme estadísticament més significatiu del primer estudi, continua exercint el seu paper promotor del risc cardiovascular una vegada els pacients han estat sotmesos a trasplantament renal. La tesi doctoral demostra que el polimorfisme rs10757278 està en desequilibri de lligament amb un conjunt de polimorfismes propers del gen ANRIL, i que està relacionat estadísticament amb l'aparició d'episodis cardiovasculars en pacients en hemodiàlisi. Concretament, els pacients homozigots per l'al·lel de risc (genotip GG) han mostrat un risc del doble aproximadament -HR: 2.15 (1.14-4.01), Paj=0.018- que els pacients portadors de l'al·lel protector A. A més a més, s'ha demostrat que aquest efecte es mantenia tot i ajustar per les variables de risc cardiovascular clàssiques, fins i tot la diabetis, amb la qual manté un efecte sinèrgic. Aquesta relació amb el risc cardiovascular s'ha confirmat també en la població de pacients trasplantats renals on el risc de patir un episodi cardiovascular pels pacients amb genotip GG augmenta 2.93 vegades (1.69-5.11), P 0.0001 respecte als portadors de l'al·lel A. Concretament, l'associació d'aquest polimorfisme amb el desenvolupament d'ictus isquèmic té un efecte més important -HR: 4.43 (1.81-10.85) Paj=0.001- que en el cas d'infart agut de miocardi -HR: 2.27 (1.10-4.67), Paj=0.026. Per altra banda, el polimorfisme rs2043211 del gen CARD8 no mostra associacions significatives amb patir un episodi cardiovascular o amb mortalitat en pacients receptors d'un trasplantament de ronyó. Tot i així, quan es combina amb el polimorfisme rs10757278 del gen ANRIL, l'increment del risc cardiovascular dels homozigots combinats de l'al·lel de risc manté l'efecte que l'SNP d'ANRIL havia mostrat de forma independent, suggerint que CARD8 podria tenir algun paper en el mecanisme d'acció del polimorfisme rs10757278 del gen ANRIL. Els resultats obtinguts en la present tesi doctoral demostren per primera vegada la relació de la variant genètica rs10757278 del gen ANRIL amb els episodis cardiovasculars, especialment pel que fa als ictus isquèmics, en pacients amb malaltia renal crònica: en hemodiàlisi i receptors d'un trasplantament de ronyó. Afegir l'estudi d'aquest polimorfisme a la pràctica clínica permetria estratificar millor els pacients amb alt risc cardiovascular i oferir-los un tractament d'alta intensitat que permetés disminuir la morbi-mortalitat per aquesta causa.The main objective of this doctoral thesis was to ascertain whether ANRIL and CARD8 single nucleotide polymorphisms (SNPs) could identify risk of major adverse cardiovascular event (MACE) in chronic renal disease: hemodialysis and kidney transplant recipients. The thesis was divided into two parts: in the first part, the objective was to ascertain whether ANRIL polymorphisms could identify risk of major adverse cardiovascular event in patients starting on hemodialysis. And, in the second part, the main objective was to ascertain whether the statistically significant polymorphism of the first study continues to play its role in promoting cardiovascular events once the patients have undergone renal transplantation. This thesis shows a correlation between ANRIL SNP rs10757278 and MACE in hemodialysis patients. Specifically, homozygous patients for the risk allele (GG genotype) showed 2.15 (1.14-4.01), Padj=0.018 fold higher risk of MACE during hemodialysis than carriers of the protective allele (AA or AG). Furthermore, this effect was maintained despite adjusting for the classic cardiovascular risk variables, including diabetes, with which it maintains a synergistic effect. This relationship between ANRIL polymorphism and major adverse cardiovascular events was confirmed in the second study in renal transplant recipients cohort. Patients homozygous for the risk allele (GG genotype) showed a 2.93 (1.69-5.11), P 0.0001 fold higher risk of suffering a cardiovascular event than patients carrying the protective allele (AA or AG genotype). A stratified analysis by type of cardiovascular event: ischemic stroke or myocardial event (myocardial infarction and unstable angina) was performed. ANRIL polymorphism rs10757278 showed a stronger association with ischemic stroke HR = 4.43 (1.81-10.85), Padj=0.001 than with myocardial event (HR = 2.27 (1.10-4.67), Padj=0.026. Regarding CARD8 polymorphism, no association was observed between CARD8 SNP rs2043211 and cardiovascular events nor all cause mortality nor cardiovascular exitus in renal transplant recipients. However, the effect of the ANRIL SNP rs10757278 was maintained when it was analyzed in combination with CARD8, suggesting that CARD8 SNP rs2043211 could play a role in the ANRIL SNP rs10757278 mechanism. Results obtained in this doctoral thesis demonstrate, for the first time, a significant genotypic association of ANRIL SNP rs10757278 with major adverse cardiovascular events, in particular with ischemic stroke, in chronic kidney disease patients. The study of this polymorphism would be beneficial for the management of high cardiovascular risk patients resulting in a personalized treatment that could reduce the morbidity and mortality
Certificación de la concentración de masa de la isoenzima 2 de la creatina-quinasa del material de referencia BCR 608
No full textConsultable des del TDXTítol obtingut de la portada digitalitzadaEn la actualidad no se ha descrito ningún procedimiento de medida de referencia para la medición de la concentración de masa de la isoenzima 2 de la creatina-quinasa, por lo que para la asignación de un valor de concentración de masa al material de referencia BCR 608 se siguió la siguiente estrategia: en la campaña de certificación se midió la concentración de masa del material mediante inmunoanálisis de distintas características, utilizando como calibrador una solución purificada de creatina-quinasa 2 a la que previamente se le había asignado un valor de concentración de proteína mediante el procedimiento de Doetsch, utilizando como calibrador el material de referencia SRM 927b con un valor de concentración de proteína certificado. La creatina-quinasa 2 se purificó a partir de músculo cardiaco humano. A la solución purificada se le asignó un valor de concentración de proteína por el procedimiento de Doetsch de 124,3 mg/L, diluyéndose hasta una concentración de 80,362 mg/L para poder ser utilizada como calibrador en los distintos inmunoanálisis. El valor certificado de concentración de masa de la creatina-quinasa 2 del material de referencia BCR 608 fue de 94,5 mg/L con una incertidumbre asociada de 9,6 mg/L.This report describes the certification of a mass concentration value to the already prepared creatine kinase 2 reference material (BCR 608) with a catalytic concentration assigned value. At present, a mass creatine kinase 2 reference method have not been described. For this reason, we measured the BCR 608 mass concentration in different immunoassays using a creatine kinase 2 purified solution as a calibrator. Previously, the protein concentration of the creatine kinase 2 solution was measured by Doestch method using the reference material SRM 927b as calibrator. Creatine kinase 2 was purified from human heart. A protein concentration value of 124.30 mg/L was assigned to the solution of purified creatine kinase 2 by Doetsch method, and then this solution was diluted to obtain a liquid standard of known protein concentration (80.36 mg/L) to calibrate the immunoassays. The mass concentration of creatine kinase 2 in the BCR 608 reference material was certified to be 94.5 mg/L with an associated uncertainty of 9.6 mg/L
Desarrollo de nuevas herramientas en biopsia líquida aplicadas a cáncer de mama y gliomas
No full textEl càncer de mama i els gliomes són dos dels tumors amb més impacte en la societat actual: un per ser el més prevalent i amb més incidència i l'altre per la dificultat de detecció i l'alt índex de mortalitat. Tot i els avenços en el camp de l'oncologia clínica, diagnòstic, pronòstic, monitorització i predicció de teràpia, encara queda molt camí per assolir una medicina personalitzada. L'auge de noves eines com la biòpsia líquida (BL), es presenta com una oportunitat per reforçar la detecció precoç; el seguiment de l'evolució del tumor; l'avaluació de la resposta a un tractament determinat; la detecció de mutacions accionables i el descobriment de nous biomarcadors. El gran repte de la BL és la detecció dels compostos que realment han estat alliberats pel tumor. Les tecnologies que, amb un límit de detecció suficient, permeten detectar alteracions genètiques procedents del tumor, suposen una inversió econòmica ingent per gran part dels laboratoris. En aquest sentit, les vesícules extracel·lulars (VEs) són una de les fonts de biomarcadors més investigades, ja que el seu aïllament pot augmentar la representació d'àcids nucleics procedents del tumor. Tot i això, el seu aïllament i detecció suposa d'uns requeriments tècnics no disponibles per a tots els laboratoris. En aquesta tesi presentem un protocol d'aïllament de VEs amb un rendiment superior als mètodes de referència més utilitzats. Així mateix, analitzem dos tipus de biomarcadors genètics extrets a partir de les VEs aïllades: miARN als tumors mamaris i ADN als tumors glials. De totes les molècules presents a les VEs, els miARNs són els que estan captant més interès dins de la comunitat científica. En aquesta investigació, proposem per primera vegada l'anàlisi d'expressió relativa de miARNs de VEs per a l'estratificació de la resposta a la quimioteràpia neoadjuvant en pacients amb càncer de mama d'aquells fenotips que presenten una clínica més agressiva, que els hem anomenat fenotips extrems: HER2 sobreexpressat, luminal B amb HER2 sobreexpressat i triple negatiu. També s'ofereix una alternativa cost-efectiva per a la detecció de la mutació IDH1R132H en ADN de VEs procedents pacients amb glioma. La tecnologia aquí descrita és independent tant de mètodes clàssics (seqüenciació i RT-q-PCR), com de tecnologies d'última generació (PCR digital i seqüenciació de nova generació) podent-se instaurar en qualsevol laboratori mínimament equipat. Encara més, aquesta tècnica és extensible a altres alteracions genètiques d'interès en gliomes i altres patologies.El cáncer de mama y los gliomas son dos de los tumores con más impacto en la sociedad actual: uno por ser el más prevalente y con una mayor incidencia y el otro por su dificultad de detección y su alto índice de mortalidad. A pesar de los avances en el campo de la oncología clínica, diagnóstico, pronóstico, monitorización y predicción de terapia, aún queda mucho camino para alcanzar una medicina personalizada. El auge de nuevas herramientas como la biopsia líquida (BL), se presenta como una oportunidad para reforzar la detección precoz; el seguimiento de la evolución del tumor; la evaluación de la respuesta a un determinado tratamiento; la detección de mutaciones accionables y el descubrimiento de nuevos biomarcadores. El gran reto de la BL es la detección de aquellos compuestos que realmente han sido liberados por el tumor. Las tecnologías que, con un límite de detección suficiente, permiten hallar alteraciones genéticas procedentes del tumor, suponen una inversión económica ingente por parte de los laboratorios. En este sentido, las vesículas extracelulares (VEs) son una de las fuentes de biomarcadores más investigadas, ya que su aislamiento puede aumentar la representación de ácidos nucleicos procedentes del tumor. Sin embargo, su aislamiento y detección, supone de unos requerimientos técnicos no disponibles para todos los laboratorios. En esta tesis presentamos un protocolo de aislamiento de VEs con un rendimiento superior a los métodos de referencia más usados. Asimismo, analizamos dos tipos de biomarcadores genéticos extraídos a partir de las VEs: miARN en los tumores mamarios y ADN en los tumores gliales. De todas las moléculas presentes en las VEs, los miARNs son los que están captando mayor interés dentro de la comunidad científica. En esta investigación, proponemos por primera vez el análisis de expresión relativa de miARNs en VEs para la estratificación de la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante en pacientes con cáncer de mama con fenotipos que presentan una clínica más agresiva, que denominamos fenotipos extremos: HER2 sobreexpresado, luminal B con HER2 sobreexpresado y triple negativo. También se ofrece una alternativa coste-efectiva en cuanto a la detección de la mutación IDH1R132H en ADN de VEs procedentes de pacientes con glioma. La tecnología aquí descrita es independiente tanto de métodos clásicos (secuenciación y RT-q-PCR), como de tecnologías de última generación (PCR digital y secuenciación de nueva generación), pudiéndose instaurar en cualquier laboratorio mínimamente equipado. Más aún, esta técnica es extensible a otras alteraciones genéticas de interés en gliomas y otras patologías.Breast cancer and gliomas are two of the tumors with the greatest impact on today's society. Breast cancer is the most prevalent tumor and has the highest incidence, and gliomas for its difficulty in detection and its high mortality rate. Despite advances in the field of clinical oncology, diagnosis, prognosis, monitoring and therapy prediction, there is still a long way to go to achieve personalized medicine. The rise of new tools such as liquid biopsy (LB), is presented as an opportunity to reinforce early detection; monitoring of tumor evolution; the evaluation of the response to a treatment; the detection of actionable mutation changes and the discovery of new biomarkers. The great challenge of LB is the detection of those compounds that have truly been released by the tumor. The technologies that, with a sufficient detection limit, make it possible to find genetic alterations derived from the tumour, represent a huge economic investment by laboratories. In this way, extracellular vesicles (EVs) are one of the most investigated sources of biomarkers since their isolation can increase the representation of tumor nucleic acids. However, its isolation and detection entail technical requirements that are not available to all laboratories. In this thesis we present a protocol for isolating EVs with a higher yield than the most used reference methods. We also analysed two types of genetic biomarkers extracted from isolated EVs: miRNA in breast tumors and DNA in glioma. Out of all the molecules contained in the EVs, miRNAs are the ones that are attracting the most interest within the scientific community. Here, we propose for the first time the analysis of relative expression of miRNAs in VEs for the stratification of response to neoadjuvant chemotherapy in patients with most aggressive breast cancer types: HER2 overexpressed, luminal B with HER2 overexpressed and triple negative. Which we call them extreme phenotypes. In addition, we present a cost-effective alternative for the detection of the IDH1R132H mutation in DNA from EVs from glioma patients. The technology described here is independent of both classical methods (sequencing and RT-q-PCR) and cutting-edge technologies (digital PCR and next-generation sequencing), so it can be installed in any minimally equipped laboratory
- …
