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Valorização tecnológica de subprodutos de maçã minimamente processada: preparação e avaliação da funcionalidade de farinha de maçã na substituição de farinha de trigo em bolos tipo “queque”
No full textAs indústrias de processamento de maçã geram enormes quantidades de resíduos sólidos e líquidos. Os resíduos sólidos consistem numa mistura de casca, polpa e sementes que representam um grave problema ambiental quando eliminados.
Pesquisas têm demonstrado que estes subprodutos podem ter um alto valor nutricional. Posto isto, a identificação de formas de incorporar os subprodutos do processamento da maçã, como um ingrediente alimentar saudável na dieta humana, pode proporcionar muitos benefícios para a saúde. Além disso, a utilização do subproduto poderá também trazer benefícios para a indústria da maçã, podendo ser uma solução para os problemas ambientais associados à sua eliminação.
O foco principal deste estudo foi sobre as propriedades nutricionais e funcionais dos subprodutos do processamento de maçã e as suas potenciais aplicações como novo ingrediente nutricional em alimentos. Este novo ingrediente alimentar (farinha de maçã) apresenta benefícios nutricionais, como fibra dietética, vitaminas, minerais e compostos fenólicos. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto sobre as propriedades físicas e químicas dos queques com incorporação de diferentes quantidades de farinha de maçã.
Os queques foram preparados a partir de misturas de farinha de trigo contendo 0-35% de farinha de maçã. O nível mais elevado de substituição de farinha de maçã (35%) apresentou um efeito adverso significativo sobre as características de cozimento.
A farinha de maçã obtida no presente estudo continha 7,46% de humidade, 1,90% de cinzas, 5,80% de proteína bruta e 2,90% de fibra bruta. A quantidade total de polifenóis na farinha de maçã foi de 5,518 mg de equivalente de ácido gálico / g extrato.
A luminosidade (L*) do queque diminuiu à medida que se aumentou os níveis de farinha de maçã. Queques com 25% de farinha de maçã apresentaram maior firmeza do que o controlo e do que queques com menor quantidade de farinha de maçã. Esta característica também foi verificada na altura do queque. Com teores de farinha de maçã mais elevados (25%), os queques não expandiram como o esperado (controlo – 0% de farinha de maçã).
Os resultados deste estudo demonstraram que a farinha de maçã pode ser utilizada na preparação de ingredientes alimentares para incorporação, por exemplo em queques, conferindo-lhes características relevantes, como um maior conteúdo de minerais, fibras e compostos fenólicos, em comparação com queques não enriquecidos.
Portanto, a exploração industrial da farinha de maçã como ingrediente alimentar saudável, parece ser promissor para a indústria de panificação
A molecular imaging approach to cystic fibrosis
No full textTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana. É caracterizada por um mau funcionamento ao nível pulmonar, pancreático, gastrointestinal e reprodutivo, embora a principal causa de morbilidade e mortalidade se deva à progressiva disfunção pulmonar. A elevada concentração de electrólitos no suor constitui também uma das principais características da doença, sendo o teste do suor utilizado no seu diagnóstico. A FQ é causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) que codifica uma proteína, também denominada CFTR, expressa na membrana apical de células epiteliais. Esta proteína funciona maioritariamente como um canal de iões cloreto activado por AMP cíclico. Até à data, 1939 mutações no gene CFTR foram identificadas, embora para a maioria não exista uma evidência directa de que sejam causadoras de doença. As mutações causadoras de doença podem provocar uma redução dos níveis de CFTR na membrana plasmática (por redução da sua síntese ou por defeito no seu tráfego intracelular) ou a perda de capacidade de abertura do canal (gating)/conductância de aniões, mas ambas as situações resultam na perda do transporte de iões cloreto mediado pela CFTR. A mutação causadora de doença mais comum consiste na delecção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 (F508del), estando presente em cerca de 90% dos pacientes. Embora a identificação do gene CFTR tenha contribuído para um melhor conhecimento da doença e para o seu diagnóstico, o tratamento de pacientes com FQ ainda é maioritariamente baseado na atenuação dos sintomas inerentes à doença. Nos últimos anos, novas potenciais terapias baseadas em fármacos (moduladores) que corrigem os defeitos de tráfego e função da CFTR têm emergido. Os moduladores podem ser correctores, que corrigem o defeito de tráfego da CFTR, aumentando assim a quantidade de proteína expressa na membrana plasmática, ou potenciadores, que corrigem o defeito no gating do canal, estimulando a sua actividade. Vários correctores e potenciadores da CFTR têm sido identificados e recentemente um potenciador (ivacaftor) foi aprovado para uso clínico nos EUA. Adicionalmente, uma terapia combinada usando um corrector (lumacaftor) e um potenciador (ivacaftor) encontra-se em fase III de ensaios clínicos para pacientes homozigóticos para a mutação F508del. Contudo, a eficácia da correcção farmacológica do defeito de tráfego da CFTR mutante é actualmente avaliada em relação a alterações na concentração de iões cloreto no suor, diferença de potencial nasal ou função respiratória, não existindo qualquer método capaz de detectar a presença da CFTR na membrana plasmática em organismos vivos, após tratamento com correctores. Assim, o desenvolvimento de um método não-invasivo capaz de detectar a presença da CFTR na membrana plasmática seria bastante vantajoso na medida em que permitiria a avaliação da eficácia de terapias usando correctores, mas também a avaliação de quais os pacientes indicados para receber uma terapia baseada em potenciadores. A Imagiologia Molecular poderá ser a ferramenta necessária para colmatar a falta de um método capaz de detectar a CFTR na membrana plasmática. Esta é definida como a visualização, caracterização e quantificação in vivo de processos bioquímicos ou biológicos a nível molecular, permitindo a visualização não-invasiva de uma molécula alvo in vivo devido à sua interacção com uma sonda de imagiologia molecular. Assim, o trabalho apresentado nesta tese teve como principal objectivo o desenvolvimento de sondas radioactivas não-invasivas capazes de detectar a expressão da CFTR normal e da CFTR F508del corrigida, na membrana plasmática de células epiteliais pulmonares humanas. Estas sondas radioactivas foram baseadas em dois anticorpos anti-CFTR específicos para uma zona extracelular da CFTR, ECL1 e MA1-935, e em duas pequenas moléculas orgânicas conhecidas por inibir a função da CFTR, CFTRinh-172a e GPinh-5a. O isótopo 99mTc foi o escolhido para a marcação das biomoléculas devido às suas excelentes propriedades físicas e ao seu baixo custo e fácil obtenção. No geral, o trabalho foi dividido em duas grandes partes: marcação radioactiva de anticorpos anti-CFTR e marcação radioactiva de inibidores da CFTR. Relativamente aos anticorpos anti-CFTR, inicialmente caracterizaram-se as soluções contendo os anticorpos por SDS-PAGE, tendo-se concluído que ambas as soluções de anticorpo necessitavam de uma purificação prévia antes da marcação radioactiva. Após a eficiente purificação do anticorpo ECL1 através de um sistema de purificação adequado para IgGs e, devido a várias questões metodológicas, o trabalho prosseguiu apenas com o estudo do anticorpo ECL1 como sonda radioactiva para a detecção da CFTR. De seguida, procedeu-se à marcação do anticorpo ECL1 pelo método directo com 99mTc(I) através de grupos sulfidril presentes no anticorpo após redução. O anticorpo ECL1 reagiu com o precursor fac‐[99mTc(H2O)3(CO)3]+, tendo sido testadas várias proporções relativas entre ambos. Contudo, o rendimento máximo obtido, de entre várias marcações, foi de apenas 11% após 4 horas de incubação. Tendo em conta o insucesso na marcação do anticorpo ECL1 com 99mTc(I), uma estratégia alternativa foi adoptada: a marcação radioactiva também pelo método directo com 99mTc(IV), através do uso de um ligando competidor, o MDP, como agente transquelante. Para tal, inicialmente optimizaram-se as condições de marcação com 99mTc(IV) utilizando o anticorpo IOR-CEA1, uma imunoglobulina G, tal como o anticorpo ECL1. Observou-se que quanto mais elevada era a concentração de IOR-CEA1, mais elevado o rendimento de marcação, obtendo-se um rendimento máximo de 72% para a concentração de IOR-CEA1 mais elevada (0.33 mg/mL). Assim, concluiu-se que o rendimento de marcação era dependente da concentração de anticorpo utilizada. De seguida, o anticorpo ECL1 foi marcado com 99mTc(IV), reproduzindo-se as condições de marcação do anticorpo IOR-CEA1 em que se obteve o rendimento de marcação mais elevado. Contudo, e ao contrário da marcação com 99mTc(I) em que se atingiu um rendimento de marcação de 11%, não foi observado qualquer anticorpo ECL1 marcado. A segunda parte do trabalho consistiu na marcação radioactiva dos inibidores da CFTR, CFTRinh-172a e GPinh-5a, com a unidade fac-[99mTc(CO)3]+, através do método indirecto, utilizando a estratégia do ligando bifuncional. Para tal, sintetizou-se o ligando bifuncional L1, contendo uma unidade quelante pirazolo-diamina, um espaçador propilénico e um grupo funcional -NH2 para posterior conjugação aos inibidores. De seguida, conjugou-se o inibidor CFTRinh-172a, contendo um grupo funcional -COOH, ao ligando L1, resultando no bioconjugado final B1. Este reagiu com os precursores do tipo fac-[M(H2O)3(CO)3]+ (M = Re/99mTc), de modo a obter complexos do tipo fac-[M(CO)3(κ3-B1)]+ (M = Re/99mTc; Re1/ Tc1). O complexo Re1 foi obtido com rendimento moderado (55%) e a coordenação tridentada da unidade quelante pirazolo-diamina ao metal confirmada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear através do carácter diastereotópico apresentado pelos protões pertencentes a essa unidade quelante. Contudo não foi possível obter o complexo Tc1, e tal foi confirmado através da comparação do perfil cromatográfico do complexo Re1 com o produto obtido da marcação de B1. Tendo em conta que uma das causas para a falha na marcação poderia ser a degradação do bioconjugado B1, mais concretamente, a unidade correspondente ao inibidor CFTRinh-172a, devido à elevada temperatura de marcação (100 °C), a estabilidade do inibidor CFTRinh-172a a 100 °C foi avaliada. Foi possível concluir que a degradação do inibidor tende a aumentar com o aumento do tempo de incubação a 100 °C. Paralelamente, o inibidor GPinh-5a, contendo também um grupo funcional -COOH, foi conjugado ao ligando L1. Contudo, após várias tentativas de purificação, não foi possível a obtenção do bioconjugado final B2 com elevada pureza. Consequentemente, não foi possível a síntese dos complexos do tipo fac-[M(CO)3(κ3-B2)]+ , tal como aconteceu para B1. Em suma, o principal objectivo do trabalho, isto é, o desenvolvimento de sondas marcadas radioactivamente, baseadas em anticorpos anti-CFTR e em inibidores da CFTR, para detecção da expressão da CFTR, não foi totalmente atingido.
Relativamente à primeira parte do trabalho, embora a marcação do anticorpo ECL1 com 99mTc(I) e 99mTc(IV) não tenha sido bem sucedida, todos os resultados contribuíram para a optimização da marcação do anticorpo e serão bastante úteis em estudos futuros. Embora a marcação radioactiva de ambos os inibidores com 99mTc(I) também não tenha sido atingida, vários objectivos intercalares foram atingidos, como a síntese e caracterização do ligando bifuncional L1, dos bioconjugados B1 e B2-Boc e do complexo de rénio Re1.Cystic Fibrosis is caused by mutations in the CFTR gene, which encodes the CFTR protein, a chloride channel expressed in the apical membrane of epithelial cells. Therapies based in drugs that correct the trafficking (correctors) or the gating (potentiatiors) defects of CFTR are emerging. However, there is no available methodology to detect the expression of normal and rescued CFTR at the membrane in living organisms, after treatment with correctors. Molecular Imaging can be the solution, since it allows the noninvasive visualization of a target molecule in vivo by virtue of its interaction with a molecular imaging probe. The major goal of this thesis was the development of radiolabelled imaging probes for the detection of normal and rescued F508del-CFTR at the PM of human epithelial pulmonary cells. These probes were based on two anti-CFTR antibodies (ECL1 and MA1-935) and two CFTR inhibitors (CFTRinh-172a and GPinh-5a) and the 99mTc radioisotope was the chosen radionuclide. In the first part of the work, ECL1 antibody was purified and radiolabelled by the direct method, either with 99mTc(I) or 99mTc(IV). In the radiolabelling with 99mTc(I), the highest radiolabelling yield obtained was 11%. Optimization of the radiolabelling with 99mTc(IV) was performed with the antibody IOR-CEA1, and the conditions presenting the highest radiolabelling yield reproduced for the ECL1 antibody. However, no radiolabelled ECL1 could be obtained. In the second part, the bifunctional chelator L1 was synthesized in order to radiolabel the CFTR inhibitors with 99mTc(I) using the bifunctional chelator approach. The inhibitors CFTRinh-172a and GPinh-5a were successfully conjugated to L1, yielding, respectively, the bioconjugates B1 and B2-Boc. The final bioconjugate B1 reacted with the fac-[M(H2O)3(CO)3]+ (M = Re/99mTc) precursors, to give the complexes of the type fac-[M(CO)3(κ3-B1)]+ (M = Re/99mTc; Re1/ Tc1), but only Re1 was obtained
A molecular imaging approach to cystic fibrosis
No full textTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana. É caracterizada por um mau funcionamento ao nível pulmonar, pancreático, gastrointestinal e reprodutivo, embora a principal causa de morbilidade e mortalidade se deva à progressiva disfunção pulmonar. A elevada concentração de electrólitos no suor constitui também uma das principais características da doença, sendo o teste do suor utilizado no seu diagnóstico. A FQ é causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) que codifica uma proteína, também denominada CFTR, expressa na membrana apical de células epiteliais. Esta proteína funciona maioritariamente como um canal de iões cloreto activado por AMP cíclico. Até à data, 1939 mutações no gene CFTR foram identificadas, embora para a maioria não exista uma evidência directa de que sejam causadoras de doença. As mutações causadoras de doença podem provocar uma redução dos níveis de CFTR na membrana plasmática (por redução da sua síntese ou por defeito no seu tráfego intracelular) ou a perda de capacidade de abertura do canal (gating)/conductância de aniões, mas ambas as situações resultam na perda do transporte de iões cloreto mediado pela CFTR. A mutação causadora de doença mais comum consiste na delecção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 (F508del), estando presente em cerca de 90% dos pacientes. Embora a identificação do gene CFTR tenha contribuído para um melhor conhecimento da doença e para o seu diagnóstico, o tratamento de pacientes com FQ ainda é maioritariamente baseado na atenuação dos sintomas inerentes à doença. Nos últimos anos, novas potenciais terapias baseadas em fármacos (moduladores) que corrigem os defeitos de tráfego e função da CFTR têm emergido. Os moduladores podem ser correctores, que corrigem o defeito de tráfego da CFTR, aumentando assim a quantidade de proteína expressa na membrana plasmática, ou potenciadores, que corrigem o defeito no gating do canal, estimulando a sua actividade. Vários correctores e potenciadores da CFTR têm sido identificados e recentemente um potenciador (ivacaftor) foi aprovado para uso clínico nos EUA. Adicionalmente, uma terapia combinada usando um corrector (lumacaftor) e um potenciador (ivacaftor) encontra-se em fase III de ensaios clínicos para pacientes homozigóticos para a mutação F508del. Contudo, a eficácia da correcção farmacológica do defeito de tráfego da CFTR mutante é actualmente avaliada em relação a alterações na concentração de iões cloreto no suor, diferença de potencial nasal ou função respiratória, não existindo qualquer método capaz de detectar a presença da CFTR na membrana plasmática em organismos vivos, após tratamento com correctores. Assim, o desenvolvimento de um método não-invasivo capaz de detectar a presença da CFTR na membrana plasmática seria bastante vantajoso na medida em que permitiria a avaliação da eficácia de terapias usando correctores, mas também a avaliação de quais os pacientes indicados para receber uma terapia baseada em potenciadores. A Imagiologia Molecular poderá ser a ferramenta necessária para colmatar a falta de um método capaz de detectar a CFTR na membrana plasmática. Esta é definida como a visualização, caracterização e quantificação in vivo de processos bioquímicos ou biológicos a nível molecular, permitindo a visualização não-invasiva de uma molécula alvo in vivo devido à sua interacção com uma sonda de imagiologia molecular. Assim, o trabalho apresentado nesta tese teve como principal objectivo o desenvolvimento de sondas radioactivas não-invasivas capazes de detectar a expressão da CFTR normal e da CFTR F508del corrigida, na membrana plasmática de células epiteliais pulmonares humanas. Estas sondas radioactivas foram baseadas em dois anticorpos anti-CFTR específicos para uma zona extracelular da CFTR, ECL1 e MA1-935, e em duas pequenas moléculas orgânicas conhecidas por inibir a função da CFTR, CFTRinh-172a e GPinh-5a. O isótopo 99mTc foi o escolhido para a marcação das biomoléculas devido às suas excelentes propriedades físicas e ao seu baixo custo e fácil obtenção. No geral, o trabalho foi dividido em duas grandes partes: marcação radioactiva de anticorpos anti-CFTR e marcação radioactiva de inibidores da CFTR. Relativamente aos anticorpos anti-CFTR, inicialmente caracterizaram-se as soluções contendo os anticorpos por SDS-PAGE, tendo-se concluído que ambas as soluções de anticorpo necessitavam de uma purificação prévia antes da marcação radioactiva. Após a eficiente purificação do anticorpo ECL1 através de um sistema de purificação adequado para IgGs e, devido a várias questões metodológicas, o trabalho prosseguiu apenas com o estudo do anticorpo ECL1 como sonda radioactiva para a detecção da CFTR. De seguida, procedeu-se à marcação do anticorpo ECL1 pelo método directo com 99mTc(I) através de grupos sulfidril presentes no anticorpo após redução. O anticorpo ECL1 reagiu com o precursor fac‐[99mTc(H2O)3(CO)3]+, tendo sido testadas várias proporções relativas entre ambos. Contudo, o rendimento máximo obtido, de entre várias marcações, foi de apenas 11% após 4 horas de incubação. Tendo em conta o insucesso na marcação do anticorpo ECL1 com 99mTc(I), uma estratégia alternativa foi adoptada: a marcação radioactiva também pelo método directo com 99mTc(IV), através do uso de um ligando competidor, o MDP, como agente transquelante. Para tal, inicialmente optimizaram-se as condições de marcação com 99mTc(IV) utilizando o anticorpo IOR-CEA1, uma imunoglobulina G, tal como o anticorpo ECL1. Observou-se que quanto mais elevada era a concentração de IOR-CEA1, mais elevado o rendimento de marcação, obtendo-se um rendimento máximo de 72% para a concentração de IOR-CEA1 mais elevada (0.33 mg/mL). Assim, concluiu-se que o rendimento de marcação era dependente da concentração de anticorpo utilizada. De seguida, o anticorpo ECL1 foi marcado com 99mTc(IV), reproduzindo-se as condições de marcação do anticorpo IOR-CEA1 em que se obteve o rendimento de marcação mais elevado. Contudo, e ao contrário da marcação com 99mTc(I) em que se atingiu um rendimento de marcação de 11%, não foi observado qualquer anticorpo ECL1 marcado. A segunda parte do trabalho consistiu na marcação radioactiva dos inibidores da CFTR, CFTRinh-172a e GPinh-5a, com a unidade fac-[99mTc(CO)3]+, através do método indirecto, utilizando a estratégia do ligando bifuncional. Para tal, sintetizou-se o ligando bifuncional L1, contendo uma unidade quelante pirazolo-diamina, um espaçador propilénico e um grupo funcional -NH2 para posterior conjugação aos inibidores. De seguida, conjugou-se o inibidor CFTRinh-172a, contendo um grupo funcional -COOH, ao ligando L1, resultando no bioconjugado final B1. Este reagiu com os precursores do tipo fac-[M(H2O)3(CO)3]+ (M = Re/99mTc), de modo a obter complexos do tipo fac-[M(CO)3(κ3-B1)]+ (M = Re/99mTc; Re1/ Tc1). O complexo Re1 foi obtido com rendimento moderado (55%) e a coordenação tridentada da unidade quelante pirazolo-diamina ao metal confirmada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear através do carácter diastereotópico apresentado pelos protões pertencentes a essa unidade quelante. Contudo não foi possível obter o complexo Tc1, e tal foi confirmado através da comparação do perfil cromatográfico do complexo Re1 com o produto obtido da marcação de B1. Tendo em conta que uma das causas para a falha na marcação poderia ser a degradação do bioconjugado B1, mais concretamente, a unidade correspondente ao inibidor CFTRinh-172a, devido à elevada temperatura de marcação (100 °C), a estabilidade do inibidor CFTRinh-172a a 100 °C foi avaliada. Foi possível concluir que a degradação do inibidor tende a aumentar com o aumento do tempo de incubação a 100 °C. Paralelamente, o inibidor GPinh-5a, contendo também um grupo funcional -COOH, foi conjugado ao ligando L1. Contudo, após várias tentativas de purificação, não foi possível a obtenção do bioconjugado final B2 com elevada pureza. Consequentemente, não foi possível a síntese dos complexos do tipo fac-[M(CO)3(κ3-B2)]+ , tal como aconteceu para B1. Em suma, o principal objectivo do trabalho, isto é, o desenvolvimento de sondas marcadas radioactivamente, baseadas em anticorpos anti-CFTR e em inibidores da CFTR, para detecção da expressão da CFTR, não foi totalmente atingido.
Relativamente à primeira parte do trabalho, embora a marcação do anticorpo ECL1 com 99mTc(I) e 99mTc(IV) não tenha sido bem sucedida, todos os resultados contribuíram para a optimização da marcação do anticorpo e serão bastante úteis em estudos futuros. Embora a marcação radioactiva de ambos os inibidores com 99mTc(I) também não tenha sido atingida, vários objectivos intercalares foram atingidos, como a síntese e caracterização do ligando bifuncional L1, dos bioconjugados B1 e B2-Boc e do complexo de rénio Re1.Cystic Fibrosis is caused by mutations in the CFTR gene, which encodes the CFTR protein, a chloride channel expressed in the apical membrane of epithelial cells. Therapies based in drugs that correct the trafficking (correctors) or the gating (potentiatiors) defects of CFTR are emerging. However, there is no available methodology to detect the expression of normal and rescued CFTR at the membrane in living organisms, after treatment with correctors. Molecular Imaging can be the solution, since it allows the noninvasive visualization of a target molecule in vivo by virtue of its interaction with a molecular imaging probe. The major goal of this thesis was the development of radiolabelled imaging probes for the detection of normal and rescued F508del-CFTR at the PM of human epithelial pulmonary cells. These probes were based on two anti-CFTR antibodies (ECL1 and MA1-935) and two CFTR inhibitors (CFTRinh-172a and GPinh-5a) and the 99mTc radioisotope was the chosen radionuclide. In the first part of the work, ECL1 antibody was purified and radiolabelled by the direct method, either with 99mTc(I) or 99mTc(IV). In the radiolabelling with 99mTc(I), the highest radiolabelling yield obtained was 11%. Optimization of the radiolabelling with 99mTc(IV) was performed with the antibody IOR-CEA1, and the conditions presenting the highest radiolabelling yield reproduced for the ECL1 antibody. However, no radiolabelled ECL1 could be obtained. In the second part, the bifunctional chelator L1 was synthesized in order to radiolabel the CFTR inhibitors with 99mTc(I) using the bifunctional chelator approach. The inhibitors CFTRinh-172a and GPinh-5a were successfully conjugated to L1, yielding, respectively, the bioconjugates B1 and B2-Boc. The final bioconjugate B1 reacted with the fac-[M(H2O)3(CO)3]+ (M = Re/99mTc) precursors, to give the complexes of the type fac-[M(CO)3(κ3-B1)]+ (M = Re/99mTc; Re1/ Tc1), but only Re1 was obtained
A molecular imaging approach to cystic fibrosis
No full textTese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013A Fibrose Quística (FQ) é a doença autossómica recessiva letal mais comum na população caucasiana. É caracterizada por um mau funcionamento ao nível pulmonar, pancreático, gastrointestinal e reprodutivo, embora a principal causa de morbilidade e mortalidade se deva à progressiva disfunção pulmonar. A elevada concentração de electrólitos no suor constitui também uma das principais características da doença, sendo o teste do suor utilizado no seu diagnóstico. A FQ é causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) que codifica uma proteína, também denominada CFTR, expressa na membrana apical de células epiteliais. Esta proteína funciona maioritariamente como um canal de iões cloreto activado por AMP cíclico. Até à data, 1939 mutações no gene CFTR foram identificadas, embora para a maioria não exista uma evidência directa de que sejam causadoras de doença. As mutações causadoras de doença podem provocar uma redução dos níveis de CFTR na membrana plasmática (por redução da sua síntese ou por defeito no seu tráfego intracelular) ou a perda de capacidade de abertura do canal (gating)/conductância de aniões, mas ambas as situações resultam na perda do transporte de iões cloreto mediado pela CFTR. A mutação causadora de doença mais comum consiste na delecção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 (F508del), estando presente em cerca de 90% dos pacientes. Embora a identificação do gene CFTR tenha contribuído para um melhor conhecimento da doença e para o seu diagnóstico, o tratamento de pacientes com FQ ainda é maioritariamente baseado na atenuação dos sintomas inerentes à doença. Nos últimos anos, novas potenciais terapias baseadas em fármacos (moduladores) que corrigem os defeitos de tráfego e função da CFTR têm emergido. Os moduladores podem ser correctores, que corrigem o defeito de tráfego da CFTR, aumentando assim a quantidade de proteína expressa na membrana plasmática, ou potenciadores, que corrigem o defeito no gating do canal, estimulando a sua actividade. Vários correctores e potenciadores da CFTR têm sido identificados e recentemente um potenciador (ivacaftor) foi aprovado para uso clínico nos EUA. Adicionalmente, uma terapia combinada usando um corrector (lumacaftor) e um potenciador (ivacaftor) encontra-se em fase III de ensaios clínicos para pacientes homozigóticos para a mutação F508del. Contudo, a eficácia da correcção farmacológica do defeito de tráfego da CFTR mutante é actualmente avaliada em relação a alterações na concentração de iões cloreto no suor, diferença de potencial nasal ou função respiratória, não existindo qualquer método capaz de detectar a presença da CFTR na membrana plasmática em organismos vivos, após tratamento com correctores. Assim, o desenvolvimento de um método não-invasivo capaz de detectar a presença da CFTR na membrana plasmática seria bastante vantajoso na medida em que permitiria a avaliação da eficácia de terapias usando correctores, mas também a avaliação de quais os pacientes indicados para receber uma terapia baseada em potenciadores. A Imagiologia Molecular poderá ser a ferramenta necessária para colmatar a falta de um método capaz de detectar a CFTR na membrana plasmática. Esta é definida como a visualização, caracterização e quantificação in vivo de processos bioquímicos ou biológicos a nível molecular, permitindo a visualização não-invasiva de uma molécula alvo in vivo devido à sua interacção com uma sonda de imagiologia molecular. Assim, o trabalho apresentado nesta tese teve como principal objectivo o desenvolvimento de sondas radioactivas não-invasivas capazes de detectar a expressão da CFTR normal e da CFTR F508del corrigida, na membrana plasmática de células epiteliais pulmonares humanas. Estas sondas radioactivas foram baseadas em dois anticorpos anti-CFTR específicos para uma zona extracelular da CFTR, ECL1 e MA1-935, e em duas pequenas moléculas orgânicas conhecidas por inibir a função da CFTR, CFTRinh-172a e GPinh-5a. O isótopo 99mTc foi o escolhido para a marcação das biomoléculas devido às suas excelentes propriedades físicas e ao seu baixo custo e fácil obtenção. No geral, o trabalho foi dividido em duas grandes partes: marcação radioactiva de anticorpos anti-CFTR e marcação radioactiva de inibidores da CFTR. Relativamente aos anticorpos anti-CFTR, inicialmente caracterizaram-se as soluções contendo os anticorpos por SDS-PAGE, tendo-se concluído que ambas as soluções de anticorpo necessitavam de uma purificação prévia antes da marcação radioactiva. Após a eficiente purificação do anticorpo ECL1 através de um sistema de purificação adequado para IgGs e, devido a várias questões metodológicas, o trabalho prosseguiu apenas com o estudo do anticorpo ECL1 como sonda radioactiva para a detecção da CFTR. De seguida, procedeu-se à marcação do anticorpo ECL1 pelo método directo com 99mTc(I) através de grupos sulfidril presentes no anticorpo após redução. O anticorpo ECL1 reagiu com o precursor fac‐[99mTc(H2O)3(CO)3]+, tendo sido testadas várias proporções relativas entre ambos. Contudo, o rendimento máximo obtido, de entre várias marcações, foi de apenas 11% após 4 horas de incubação. Tendo em conta o insucesso na marcação do anticorpo ECL1 com 99mTc(I), uma estratégia alternativa foi adoptada: a marcação radioactiva também pelo método directo com 99mTc(IV), através do uso de um ligando competidor, o MDP, como agente transquelante. Para tal, inicialmente optimizaram-se as condições de marcação com 99mTc(IV) utilizando o anticorpo IOR-CEA1, uma imunoglobulina G, tal como o anticorpo ECL1. Observou-se que quanto mais elevada era a concentração de IOR-CEA1, mais elevado o rendimento de marcação, obtendo-se um rendimento máximo de 72% para a concentração de IOR-CEA1 mais elevada (0.33 mg/mL). Assim, concluiu-se que o rendimento de marcação era dependente da concentração de anticorpo utilizada. De seguida, o anticorpo ECL1 foi marcado com 99mTc(IV), reproduzindo-se as condições de marcação do anticorpo IOR-CEA1 em que se obteve o rendimento de marcação mais elevado. Contudo, e ao contrário da marcação com 99mTc(I) em que se atingiu um rendimento de marcação de 11%, não foi observado qualquer anticorpo ECL1 marcado. A segunda parte do trabalho consistiu na marcação radioactiva dos inibidores da CFTR, CFTRinh-172a e GPinh-5a, com a unidade fac-[99mTc(CO)3]+, através do método indirecto, utilizando a estratégia do ligando bifuncional. Para tal, sintetizou-se o ligando bifuncional L1, contendo uma unidade quelante pirazolo-diamina, um espaçador propilénico e um grupo funcional -NH2 para posterior conjugação aos inibidores. De seguida, conjugou-se o inibidor CFTRinh-172a, contendo um grupo funcional -COOH, ao ligando L1, resultando no bioconjugado final B1. Este reagiu com os precursores do tipo fac-[M(H2O)3(CO)3]+ (M = Re/99mTc), de modo a obter complexos do tipo fac-[M(CO)3(κ3-B1)]+ (M = Re/99mTc; Re1/ Tc1). O complexo Re1 foi obtido com rendimento moderado (55%) e a coordenação tridentada da unidade quelante pirazolo-diamina ao metal confirmada por espectroscopia de ressonância magnética nuclear através do carácter diastereotópico apresentado pelos protões pertencentes a essa unidade quelante. Contudo não foi possível obter o complexo Tc1, e tal foi confirmado através da comparação do perfil cromatográfico do complexo Re1 com o produto obtido da marcação de B1. Tendo em conta que uma das causas para a falha na marcação poderia ser a degradação do bioconjugado B1, mais concretamente, a unidade correspondente ao inibidor CFTRinh-172a, devido à elevada temperatura de marcação (100 °C), a estabilidade do inibidor CFTRinh-172a a 100 °C foi avaliada. Foi possível concluir que a degradação do inibidor tende a aumentar com o aumento do tempo de incubação a 100 °C. Paralelamente, o inibidor GPinh-5a, contendo também um grupo funcional -COOH, foi conjugado ao ligando L1. Contudo, após várias tentativas de purificação, não foi possível a obtenção do bioconjugado final B2 com elevada pureza. Consequentemente, não foi possível a síntese dos complexos do tipo fac-[M(CO)3(κ3-B2)]+ , tal como aconteceu para B1. Em suma, o principal objectivo do trabalho, isto é, o desenvolvimento de sondas marcadas radioactivamente, baseadas em anticorpos anti-CFTR e em inibidores da CFTR, para detecção da expressão da CFTR, não foi totalmente atingido.
Relativamente à primeira parte do trabalho, embora a marcação do anticorpo ECL1 com 99mTc(I) e 99mTc(IV) não tenha sido bem sucedida, todos os resultados contribuíram para a optimização da marcação do anticorpo e serão bastante úteis em estudos futuros. Embora a marcação radioactiva de ambos os inibidores com 99mTc(I) também não tenha sido atingida, vários objectivos intercalares foram atingidos, como a síntese e caracterização do ligando bifuncional L1, dos bioconjugados B1 e B2-Boc e do complexo de rénio Re1.Cystic Fibrosis is caused by mutations in the CFTR gene, which encodes the CFTR protein, a chloride channel expressed in the apical membrane of epithelial cells. Therapies based in drugs that correct the trafficking (correctors) or the gating (potentiatiors) defects of CFTR are emerging. However, there is no available methodology to detect the expression of normal and rescued CFTR at the membrane in living organisms, after treatment with correctors. Molecular Imaging can be the solution, since it allows the noninvasive visualization of a target molecule in vivo by virtue of its interaction with a molecular imaging probe. The major goal of this thesis was the development of radiolabelled imaging probes for the detection of normal and rescued F508del-CFTR at the PM of human epithelial pulmonary cells. These probes were based on two anti-CFTR antibodies (ECL1 and MA1-935) and two CFTR inhibitors (CFTRinh-172a and GPinh-5a) and the 99mTc radioisotope was the chosen radionuclide. In the first part of the work, ECL1 antibody was purified and radiolabelled by the direct method, either with 99mTc(I) or 99mTc(IV). In the radiolabelling with 99mTc(I), the highest radiolabelling yield obtained was 11%. Optimization of the radiolabelling with 99mTc(IV) was performed with the antibody IOR-CEA1, and the conditions presenting the highest radiolabelling yield reproduced for the ECL1 antibody. However, no radiolabelled ECL1 could be obtained. In the second part, the bifunctional chelator L1 was synthesized in order to radiolabel the CFTR inhibitors with 99mTc(I) using the bifunctional chelator approach. The inhibitors CFTRinh-172a and GPinh-5a were successfully conjugated to L1, yielding, respectively, the bioconjugates B1 and B2-Boc. The final bioconjugate B1 reacted with the fac-[M(H2O)3(CO)3]+ (M = Re/99mTc) precursors, to give the complexes of the type fac-[M(CO)3(κ3-B1)]+ (M = Re/99mTc; Re1/ Tc1), but only Re1 was obtained
Desenvolvimento de bolachas isentas de glúten com farinha de arrôz e Spirulina
No full textMestrado em Engenharia Alimentar / Instituto Superior de AgronomiaNo mundo atual em que vivemos, assistimos a uma crescente procura de alimentos saudáveis, sem glúten, práticos e com propriedades funcionais. O objetivo deste estudo foi desenvolver bolachas isentas de glúten, doces e salgadas, com incorporação de diferentes concentrações de Spirulina (Arthrospira) platensis F&M-C256 (0%, 1%, 2%, 4% e 6% m/m). Desenvolveram-se várias formulações de bolachas doces e salgadas a partir de formulações base previamente otimizadas, em que se substituiu a farinha de trigo por farinha de arroz. No caso das bolachas doces foi também estudado diferentes concentrações de farinha de arroz (38 a 47% m/m), enquanto nas bolachas salgadas houve necessidade de adicionar um emulsionante (lecitina de soja), para que o produto final se aproxima-se o mais possível dos produtos-alvo à base de trigo. Foram analisadas características como a cor, a textura e a atividade da água, sendo que com o aumento do teor de Spirulina, as bolachas ficaram mais escuras, e com menor cromaticidade (L*, a*, b*). Em relação à textura as bolachas com incorporação de Spirulina revelaram maior firmeza e ao reduzir o teor de farinha de arroz, esta diminuiu. Relativamente à atividade da água, todas as bolachas apresentaram valores inferiores a 0,5. Em relação às propriedades reológicas das massas (antes da cozedura), verificou-se que para todas as formulações analisadas, o módulo G’ era superior ao módulo G’’, o que traduz um comportamento predominantemente elástico. As formulações de bolachas doces 6% Spirulina e 47% Farinha de arroz apresentaram valores de G’ significativamente (p<0,05) mais altos que as restantes formulações, o que se traduz numa maior estruturação. No estudo da diminuição do teor de farinha de arroz foi possível reduzir de 47% para 42% (m/m), de modo a manter os valores de G’ e G’’ semelhantes aos da massa controlo de trigo (produto-alvo). A composição química denotou uma maior diferença no teor proteico, observando-se um aumento significativo (p<0,05) entre as bolachas controlo e as bolachas com 2% de Spirulina, aumentando de 5,4 para 6,7 g/100g nas bolachas doces e de 7,7 para 9,9 g/100g nas bolachas salgadasN/
Desenvolvimento de bolachas isentas de glúten com farinha de arrôz e Spirulina
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Bicicleta e mobilidade interurbana. Estudo sobre a integração da bicicleta na rede do metro do Porto
No full textDissertação para obtenção do grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, ramo Ordenamento do Território e Impactes Ambientai
Gestor de bairro: contributo para a sustentabilidade local
No full textDissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, perfil Ordenamento do Território e Impactes Ambientai
Estudo do efeito do Country of Origin nos Produtos Açorianos: Mercados dos Lacticínios
No full textA presente dissertação visa estudar o impacto que o country of origin dos produtos lácteos açorianos detém junto dos consumidores, ou seja, se o fato do leite ser açoriano influencia o ato de compra dos mesmos.
Este estudo tem inicio num enquadramento teórico do tema, no qual se traduz a revisão da literatura, onde serão abordados e, consequentemente, aprofundados alguns conceitos fundamentais como o efeito do country of origin e o mercado dos lacticínios dos Açores.
Após concluída a parte teórica, foi feito um estudo, de modo a enquadrar o tema e, posteriormente, desvendar qual o estudo mais apropriado de maneira a responder à pergunta de partida desta investigação. Portanto, através de um estudo de mercado descritivo deu-se início à metodologia, com recurso a duas fases, fase qualitativa onde engloba uma estratégia explorativa que tem como finalidade elaborar a fase seguinte, a fase descritiva.
Com recurso aos inquéritos realizados, e a toda a investigação, foi possível concluir que o efeito do country of origin está presente nos produtos açorianos, mais precisamente no leite açoriano. Este é decisivo na escolha do consumidor, sendo assim, é dada grande importância à origem de produção dos produtos lácteos.The present dissertation aims to study the impact that the country of origin of the Azorean dairy products has to the consumers, in other words, if the Azorean milk is an important influence when choosing witch milk should we buy.
This study begins with a theoretical framework of the subject manner, whereupon the literature review bases on, where will be approached some of the basic fundamental concepts such as the effect of the country of origin and the Azorean dairy business.
After the conclusion of the theoretical part, a study was made, in order to frame up the theme and later on, to discover witch study is the most appropriate to answer the starting question of this dissertation. Therefore, trough a descriptive market study, the methodology was started, using two phases, qualitative phase where it includes an exploratory strategy whose purpose is to elaborate the following phase, the descriptive phase.
With the request and the whole investigation, it was possible to conclude that the effect of the country of origin is present in Azorean products, more precisely in Azorean milk. This is decisive in the choice of the consumer and, therefore, great importance is given to the origin of dairy production
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