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MicroRNAs as regulators of endothelial cell functions in cardiometabolic diseases
No full textEndothelial cells (ECs) provide nutrients and oxygen essential for tissue homeostasis. Metabolic imbalances and other environmental stimuli, like cytokines or low shear stress, trigger endothelial inflammation, increase permeability, compromise vascular tone, promote cell proliferation, and ultimately cause cell death. These factors contribute to EC dysfunction, which is crucial in the development of cardiometabolic diseases. microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that have important functions in the regulation of ECs. In the present review, we discuss the role of miRNAs in various aspects of EC pathology in cardiometabolic diseases like atherosclerosis, type 2 diabetes, obesity, and the metabolic syndrome, and in complication of those pathologies, like ischemia. We also discuss the potential therapeutic applications of miRNAs in promoting angiogenesis and neovascularization in tissues where the endothelium is damaged in different cardiometabolic diseases. This article is part of a Special Issue entitled: MicroRNAs and lipid/energy metabolism and related diseases edited by Carlos Fernandez-Hernando and Yajaira Suarez. (C) 2016 Elsevier B.V. All rights reserved
Improved repair of dermal wounds in mice lacking microRNA-155
No full textWound healing is a well-regulated but complex process that involves haemostasis, inflammation, proliferation and maturation. Recent reports suggest that microRNAs (miRs) play important roles in dermal wound healing. In fact, miR deregulation has been linked with impaired wound repair. miR-155 has been shown to be induced by inflammatory mediators and plays a central regulatory role in immune responses. We have investigated the potential role of miR-155 in wound healing. By creating punch wounds in the skin of mice, we found an increased expression of miR-155 in wound tissue when compared with healthy skin. Interestingly, analysis of wounds of mice lacking the expression of miR-155 (miR-155(-/-)) revealed an increased wound closure when compared with wild-type animals. Also, the accelerated wound closing correlated with elevated numbers of macrophages in wounded tissue. Gene expression analysis of wounds tissue and macrophages isolated from miR-155(-/-) mice that were treated with interleukin-4 demonstrated an increased expression of miR-155 targets (BCL6, RhoA and SHIP1) as well as, the finding in inflammatory zone-1 (FIZZ1) gene, when compared with WT mice. Moreover, the up-regulated levels of FIZZ1 in the wound tissue of miR-155(-/-) mice correlated with an increased deposition of type-1 collagens, a phenomenon known to be beneficial in wound closure. Our data indicate that the absence of miR-155 has beneficial effects in the wound healing process
Therapeutic potential of modulating microRNAs in atherosclerotic vascular disease
No full textAtherosclerosis (also known as arteriosclerotic vascular disease) is a chronic inflammatory disease of the arterial wall, characterized by the formation of lipid-laden lesions. The activation of endothelial cells at atherosclerotic lesion–prone sites in the arterial tree results in the up-regulation of cell adhesion molecules and chemokines, which mediate the recruitment of circulating monocytes. Accumulation of monocytes and monocyte-derived phagocytes in the wall of large arteries leads to chronic inflammation and the development and progression of atherosclerosis. The lesion experiences the following steps: foam cell formation, fatty streak accumulation, migration and proliferation of vascular smooth muscle cells, and fibrous cap formation. Finally, the rupture of the unstable fibrous cap causes thrombosis in complications of advanced lesions that leads to unstable coronary syndromes, myocardial infarction and stroke. MicroRNAs have recently emerged as a novel class of gene regulators at the post-transcriptional level. Several functions of vascular cells, such as cell differentiation, contraction, migration, proliferation and inflammation that are involved in angiogenesis, neointimal formation and lipid metabolism underlying various vascular diseases, have been found to be regulated by microRNAs and are described in the present review as well as their potential therapeutic application
miR-27b inhibits LDLR and ABCA1 expression but does not influence plasma and hepatic lipid levels in mice
No full textRationale: Recently, there has been significant interest in the therapeutic administration of miRNA mimics and inhibitors to treat cardiovascular disease. In particular, miR-27b has emerged as a regulatory hub in cholesterol and lipid metabolism and potential therapeutic target for treating atherosclerosis. Despite this, the impact of miR-27b on lipid levels in vivo remains to be determined. As such, here we set out to further characterize the role of miR-27b in regulating cholesterol metabolism in vitro and to determine the effect of miR-27b overexpression and inhibition on circulating and hepatic lipids in mice. Methods and results: Our results identify miR-27b as an important regulator of LDLR activity in human and mouse hepatic cells through direct targeting of LDLR and LDLRAP1. In addition, we report that modulation of miR-27b expression affects ABCA1 protein levels and cellular cholesterol efflux to ApoA1 in human hepatic Huh7 cells. Overexpression of pre-miR-27b in the livers of wild-type mice using AAV8 vectors increased pre-miR-27b levels 50efold and reduced hepatic ABCA1 and LDLR expression by 50% and 20%, respectively, without changing circulating and hepatic cholesterol and triglycerides. To determine the effect of endogenous miR-27b on circulating lipids, wild-type mice were fed a Western diet for one month and injected with 5 mg/kg of LNA control or LNA anti-miR-27b oligonucleotides. Following two weeks of treatment, the expression of ABCA1 and LDLR were increased by 10-20% in the liver, demonstrating effective inhibition of miR-27b function. Intriguingly, no differences in circulating and hepatic lipids were observed between treatment groups. Conclusions: The results presented here provide evidence that short-term modulation of miR-27b expression in wild-type mice regulates hepatic LDLR and ABCA1 expression but does not influence plasma and hepatic lipid levels. (C) 2015 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved
Pathophysiology of Niemann-Pick disease type C: Study of the potential interaction between NPC1, PMCA2 and ABCC3 proteins
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019A doença Niemann-Pick tipo C (NPC) é uma doença rara, um distúrbio letal, autossómico recessivo e com uma deficiência no armazenamento lisossomal, caracterizada por apresentar uma complexa neurodegeneração e morte prematura, normalmente durante a infância. Os genes que causam este distúrbio são os genes NPC1, responsáveis por 95% dos casos e NPC2, apenas responsáveis por 5% dos casos. Estes estão envolvidos no transporte intracelular de lípidos e colesterol. No caso dos lípidos (colesterol, esfingomielina, glicolípidos e fosfolípidos), estes vão acumular-se no lisossoma e endossoma tardio do baço, fígado e sistema nervoso, como resultado de um transporte deficiente dentro das células respetivas. A existência de mutações em qualquer um destes genes leva a uma acumulação progressiva do colesterol não esterificado e de outros lípidos já referidos, no sistema nervoso central e em órgãos periféricos. Na NPC, a proporção de nascimentos é 1:100 000 em França, Reino Unido e Alemanha, mas, no entanto, este número pode ser uma estimação abaixo do valor real, uma vez que é consideravelmente difícil estabelecer um número fidedigno. A razão pela qual acontece, é devido à inexistência de uma triagem óbvia no que diz respeito a esta doença, e, portanto, é provável que seja mais comum do que este número sugere. No entanto, foi previamente estudado que todas as etnias são afetadas do mesmo modo e não existe um fator diferencial entre elas. A idade de diagnóstico na NPC é altamente variável e as suas primeiras manifestações podem ser hepáticas, neurológicas ou até psiquiátricas. Estas podem ser detetadas no período perinatal, com problemas a nível hepático em 50% dos casos. Na infância e adolescência, os sinais iniciais da doença podem incluir hepatoesplenomegália, ataxia e dificuldades no que diz respeito à aprendizagem geral dos doentes com NPC. Relativamente às manifestações na idade adulta, estas podem incluir demência, ataxia cerebral e disartria (caracterizada pela dificuldade em articular as palavras de um modo correto e percetível). Como tal, ao existir um deficiente transporte intracelular de lípidos (incluindo a esfingosina) é possível que o consequente armazenamento de esfingosina possa interferir na função do transporte de cálcio (Ca2+) e por isso, é muito provável que possa ocorrer na NPC, uma diminuição da atividade nas bombas de Ca2+. Baixos níveis de Ca2+ levam a uma acumulação de colesterol, esfingomielina e glicoesfingolípidos e por isso é relevante falar acerca de uma das famílias transportadoras de Ca2+, PMCA. A função principal desta família transportadora é exportar Ca2+ do citoplasma para o exterior das células e regular a homeostasia do Ca2+. É importante realçar que neste estudo, esta família vai terá um papel fundamental no decorrer do projeto. Para além desta família transportadora, a família ABC, família cassete de ligação ao ATP, é caracterizada por utilizar a energia de ligação e hidrólise do ATP para transportar substâncias através da membrana, e por isso, será também objeto de estudo neste projeto, com fundamental destaque, a sub-família ABCC3. Neste modelo, propomos que o NPC1 é um sensor de colesterol que regula o conteúdo de colesterol e de lípidos no lisossoma, promovendo a captação de cálcio e o efluxo de esfingosina, a partir do lisossoma. Este estudo propõe um modelo em que o NPC1, na presença de colesterol, se liga diretamente a um transportador de cálcio, ativando-o, e este, por sua vez, se liga a um transportador de esfingosina, o PMCA2, sendo ativado também. Estudos previamente realizados em levedura, de Colaço et al. (dados não publicados de Platt lab) demonstraram que Ncr1 (ortólogo de NPC1) se liga diretamente com PMC1, um ortólogo de PMCA2. Também foi estudado que PMC1 se liga diretamente a YCF1, uma proteína associada à resistência a múltiplas drogas, ortólogo de ABCC3, um membro da família de transportadores ATP binding cassette (ABC). Para além disso, resultados obtidos previamente por ensaios de complementação biomolecular (BiFC) indicaram que NPC1 e PMCA2 interagem diretamente num sistema de mamíferos (dados não publicados de Fernandez-Suarez). O objetivo deste estudo é confirmar a interação entre NPC1 e PMCA2, usando uma técnica diferente e avaliar a ligação entre PMCA2 e ABCC3, com a utilização de BiFC. Neste estudo, conseguimos confirmar a interação direta entre NPC1 e PMCA2 por co-imunoprecipitação, mas, por outro lado, embora tenhamos clonado com sucesso os plasmídeos necessários para realizar o BiFC, não conseguimos detetar nenhuma interação entre PMCA2 e ABCC3. Podemos afirmar que serão necessários mais estudos para avaliar esta interação, assim como a formação de um heterocomplexo que contenha as proteínas NPC1, PMCA2 e ABCC3, de modo a que seja possível regular o transporte de lípidos.Niemann-Pick disease type C (NPC) is a lethal, autosomal recessive, lysosomal storage disorder characterized by neurodegeneration and premature death, usually in childhood. The causative genes NPC1 (about 95% of cases) and NPC2 (about 5% of cases) are involved in the intracellular trafficking pathway of lipids. Mutations on either of these genes lead to progressive accumulation of unesterified cholesterol and other lipids in the central nervous system and peripheral organs. We hypothesise that NPC1 is a cholesterol sensor that regulates cholesterol and glycosphingolipid content in the lysosome by the promotion of calcium uptake and sphingosine efflux from the lysosome. This study proposes a model in which NPC1, in the presence of cholesterol, directly binds and activates a calcium transporter and this one binds and activates a sphingosine transporter. Preliminary studies in yeast from Colaço et al. (Platt lab unpublished data) demonstrated that Ncr1 (NPC1 orthologue) directly binds PMC1, a calcium ATPase orthologue of the human plasma membrane calcium ATPase 2 (PMCA2). She also found that PMC1 binds directly to YCF1, a multidrug resistance associated protein, orthologue of the human ABCC3, a member of the ATP binding cassette (ABC) family of transporters. Moreover, previous results obtained by bimolecular complementation assay (BiFC) indicated that NPC1 and PMCA2 directly interact in a mammalian system (Fernandez-Suarez, unpublished data). The purpose of this study is to confirm the interaction between NPC1 and PMCA2 using a different technique and to assess PMCA2-ABCC3 interaction, by BiFC. In this study, we were able to confirm the direct interaction between NPC1 and PMCA2 by co-immunoprecipitation. Also, although we successfully cloned the plasmids necessary to perform the BiFC, we were unable to detect any interaction between PMCA2 and ABCC3. Further studies will be needed to evaluate this interaction as well as the formation of an heterocomplex containing NPC1, PMCA2 and ABCC3 proteins for the regulation of lipids transport.Laboratório Platt, Oxfor
Pathophysiology of Niemann-Pick disease type C: Study of the potential interaction between NPC1, PMCA2 and ABCC3 proteins
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019A doença Niemann-Pick tipo C (NPC) é uma doença rara, um distúrbio letal, autossómico recessivo e com uma deficiência no armazenamento lisossomal, caracterizada por apresentar uma complexa neurodegeneração e morte prematura, normalmente durante a infância. Os genes que causam este distúrbio são os genes NPC1, responsáveis por 95% dos casos e NPC2, apenas responsáveis por 5% dos casos. Estes estão envolvidos no transporte intracelular de lípidos e colesterol. No caso dos lípidos (colesterol, esfingomielina, glicolípidos e fosfolípidos), estes vão acumular-se no lisossoma e endossoma tardio do baço, fígado e sistema nervoso, como resultado de um transporte deficiente dentro das células respetivas. A existência de mutações em qualquer um destes genes leva a uma acumulação progressiva do colesterol não esterificado e de outros lípidos já referidos, no sistema nervoso central e em órgãos periféricos. Na NPC, a proporção de nascimentos é 1:100 000 em França, Reino Unido e Alemanha, mas, no entanto, este número pode ser uma estimação abaixo do valor real, uma vez que é consideravelmente difícil estabelecer um número fidedigno. A razão pela qual acontece, é devido à inexistência de uma triagem óbvia no que diz respeito a esta doença, e, portanto, é provável que seja mais comum do que este número sugere. No entanto, foi previamente estudado que todas as etnias são afetadas do mesmo modo e não existe um fator diferencial entre elas. A idade de diagnóstico na NPC é altamente variável e as suas primeiras manifestações podem ser hepáticas, neurológicas ou até psiquiátricas. Estas podem ser detetadas no período perinatal, com problemas a nível hepático em 50% dos casos. Na infância e adolescência, os sinais iniciais da doença podem incluir hepatoesplenomegália, ataxia e dificuldades no que diz respeito à aprendizagem geral dos doentes com NPC. Relativamente às manifestações na idade adulta, estas podem incluir demência, ataxia cerebral e disartria (caracterizada pela dificuldade em articular as palavras de um modo correto e percetível). Como tal, ao existir um deficiente transporte intracelular de lípidos (incluindo a esfingosina) é possível que o consequente armazenamento de esfingosina possa interferir na função do transporte de cálcio (Ca2+) e por isso, é muito provável que possa ocorrer na NPC, uma diminuição da atividade nas bombas de Ca2+. Baixos níveis de Ca2+ levam a uma acumulação de colesterol, esfingomielina e glicoesfingolípidos e por isso é relevante falar acerca de uma das famílias transportadoras de Ca2+, PMCA. A função principal desta família transportadora é exportar Ca2+ do citoplasma para o exterior das células e regular a homeostasia do Ca2+. É importante realçar que neste estudo, esta família vai terá um papel fundamental no decorrer do projeto. Para além desta família transportadora, a família ABC, família cassete de ligação ao ATP, é caracterizada por utilizar a energia de ligação e hidrólise do ATP para transportar substâncias através da membrana, e por isso, será também objeto de estudo neste projeto, com fundamental destaque, a sub-família ABCC3. Neste modelo, propomos que o NPC1 é um sensor de colesterol que regula o conteúdo de colesterol e de lípidos no lisossoma, promovendo a captação de cálcio e o efluxo de esfingosina, a partir do lisossoma. Este estudo propõe um modelo em que o NPC1, na presença de colesterol, se liga diretamente a um transportador de cálcio, ativando-o, e este, por sua vez, se liga a um transportador de esfingosina, o PMCA2, sendo ativado também. Estudos previamente realizados em levedura, de Colaço et al. (dados não publicados de Platt lab) demonstraram que Ncr1 (ortólogo de NPC1) se liga diretamente com PMC1, um ortólogo de PMCA2. Também foi estudado que PMC1 se liga diretamente a YCF1, uma proteína associada à resistência a múltiplas drogas, ortólogo de ABCC3, um membro da família de transportadores ATP binding cassette (ABC). Para além disso, resultados obtidos previamente por ensaios de complementação biomolecular (BiFC) indicaram que NPC1 e PMCA2 interagem diretamente num sistema de mamíferos (dados não publicados de Fernandez-Suarez). O objetivo deste estudo é confirmar a interação entre NPC1 e PMCA2, usando uma técnica diferente e avaliar a ligação entre PMCA2 e ABCC3, com a utilização de BiFC. Neste estudo, conseguimos confirmar a interação direta entre NPC1 e PMCA2 por co-imunoprecipitação, mas, por outro lado, embora tenhamos clonado com sucesso os plasmídeos necessários para realizar o BiFC, não conseguimos detetar nenhuma interação entre PMCA2 e ABCC3. Podemos afirmar que serão necessários mais estudos para avaliar esta interação, assim como a formação de um heterocomplexo que contenha as proteínas NPC1, PMCA2 e ABCC3, de modo a que seja possível regular o transporte de lípidos.Niemann-Pick disease type C (NPC) is a lethal, autosomal recessive, lysosomal storage disorder characterized by neurodegeneration and premature death, usually in childhood. The causative genes NPC1 (about 95% of cases) and NPC2 (about 5% of cases) are involved in the intracellular trafficking pathway of lipids. Mutations on either of these genes lead to progressive accumulation of unesterified cholesterol and other lipids in the central nervous system and peripheral organs. We hypothesise that NPC1 is a cholesterol sensor that regulates cholesterol and glycosphingolipid content in the lysosome by the promotion of calcium uptake and sphingosine efflux from the lysosome. This study proposes a model in which NPC1, in the presence of cholesterol, directly binds and activates a calcium transporter and this one binds and activates a sphingosine transporter. Preliminary studies in yeast from Colaço et al. (Platt lab unpublished data) demonstrated that Ncr1 (NPC1 orthologue) directly binds PMC1, a calcium ATPase orthologue of the human plasma membrane calcium ATPase 2 (PMCA2). She also found that PMC1 binds directly to YCF1, a multidrug resistance associated protein, orthologue of the human ABCC3, a member of the ATP binding cassette (ABC) family of transporters. Moreover, previous results obtained by bimolecular complementation assay (BiFC) indicated that NPC1 and PMCA2 directly interact in a mammalian system (Fernandez-Suarez, unpublished data). The purpose of this study is to confirm the interaction between NPC1 and PMCA2 using a different technique and to assess PMCA2-ABCC3 interaction, by BiFC. In this study, we were able to confirm the direct interaction between NPC1 and PMCA2 by co-immunoprecipitation. Also, although we successfully cloned the plasmids necessary to perform the BiFC, we were unable to detect any interaction between PMCA2 and ABCC3. Further studies will be needed to evaluate this interaction as well as the formation of an heterocomplex containing NPC1, PMCA2 and ABCC3 proteins for the regulation of lipids transport.Laboratório Platt, Oxfor
Environmental enrichment during adolescence heightens ethanol intake in female, but not male, adolescent rats that are selectively bred for high and low ethanol intake during adolescence
No full textBackground: Discriminating between adolescents who will eventually have ethanol use problems from those who do not is important. Environmental enrichment is a promising approach to reduce drug-related problems, but its impact on ethanol’s effects and intake is being scrutinized. Objective: We tested the effects of environmental enrichment on ethanol intake, preference, and anxiety-like response as well as shelter seeking and risk-taking behaviors. Methods: Experiment 1 examined ethanol intake, preference, and anxiety-like responses in 46 male and 54 female Wistar rats that were derived from a short-term breeding program that selected for high and low ethanol drinking during adolescence (ADHI2 and ADLO2 lines, respectively). Shelter-seeking and risk-taking behaviors were assessed (Experiment 2) in ADHI2 and ADLO2 rats (73 males, 76 females) reared under environmental enrichment or standard housing conditions and given doses of ethanol (2.5 g/kg, intraperitoneal) for 3 weeks. Environmental enrichment was applied on postnatal days 21–42. Ethanol intake was measured on postnatal days 42–68. Anxiety-like behavior and exploratory responses were assessed using the light-dark box and multivariate concentric square field test. Results: In Experiment 1, environmental enrichment increased ethanol intake in female, but not male, ADHI2 and ADLO2 rats (p < 0.05). In the baseline measurement of Experiment 2, ADHI2 rats exhibited reduced risk-taking and increased anxiety-like behavior (p <.05). After exposure to environmental enrichment the ADHI and ADLO rats, both males and females, exhibited increased risk-taking and exploratory behavior (p < 0.05). Conclusions: Environmental enrichment appears to increase ethanol intake in female rats by promoting the exploration of new environments or stimuli. The findings indicate that environmental enrichment increased ethanol intake in female, but not male, rats. Clinical programs that treat alcohol use disorder by emphasizing environmental stimulation should be designed with caution
Pathophysiology of Niemann-Pick disease type C: Study of the potential interaction between NPC1, PMCA2 and ABCC3 proteins
No full textTrabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019A doença Niemann-Pick tipo C (NPC) é uma doença rara, um distúrbio letal, autossómico recessivo e com uma deficiência no armazenamento lisossomal, caracterizada por apresentar uma complexa neurodegeneração e morte prematura, normalmente durante a infância. Os genes que causam este distúrbio são os genes NPC1, responsáveis por 95% dos casos e NPC2, apenas responsáveis por 5% dos casos. Estes estão envolvidos no transporte intracelular de lípidos e colesterol. No caso dos lípidos (colesterol, esfingomielina, glicolípidos e fosfolípidos), estes vão acumular-se no lisossoma e endossoma tardio do baço, fígado e sistema nervoso, como resultado de um transporte deficiente dentro das células respetivas. A existência de mutações em qualquer um destes genes leva a uma acumulação progressiva do colesterol não esterificado e de outros lípidos já referidos, no sistema nervoso central e em órgãos periféricos. Na NPC, a proporção de nascimentos é 1:100 000 em França, Reino Unido e Alemanha, mas, no entanto, este número pode ser uma estimação abaixo do valor real, uma vez que é consideravelmente difícil estabelecer um número fidedigno. A razão pela qual acontece, é devido à inexistência de uma triagem óbvia no que diz respeito a esta doença, e, portanto, é provável que seja mais comum do que este número sugere. No entanto, foi previamente estudado que todas as etnias são afetadas do mesmo modo e não existe um fator diferencial entre elas. A idade de diagnóstico na NPC é altamente variável e as suas primeiras manifestações podem ser hepáticas, neurológicas ou até psiquiátricas. Estas podem ser detetadas no período perinatal, com problemas a nível hepático em 50% dos casos. Na infância e adolescência, os sinais iniciais da doença podem incluir hepatoesplenomegália, ataxia e dificuldades no que diz respeito à aprendizagem geral dos doentes com NPC. Relativamente às manifestações na idade adulta, estas podem incluir demência, ataxia cerebral e disartria (caracterizada pela dificuldade em articular as palavras de um modo correto e percetível). Como tal, ao existir um deficiente transporte intracelular de lípidos (incluindo a esfingosina) é possível que o consequente armazenamento de esfingosina possa interferir na função do transporte de cálcio (Ca2+) e por isso, é muito provável que possa ocorrer na NPC, uma diminuição da atividade nas bombas de Ca2+. Baixos níveis de Ca2+ levam a uma acumulação de colesterol, esfingomielina e glicoesfingolípidos e por isso é relevante falar acerca de uma das famílias transportadoras de Ca2+, PMCA. A função principal desta família transportadora é exportar Ca2+ do citoplasma para o exterior das células e regular a homeostasia do Ca2+. É importante realçar que neste estudo, esta família vai terá um papel fundamental no decorrer do projeto. Para além desta família transportadora, a família ABC, família cassete de ligação ao ATP, é caracterizada por utilizar a energia de ligação e hidrólise do ATP para transportar substâncias através da membrana, e por isso, será também objeto de estudo neste projeto, com fundamental destaque, a sub-família ABCC3. Neste modelo, propomos que o NPC1 é um sensor de colesterol que regula o conteúdo de colesterol e de lípidos no lisossoma, promovendo a captação de cálcio e o efluxo de esfingosina, a partir do lisossoma. Este estudo propõe um modelo em que o NPC1, na presença de colesterol, se liga diretamente a um transportador de cálcio, ativando-o, e este, por sua vez, se liga a um transportador de esfingosina, o PMCA2, sendo ativado também. Estudos previamente realizados em levedura, de Colaço et al. (dados não publicados de Platt lab) demonstraram que Ncr1 (ortólogo de NPC1) se liga diretamente com PMC1, um ortólogo de PMCA2. Também foi estudado que PMC1 se liga diretamente a YCF1, uma proteína associada à resistência a múltiplas drogas, ortólogo de ABCC3, um membro da família de transportadores ATP binding cassette (ABC). Para além disso, resultados obtidos previamente por ensaios de complementação biomolecular (BiFC) indicaram que NPC1 e PMCA2 interagem diretamente num sistema de mamíferos (dados não publicados de Fernandez-Suarez). O objetivo deste estudo é confirmar a interação entre NPC1 e PMCA2, usando uma técnica diferente e avaliar a ligação entre PMCA2 e ABCC3, com a utilização de BiFC. Neste estudo, conseguimos confirmar a interação direta entre NPC1 e PMCA2 por co-imunoprecipitação, mas, por outro lado, embora tenhamos clonado com sucesso os plasmídeos necessários para realizar o BiFC, não conseguimos detetar nenhuma interação entre PMCA2 e ABCC3. Podemos afirmar que serão necessários mais estudos para avaliar esta interação, assim como a formação de um heterocomplexo que contenha as proteínas NPC1, PMCA2 e ABCC3, de modo a que seja possível regular o transporte de lípidos.Niemann-Pick disease type C (NPC) is a lethal, autosomal recessive, lysosomal storage disorder characterized by neurodegeneration and premature death, usually in childhood. The causative genes NPC1 (about 95% of cases) and NPC2 (about 5% of cases) are involved in the intracellular trafficking pathway of lipids. Mutations on either of these genes lead to progressive accumulation of unesterified cholesterol and other lipids in the central nervous system and peripheral organs. We hypothesise that NPC1 is a cholesterol sensor that regulates cholesterol and glycosphingolipid content in the lysosome by the promotion of calcium uptake and sphingosine efflux from the lysosome. This study proposes a model in which NPC1, in the presence of cholesterol, directly binds and activates a calcium transporter and this one binds and activates a sphingosine transporter. Preliminary studies in yeast from Colaço et al. (Platt lab unpublished data) demonstrated that Ncr1 (NPC1 orthologue) directly binds PMC1, a calcium ATPase orthologue of the human plasma membrane calcium ATPase 2 (PMCA2). She also found that PMC1 binds directly to YCF1, a multidrug resistance associated protein, orthologue of the human ABCC3, a member of the ATP binding cassette (ABC) family of transporters. Moreover, previous results obtained by bimolecular complementation assay (BiFC) indicated that NPC1 and PMCA2 directly interact in a mammalian system (Fernandez-Suarez, unpublished data). The purpose of this study is to confirm the interaction between NPC1 and PMCA2 using a different technique and to assess PMCA2-ABCC3 interaction, by BiFC. In this study, we were able to confirm the direct interaction between NPC1 and PMCA2 by co-immunoprecipitation. Also, although we successfully cloned the plasmids necessary to perform the BiFC, we were unable to detect any interaction between PMCA2 and ABCC3. Further studies will be needed to evaluate this interaction as well as the formation of an heterocomplex containing NPC1, PMCA2 and ABCC3 proteins for the regulation of lipids transport.Laboratório Platt, Oxfor
Hematopoietic mir-21 Deficiency Promotes Apoptosis and Plaque Necrosis in Advanced Atherosclerotic Lesions
No full textMicroRNA-16 and MicroRNA-424 Regulate Cell-Autonomous Angiogenic Functions in Endothelial Cells via Targeting Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 and Fibroblast Growth Factor Receptor-1
No full textObjective-MicroRNAs play key roles in modulating a variety of cellular processes by posttranscriptional regulation of their target genes. Vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF receptor-2 (VEGFR2), and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) were identified by bioinformatic approaches and subsequently validated as targets of microRNA (miR)-16 and miR-424 in endothelial cells (ECs). Methods and Results-Mimetics of these microRNAs reduced VEGF, VEGFR2, and FGFR1 expression, whereas specific antagonists enhanced their expression. Expression of mature miR-16 and miR-424 was upregulated on VEGF or basic fibroblast growth factor (bFGF) treatment. This upregulation was accompanied by a parallel increase in primary transcript (pri-miR)-16-1 and pri-miR-16-2 but not in pri-miR-424 levels, indicating a VEGF/bFGF-dependent transcriptional and posttranscriptional regulation of miR-16 and miR-424, respectively. Reduced expression of VEGFR2 and FGFR1 by miR-16 or miR-424 overexpression regulated VEGF and bFGF signaling through these receptors, thereby affecting the activity of downstream components of the pathways. Functionally, miR-16 or miR-424 overexpression reduced proliferation, migration, and cord formation of ECs in vitro, and lentiviral overexpression of miR-16 reduced the ability of ECs to form blood vessels in vivo. Conclusion-We conclude that these miRNAs fine-tune the expression of selected endothelial angiogenic mediators in response to these growth factors. Altogether, these findings suggest that miR-16 and miR-424 play important roles in regulating cell-intrinsic angiogenic activity of ECs. (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31:2595-2606.
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