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Probiotic administration as emerging biotechnology to improve the development, growth and metabolism of aquatic organism
No full textI probiotici vengono definiti dalla FAO e dalla WHO come “organismi vivi che, se somministrati in quantità adeguata, apportano beneficio alla salute dell'ospite”. Per tale ragione, negli ultimi anni, essi sono stati ampiamente impiegati sia in campo biomedico sia in acquacoltura, come potenziali agenti bio-terapeutici nella cura di molte malattie e al fine di migliorare lo sviluppo dell’organismo allevato. Numerose ricerche scientifiche effettuate negli ultimi decenni hanno ampliato le conoscenze sulle funzioni dell’intestino, ponendo l’attenzione, in particolare, sul microbiota intestinale, la cui composizione e la cui attività influenzano le funzioni metaboliche e l’omeostasi dell’ospite. Pertanto, il microbiota intestinale è stato definito un vero e proprio organo metabolicamente attivo, molto importante per la salute dell’organismo. Recentemente, numerosi studi hanno messo in evidenza che una composizione alterata del microbiota intestinale, caratterizzata da riduzione di batteri benefici e aumento di batteri pro-infiammatori e patogeni, può essere implicata nello sviluppo di obesità, di resistenza all'insulina e di diabete, sia nell’uomo che nei roditori; tuttavia i meccanismi sottesi a tali disordini non sono ancora del tutto noti. I risultati finora ottenuti hanno evidenziato i numerosi effetti positivi esercitati dai probiotici, i quali, grazie alla loro interazione con il microbiota intestinale e con le cellule dell’intestino e alla produzione di metaboliti derivanti dalla loro attività microbica, sono in grado di controllare l’omeostasi energetica e di migliorare il benessere dell’ospite. La presente tesi di Dottorato è volta a determinare il ruolo del probiotico Lactobacillus rhamnosus IMC 501 nella regolazione di segnali coinvolti nel metabolismo lipidico, nel metabolismo del glucosio, nel metabolismo osseo e nell’appetito, attraverso la modulazione del microbiota intestinale, in zebrafish.
Zebrafish (Danio rerio) è un modello ampiamente utilizzato in ambito biomedico grazie all’alta sintenia del suo genoma con quello umano, alla presenza di patologie che si incontrano anche nell’uomo e al completo sequenziamento del suo genoma; tali caratteristiche lo rendono un eccellente modello per lo studio della genetica e dello sviluppo, per la comprensione delle malattie umane e per lo screening di farmaci terapeutici.
Nel primo esperimento, embrioni di zebrafish provenienti dagli stessi parentali sono stati raccolti e mantenuti in vasche da 3 L in condizioni controllate (26-28 °C, fotoperiodo 12/12 L/D). Gli embrioni sono stati divisi in due vasche, un gruppo controllo e un gruppo trattato. Il gruppo controllo è stato alimento solo con dieta commerciale, mentre il gruppo trattato è stato alimentato con dieta commerciale e Lactobacillus rhamnosus IMC 501 alla concentrazione di 106 CFU ml-1 e successivamente, da entrambi i gruppi sperimentali sono state campionate larve a diversi stadi di sviluppo partendo da: 72 hpf (hatching), 96 hpf (hour post fertilization), 6 dpf (days post fertilization), 8 dpf.
Attraverso un approccio multidisciplinare è stato possibile valutare l’effetto del probiotico L. rhamnosus sul microbiota intestinale e sulla regolazione dei pathway che regolano metabolismo lipidico, glucidico e appetito.
Analisi di high-throughput sequence della regione V3 del 16s rDNA batterico effettuate sulle larve a 6 dpf e 8 dpf, hanno messo in evidenza la capacità del probiotico di indurre cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale. Infatti il probiotico ha determinato un aumento di specie benefiche appartenenti al phylum Firmicutes (prevalentemente lactobacilli and Streptococcus thermophilus) e ha ridotto l’abbondanza di specie potenzialmente patogene appartenenti al phylum
Actinobacteria (in particolare Mycobacterium spp.), al phylum Proteobacteria (in particolare, Legionella, Plesiomonas and Pseudomonas) e ai phyla Fusobacteria, Planctomycetes, Bacteroides.
I cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale avvenuti in seguito alla somministrazione di L. rhamnosus, hanno indotto una modulazione a livello trascrizionale di geni coinvolti nella regolazione del metabolismo lipidico, glucidico e dell’appetito. In particolare, per quanto riguarda il metabolismo lipidico, i risultati ottenuti mediante analisi biomolecolari, hanno riportato una riduzione significativa dell’espressione dei geni fit2, agpat4 e dgat2, i cui prodotti sono coinvolti nella produzione di trigliceridi ed un aumento significativo dei livelli di espressione di mgll, il cui prodotto è un enzima coinvolto nell’idrolisi dei trigliceridi. Inoltre il probiotico ha ridotto significativamente i livelli di espressione di hnf4α coinvolto nella produzione del colesterolo. Infine, nelle larve trattate con probiotico, è stato registrato un significativo aumento dei livelli di espressione di cck, coinvolto nella contrazione della cistifellea e nel rilascio di bile, implicata nell’emulsificazione dei grassi. Per quanto concerne il metabolismo glucidico, i risultati ottenuti hanno evidenziato un aumento significativo dei livelli di espressione genica di nucb2/nesftain-1 glp-1 e pre-pro-insulin coinvolti nella riduzione del glucosio nel sangue.
Inoltre, i dati ottenuti hanno messo in evidenza la capacità del probiotico di modulare l’appetito. Infatti, è stata riscontrata una riduzione significativa dei livelli di espressione di geni oressizzanti come cb1, npy e goat, e un aumento significativo dei livelli di espressione di geni anoressizzanti leptin e mc4r.
In aggiunta, i dati ottenuti da analisi di cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC), condotte su larve a 6 dpf, hanno messo in evidenza una diminuzione significativa del contenuto totale di trigliceridi e colesterolo nei trattati con probiotico rispetto al controllo. Grazie all’utilizzo dei fluorofori BODIPY 505/515 e BODIPY D3828, che mettono rispettivamente in evidenza acidi grassi non polari e acidi grassi a catena corta, è stato osservato, nelle larve a 6 dpf trattate con probiotico, un aumento significativo del contenuto di acidi grassi non polari nella cistifellea e, nelle larve a 8 dpf trattate con probiotico, un aumento di acidi grassi a catena corta, sia nella cistifellea che nell’intestino.
Le immagini di intestini di larve allo stadio di sviluppo a 6 dpf e a 8 dpf ottenute al microscopio a trasmissione (TEM) hanno rilevato la capacità del probiotico di modificare l’architettura dell’epitelio intestinale; infatti è stato riscontrato un aumento significativo della lunghezza degli enterociti e dei microvilli, che ha determinato un incremento della superficie di assorbimento intestinale e una diminuzione della quantità di gocce lipidiche.
In aggiunta, a 8 dpf è stato registrato un aumento significativo della lunghezza delle larve trattate con probiotico, mentre un incremento significativo del peso è stato rilevato sia a 6 dpf che 8 dpf.
Nel secondo esperimento, embrioni di zebrafish sono stati divisi in due vasche, un gruppo controllo e un gruppo trattato. Il gruppo controllo è stato alimentato solo con dieta commerciale, mentre il gruppo trattato è stato alimentato con dieta commerciale e Lactobacillus rhamnosus IMC 501 alla concentrazione di 106 CFU ml-1 e, successivamente, da entrambi i gruppi sperimentali sono state campionate larve a diversi stadi di sviluppo, partendo da 9 dpf, 16 dpf, 23 dpf.
I risultati morfologici ed istochimici hanno mostrato la capacità di L. rhamnosus di accelerare la formazione delle ossa attraverso un aumento significativo dell'espressione di geni chiave coinvolti nella ossificazione, come runx2, sp7, mgp, gla e bglap, e attraverso la riduzione significativa dei livelli di espressione del sost, inibitore della formazione dell’osso. I dati ottenuti mediante analisi di Western blott hanno messo in evidenza, nelle larve trattate con il probiotico, un aumento delle MAP-chinasi 1 e 3
(Mapk1 e Mapk3), coinvolte nella differenziazione di osteoblasti e di osteociti. In particolare, si è registrato un aumento significativo di Mapk1 a partire da 16 dpf e di Mapk3 a 23 dpf.
Per condurre il terzo esperimento, sono state formulate diete contenti diverse percentuali di lipidi (15%, 10% e 5%). La dieta con il 15% di lipidi supera la quantità di grassi necessaria a soddisfare i requisiti energetici del pesce, mentre la dieta con il 10% di lipidi è isocalorica e fornisce la giusta quantità di lipidi necessari a soddisfare il fabbisogno energetico; la dieta con 5% di lipidi, infine, rappresenta una dieta ipocalorica con percentuale di lipidi minore rispetto a quella sufficiente a garantire il corretto fabbisogno energetico. Ad ogni dieta è stato aggiunto il probiotico L. rhamnosus, in questo modo sono state ottenute sei diete differenti (15%, 10%, 5% e 15% + L. rhamnosus, 10% + L. rhamnosus, 5% + L. rhamnosus). Adulti di zebrafish sono stati alimentati ad libitum due volte al giorno per un mese, quindi sono stati campionati. Attraverso uno studio multidisciplinare è stato possibile valutare le proprietà ipolipidemiche del probiotico L. rhamnosus su zebrafish alimentato con diete contenenti diversa percentuale lipidica, e valutare come il diverso contenuto lipidico nelle diete influenza il microbiota intestinale. I risultati ottenuti da analisi biomolecolari hanno dimostrato la capacità del probiotico di modulare significativamente i livelli di espressione di geni coinvolti nella regolazione del metabolismo lipidico e dell’appetito. Infatti, il probiotico, nei pesci alimentati con 15%, 10% e 5% di lipidi, ha indotto riduzioni significative a livello trascrizionale di hnf4α e npcl1a1, il primo coinvolto nella produzione di colesterolo e il secondo coinvolto nell’uptake di lipidi da parte degli enterociti. Inoltre, L. rhamnosus, nei pesci alimentati con il 15% e il 10% di lipidi, ha agito determinando un aumento significativo dei livelli di espressione di geni anoressigenici come nucb2/nesfatin-1, glp-1 e diminuendo significativamente il gene oressizante npy, suggerendo un ruolo importante del probiotico nel controllo dell’appetito.
Immagini, ottenute al TEM, di intestini di zebrafish alimentati con diete contenenti il 15% e 10% di lipidi, hanno messo in evidenza che un eccessivo contenuto di lipidi nella dieta determina un grave stato di infiammazione intestinale che aumenta l’infiltrazione di popolazioni di granulociti e macrofagi nell’epitelio dell’intestino. Tuttavia, attraverso l’analisi di ulteriori immagini al TEM, relative ad intestini di zebrafish alimentati con le stesse diete (15% e 10%) arricchite con il probiotico, è stata evidenziata una minor presenza di granulociti e macrofagi, e ciò ha consentito di mettere in luce la capacità del probiotico di attenuare lo stato infiammatorio nell’intestino, causato dall’elevato contenuto di grassi nelle diete.
Infine, è stata registrata una diminuzione significativa del peso di zebrafish alimentati con le diete contenti 15% e 10% di lipidi arricchite con il probiotico, rispetto ai gruppi alimentati con diete prive di probiotico, mentre il probiotico non ha determinato nessun effetto significativo sul peso di zebrafish alimentati con il 5% di lipidi. Sono state inoltre effettuate analisi high-throughput sequence e di HPLC, le prime al fine di valutare il cambiamento del microbiota intestinale, le seconde affinché possano essere valutate le differenze in contenuto di trigliceridi e colesterolo nei pesci i quali sono stati alimentati con diete a diverso profilo lipidico e ai quali è stato somministrato probiotico. I risultati ottenuti nella presente tesi di Dottorato contribuiscono a chiarire il ruolo svolto dai probiotici sul microbiota intestinale di zebrafish, mettendo in luce un nuovo network di geni attraverso il quale il probiotico espleta una funzione ipolipidemica e ipoglicemica e di riduzione dell’appetito, nonché di accelerazione della formazione delle ossa. I risultati qui descritti potrebbero avere validità scientifica diversa: se da un lato rappresentano un punto di partenza per futuri studi sul metabolismo e potrebbero evidenziare un nuovo ruolo potenziale per il probiotico nel trattamento di disturbi metabolici, dall'altro essi forniscono una visione utile per biotecnologie sostenibili, applicabili per un aumento della produttività del settore dell'acquacoltura e maricoltura
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Get PDFThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Probiotic treatment reduces appetite and glucose level in the zebrafish model
Get PDFThe gut microbiota regulates metabolic pathways that modulate the physiological state of hunger or satiety. Nutrients in the gut stimulate the release of several appetite modulators acting at central and peripheral levels to mediate appetite and glucose metabolism. After an eight-day exposure of zebrafish larvae to probiotic Lactobacillus rhamnosus, high-throughput sequence analysis evidenced the ability of the probiotic to modulate the microbial composition of the gastrointestinal tract. These changes were associated with a down-regulation and up-regulation of larval orexigenic and anorexigenic genes, respectively, an up-regulation of genes related to glucose level reduction and concomitantly reduced appetite and body glucose level. BODIPY-FL-pentanoic-acid staining revealed higher short chain fatty acids levels in the intestine of treated larvae. These results underline the capability of the probiotic to modulate the gut microbiota community and provides insight into how the probiotic interacts to regulate a novel gene network involved in glucose metabolism and appetite control, suggesting a possible role for L. rhamnosus in the treatment of impaired glucose tolerance and food intake disorders by gut microbiota manipulation
Variations on the Author
Get PDF“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Get PDFWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Get PDFWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
koamabayili/VECTRON-author-checklist: VECTRON author checklist
No full textWe have done our best to complete the author checklist relating to the use of animals in the hut study. Note that the objective for the hut study was to evaluate the IRS treatment applications for residual efficacy against Anopheles mosquitoes, including the local An. coluzzii mosquito population. Cows were only used to attract mosquitoes into the huts and no tests were carried out directly on the cows. The author checklist is intended for use with studies where experiments are carried out on animals, which is why we have had such difficulty in completing this for the hut study, as many of the questions do not relate to how the cows were used
Author-wise bibliometric analysis based on entropy.
No full textAuthor-wise bibliometric analysis based on entropy.</p
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