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Modulazione della via paracellulare nell'intestino medio larvale di lepidottero
No full textLa via paracellulare dell’intestino medio di insetto, ossia il canale acquoso formato dal complesso giunzionale e dalla membrana laterale di due cellule adiacenti, è particolarmente indicato per favorire il passaggio di bioinsetticidi a basso peso molecolare con target emocelico. Il nostro gruppo di ricerca ha recentemente dimostrato che la permeabilità della giunzione settata dell’intestino larvale di lepidottero può essere modulata da variazioni della concentrazione citosolica di calcio. Abbiamo ora studiato uno dei pathways del segnale che porta al rilascio di calcio dai depositi intracellulari e quindi all’aumento della permeabilità della giunzione. L’acido grasso a catena media C10 è in grado di modulare la giunzione stretta di mammifero determinando l’attivazione di pathways intracellulari calcio-dipendenti. L’aggiunta di questo acido grasso al lato luminale dell’intestino medio larvale di lepidottero isolato in camere di Ussing, determina una riduzione della resistenza elettrica paracellulare, ossia un aumento della permeabilità ionica della giunzione, e un aumento del flusso di proctolin e di fluoresceina, due molecole organiche che superano l’intestino esclusivamente attraverso la via paracellulare. Abbiamo evidenziato che il C10 attiva la fosfolipasi C e la cascata del segnale dipendente da inositolo-3-fosfato che determina il rilascio di calcio dai depositi intracellulari. L’aumento della concentrazione citosolica di questo ione attiva una chinasi specifica che fosforila la catena leggera della miosina. Questa fosforilazione determina presumibilmente una modificazione dell’organizzazione del citoscheletro connesso alla giunzione settata, causa, a sua volta, dell’aumento della permeabilità della via paracellulare agli ioni e alle piccole molecole organiche
Endocitosi di albumina nelle cellule dell’intestino medio delle larve di Bombyx mori in cultura
No full textEsistono in natura numerose molecole ad attività insetticida che agiscono su recettori a localizzazione emocelica. Il controllo degli insetti dannosi potrebbe utilizzare più proficuamente questa biodiversità molecolare, qualora venissero messe a punto strategie di rilascio di tali sostanze in grado di consentire una loro efficace azione. Per poter funzionare da insetticidi, infatti, molecole proteiche con target emocelico devono essere in grado di oltrepassare la barriera intestinale non degradate, raggiungendo la cavità interna del corpo in forma attiva. La conoscenza dei meccanismi di assorbimento intestinale di macromolecole può fornire le basi conoscitive necessarie alla manipolazione di tale processo, al fine di esaltarne l’efficienza. L’assorbimento delle proteine negli epiteli polarizzati di mammifero avviene mediante un complesso processo che prende il nome di transcitosi: la macromolecola viene endocitata ad un dominio della membrana plasmatica e trasportata, all’interno di vescicole, verso il dominio di membrana opposto dove viene esocitata. Sebbene in differenti ordini di insetto sia stato dimostrato che proteine somministrate oralmente sono in grado di raggiungere in vivo l’emocele non degradate, ancora piuttosto scarse sono le informazioni riguardo il meccanismo coinvolto. Recentemente abbiamo dimostrato che l’albumina viene assorbita per transcitosi nell’intestino delle larve di Bombyx mori, isolato e montato in un opportuno apparato di perfusione. Un approccio estremamente utile per lo studio dei meccanismi di endocitosi e dei percorsi intracellulari seguiti dalle proteine internalizzate è rappresentato dall’impiego di colture primarie di cellule intestinali di insetto. Abbiamo quindi utilizzato le cellule intestinali delle larve di B. mori in coltura per chiarire, mediante microscopia confocale, quale fosse il meccanismo che permette l’internalizzazione dell’albumina-FITC e quale fosse il ruolo del citoscheletro in questo processo. Abbiamo dimostrato che l’ingresso della proteina nelle cellule colonnari avviene con un processo dipendente da energia e grazie ad un meccanismo di endocitosi mediata da recettore. Esperimenti di immunolocalizzazione e di Western blotting, così come l’inibizione dell’internalizzazione dell’albumina in presenza di due specifici inibitori dell’endocitosi mediata da clatrina, ci hanno permesso di chiarire che è questo il meccanismo coinvolto nell’endocitosi della proteina. Inoltre, l’integrità del citoscheletro è indispensabile perchè l’albumina possa essere internalizzata nelle cellule colonnari dell’intestino larvale
Identificazione di un recettore coinvolto nell'endocitosi di proteine nelle cellule dell'intestino medio delle larve di Bombyx mori
No full textAllo scopo di ridurre l’utilizzo dei pesticidi chimici in agricoltura, negli ultimi anni hanno avuto notevole impulso ricerche volte ad individuare nuove classi di insetticidi più ecocompatibili, dotati di maggiore specie-specificità e con un ridotto impatto sulla salute umana. Recentemente, numerosi prodotti genici con queste potenziali caratteristiche sono stati isolati da virus, microrganismi, funghi, piante e artropodi. Affinché la somministrazione orale di biopesticidi con target emocelico sia efficace è indispensabile chiarire quali sono i meccanismi coinvolti nel loro assorbimento per poi sviluppare strategie per facilitarne il passaggio attraverso la barriera intestinale. Recentemente abbiamo dimostrato che l’albumina viene assorbita per transcitosi nell’intestino delle larve di Bombyx mori. Questo processo, molto studiato in mammifero, prevede che la macromolecola venga endocitata a livello della membrana apicale della cellula assorbente e trasportata, all’interno di vescicole, verso il dominio di membrana basolaterale dove viene esocitata. Per meglio chiarire a livello cellulare i meccanismi coinvolti nell’assorbimento di proteine in insetto, abbiamo utilizzato cellule intestinali in coltura. Abbiamo dimostrato che l’ingresso della proteina nelle cellule colonnari è mediato da recettore e che il meccanismo endocitotico è mediato da clatrina. Con un approccio funzionale e molecolare abbiamo chiarito che il recettore coinvolto è un omologo della megalina, un recettore multiligando espresso in molti epiteli assorbenti di mammifero. Il legame con il recettore espresso nelle cellule intestinali delle larve di lepidottero determina una endocitosi della proteina molto efficiente, come dimostra la rapida internalizzazione dell’albumina rispetto a quella osservata per altre proteine, come l’agglutinina di Galanthus nivalis o la Green Fluorescent Protein.
Questi studi hanno permesso di chiarire meccanismi fino ad oggi ancora poco studiati in insetto e possono essere utilizzati per sviluppare nuove strategie per aumentare l’assorbimento intestinale di proteine ad attività bioinsetticida somministrate per via orale
A megalin-like receptor is involved in protein endocytosis by Bombyx mori midgut cells in culture
No full textProtein absorption by the insect midgut currently attracts increasing research efforts, in part fostered by the need to develop efficient strategies for oral delivery of bioinsecticides targeting haemocoelic receptors. Gut absorption of undegraded proteins has been unequivocally demonstrated in a number of insect species in vivo but only recently the mechanism involved has been clarified: we have proved that the isolated midgut of Bombyx mori larvae performs the transepithelial translocation of the model protein albumin by transcytosis.
Single columnar cells in culture, isolated from the larval midgut, represent the best tool to identify the mechanism involved in protein endocytosis, the fist step of the transcytotic process. Mature columnar cells were obtained from the proliferation and differentiation of stem cells detached from B. mori midgut epithelium and maintained in culture. We investigated FITC-albumin internalisation by confocal laser scanning microscopy. The protein uptake was time-dependent and strongly reduced by low temperatures and by metabolic inhibitors. Labelled albumin uptake as a function of increasing protein concentration showed a saturation kinetics and was inhibited by native albumin in a concentration-dependent manner. These data prove that albumin uptake is an active process and indicate that a receptor mediates the internalisation of the protein. The internalisation takes place by clathrin-mediated endocytosis, since two specific inhibitors of this process caused a significant reduction of the uptake, and clathrin and albumin colocalised in the intermicrovillar areas of the apical plasma membrane. The integrity of the cytoskeletal organisation is essential for the correct functioning of the endocytic machinery because preincubations with nocodazole or cytochalasin D induced a significant reduction of FITC-albumin uptake. RT-PCR analysis and colocalisation experiments indicated that the receptor involved is a putative homologue of megalin, the multiligand endocytic receptor belonging to the low-density lipoprotein (LDL)-receptor family, responsible for the uptake of a variety of molecules, albumin included, in many mammalian epithelial cells. Although the specific role of the putative megalin homologue in protein absorption by the midgut of lepidopteran larvae needs to be further clarified, our study indicates that this receptor is highly conserved during evolution
Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
A megalin-like receptor is involved in protein endocytosis in the midgut of an insect (Bombyx mori, Lepidoptera)
No full textThe mechanism responsible for fluorescein isothiocyanate (FITC)-albumin internalization
by columnar cells in culture obtained from the midgut of Bombyx mori larvae was examined by confocal laser scanning microscopy. Protein uptake changed over time, and it appeared to be energy dependent,
since it was strongly reduced by both low temperatures and metabolic inhibitors. Labeled albumin uptake as a function of increasing protein concentration showed a saturation kinetics with a Michaelis constant
value of 2.0 +/- 0.6 microM. These data are compatible with the occurrence of receptor-mediated endocytosis. RT-PCR analysis and colocalization experiments with an anti-megalin primary antibody indicated that
the receptor involved was a putative homolog of megalin, the multiligand endocytic receptor belonging to the low-density lipoprotein receptor family, responsible for the uptake of various molecules,albumin included, in many epithelial cells of mammals. This insect receptor, like the mammalian counterpart, required Ca2+ for albumin internalization and was inhibited by gentamicin. FITC-albumin internalization
was clathrin mediated, since two inhibitors of this process caused a significant reduction of the uptake, and clathrin and albumin colocalized in the intermicrovillar areas of the apical plasma membrane.
The integrity of actin and microtubule organization was essential for the correct functioning of the endocytic machinery
Poetica e "Nouvelle Critique". Sul primo Genette
No full textAnalisi e collocazione, storica e teorica, della prima raccolta raccolta di saggi critici di Gérard Genette, "Figure I
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