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Basigin drives intracellular accumulation of l-lactate by harvesting protons and substrate anions
No full textAbstract
Transmembrane transport of l-lactate by members of the monocarboxylate transporter family, MCT, is vital in human physiology and a malignancy factor in cancer. Interaction with an accessory protein, typically basigin, is required to deliver the MCT to the plasma membrane. It is unknown whether basigin additionally exerts direct effects on the transmembrane l-lactate transport of MCT1. Here, we show that the presence of basigin leads to an intracellular accumulation of l-lactate 4.5-fold above the substrate/proton concentrations provided by the external buffer. Using basigin truncations we localized the effect to arise from the extracellular Ig-I domain. Identification of surface patches of condensed opposite electrostatic potential, and experimental analysis of charge-affecting Ig-I mutants indicated a bivalent harvesting antenna functionality for both, protons and substrate anions. From these data, and determinations of the cytosolic pH with a fluorescent probe, we conclude that the basigin Ig-I domain drives lactate uptake by locally increasing the proton and substrate concentration at the extracellular MCT entry site. The biophysical properties are physiologically relevant as cell growth on lactate media was strongly promoted in the presence of the Ig-I domain. Lack of the domain due to shedding, or misfolding due to breakage of a stabilizing disulfide bridge reversed the effect. Tumor progression according to classical or reverse Warburg effects depends on the transmembrane l-lactate distribution, and this study shows that the basigin Ig-I domain is a pivotal determinant.
The following archive contains the raw data upon which the article has been based
Funktionelle Charakterisierung von Aquaporinen aus Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii und Trypanosoma brucei
No full textP. falciparum, T. gondii and T. brucei parasites cause infectious diseases that affect more than 300-400 million people world-wide and, thus, represent a major health problem. The rapid spreading of drug resistant parasite strains initiated the search for new drug targets.
Aquaporins at the parasite host interface have the potential to be used as a novel targets. I characterised biochemically a single T. gondii aquaporin (TgAQP) which has only 28% sequence similarity to the P. falciparum aquaporin (PfAQP) and 47% sequence similarity to water specific plant aquaporins (TIP 1;1) and three T. brucei aquaporins (TbAQP1-3) which show 40-45% similarity to mammalian AQP3.
The pore constriction region of TgAQP has a valine instead of a highly conserved arginine. This exchange is rather typical for above-mentioned plant aquaporins. Thus, it supports the hypothesis that apicomplexans have plant ancestors. TbAQP1 and 3 have a similar amino acid composition in the pore constriction as AQP3. TbAQP2, however, has a leucine instead of the pore arginine, and NSA and NPS motifs instead of the canonical NPA motifs.
I established that TgAQP and the TbAQPs are bifunctional pores with high glycerol and intermediate water permeability whereas in PfAQP both, water and glycerol permeability are high.
Further testing of TgAQP permeability showed that besides urea, which passes the pore equally well as glycerol, only erythritol and D-arabitol reasonably permeate TgAQP. Other larger and/or charged compounds do not pass. Strikingly, hydroxyurea, an anti-neoplastic agent with an inhibitory effect on parasite proliferation, could be identified as a permeant of TgAQP.
Solute permeability TbAQPs is more restricted. Only TbAQP3 passed erythrytol and ribitol well. TbAQP2 showed permeability for pyruvate. All TbAQPs passed urea.
The TbAQPs and PfAQP were further highly permeable for dihydroxyacetone (DHA). I could show that DHA is toxic for plasmodia parasites (IC50 2.5 mM). PfAQP was also tested for methylglyoxal (MG) permeability. MG is a side product of glycolysis and has a similar structure as DHA. MG was conducted by PfAQP and showed a toxic effect on malaria parasites (IC50 200 µM). P. falciparum glyceraldehydes phosphate dehydrogenase (PfGAPDH) was fully inhibited by 2.5 mM DHA after 6 h whereas MG did not have an inhibitory effect. Rabbit GAPDH as a control was fully inhibited by DHA after 3 h and by MG after 20h.
In addition, PfAQP is permeable for ammonia. I showed that one liter of packed plasmodia red cells produces 8.8 mmol of ammonia of ammonia per hour. PfAQP may thus be vital for malaria parasites as a pathway for ammonia release.P. falciparum, T. gondii und T brucei Parasiten verursachen Infektionskrankheiten, die mehr als 300-400 Millionen Menschen auf der Welt betreffen und stellen ein großes Gesundheitsproblem dar. Die schnelle Ausbreitung von resistenten Stämmen löste die Suche nach neuen Angriffspunkten für Medikamente aus. Aquaporine im Membransystem zwischen Parasit und Wirt könnten als neue Angriffspunkte für Medikamente genutzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden ein Aquaporin aus T. gondii (TgAQP) sowie drei Aquaporine aus T. brucei (TbAQP1-3) biochemisch charakterisiert.
TgAQP zeigt 28% Sequenzähnhichkeit zu dem Auqaglyceroporin aus P. falciparum (PfAQP) und 47% Sequenzähnhichkeit zu wasserspezifischen Pflanzenaquaporinen (TIP 1;1). TbAQP1-3 weisen 40-45% Ähnhichkeit zu AQP3 aus Säugern auf.
In der Porenregion von TgAQP, befindet sich ein Valin anstelle eines hochkonservierten Arginins. Dieser Aminosäurenaustausch ist typisch für die TIPs der Pflanzen und stützt die Hypothese, dass Apicomplexa pflanzliche Vorfahren haben. TbAQP1 und 3 haben eine ähnliche Aminosäurenzusammensetzung der Porenregion wie AQP3 und NPA Motive in der Region, die den Porenengpass bildet. TbAQP2 bildet eine Ausnahme, da es ein Leucin anstelle des Arginins hat und NSA und NPS Motive aufweist.
Es wurde gezeigt, dass TgAQP und TbAQPs bifunktionale Poren sind, die durch eine hohe Permeabilität für Glycerin und eine mittlere Wasserpermeabilität gekennzeichnet sind. PfAQP hingegen hat eine hohe Permeabilität für sowohl Glycerin als auch Wasser.
Die weitere Untersuchung der Permeabilität von TgAQP ergab, dass neben Harnstoff, der die Pore ebenso gut wie Wasser passiert, auch Erythritol und D-Arabitol eine gewisse Durchgangigkeit besitzen. Fur andere Verbindungen, die groser und/oder geladen sind, ist TgAQP nicht durchlässig. Interessanterweise kann Hydroxyharnstoff, ein anti-neoplastischer Wirkstoff, der die Parasitenproliferation inhibiert, durch die Pore dringen. Die Solutleitfähigkeit der TbAQPe ist eingeschränkt. Nur TbAQP3 lässt Erythritol und Ribitol pasieren. TbAQP2 hat eine geringe Permeabilität fur Pyruvat. Alle TbAQPe sind permeabel fur Harnstoff.
Sowohl die TbAQPs als auch PfAQP haben eine hohe Durchlässigkeit fur Dihydroxyaceton (DHA). Es wurde nachgewiesen, dass DHA fur die Plasmodienparasiten toxisch ist (IC50 2,5 mM). PfAQP wurde positiv auf Permeabilität von Methylglyoxal (MG) getestet. MG ist ein Nebenprodukt der Glykolyse und hat eine ähnliche Struktur wie DHA. Das von PfAQP eingeschleuste DHA wirkte toxisch auf die Malariaparasiten (IC50 200 µM). Des weiterem wurde die Auswirkung von 2,5 mM DHA bzw. MG auf P. falciparum Glycerolaldehyd-Dehydrogenase (PfGAPDH) untersucht. PfGAPDH wird nach 6 h vollständig von DHA inhibiert, wohingegen MG keinen inhibitorischen Effekt zeigt. Als Kontrolle wurde GAPDH aus dem Kaninchen verwendet, das von DHA nach 3 h und von MG nach 20 h vollständig inhibiert wird.
PfAQP ist auch durchlässig für Ammoniak. Es wurde gezeigt, dass ein Liter gepackter malariainfizierter Erythrozyten 8,8 mmol Ammoniak pro Stunde produzieren. PfAQP konnte demnach überlebenswichtig fur Plasmodien sein und als Anlass für Ammoniak fungieren
Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy Yields True Affinity and Binding Kinetics of <i>Plasmodium</i> Lactate Transport Inhibitors
No full textBlocking lactate export in the parasitic protozoan Plasmodium falciparum is a novel strategy to combat malaria. We discovered small drug-like molecules that inhibit the sole plasmodial lactate transporter, PfFNT, and kill parasites in culture. The pentafluoro-3-hydroxy-pent-2-en-1-one BH296 blocks PfFNT with nanomolar efficiency but an in vitro selected PfFNT G107S mutation confers resistance against the drug. We circumvented the mutation by introducing a nitrogen atom as a hydrogen bond acceptor site into the aromatic ring of the inhibitor yielding BH267.meta. The current PfFNT inhibitor efficiency values were derived from yeast-based lactate transport assays, yet direct affinity and binding kinetics data are missing. Here, we expressed PfFNT fused with a green fluorescent protein in human embryonic kidney cells and generated fluorescent derivatives of the inhibitors, BH296 and BH267.meta. Using confocal imaging, we confirmed the location of the proposed binding site at the cytosolic transporter entry site. We then carried out fluorescence cross-correlation spectroscopy measurements to assign true Ki-values, as well as kon and koff rate constants for inhibitor binding to PfFNT wildtype and the G107S mutant. BH296 and BH267.meta gave similar rate constants for binding to PfFNT wildtype. BH296 was inactive on PfFNT G107S, whereas BH267.meta bound the mutant protein albeit with weaker affinity than to PfFNT wildtype. Eventually, using a set of PfFNT inhibitor compounds, we found a robust correlation of the results from the biophysical FCCS binding assay to inhibition data of the functional transport assay
Discovery of novel human Aquaporin-1 Blockers
No full textHuman aquaporin-1 (hAQP1) is a water channel found in many tissues and potentially involved in several human pathologies. Selective inhibitors of hAQP1 are discussed as novel treatment opportunities for glaucoma, brain edema, inflammatory pain, and certain types of cancer. However, only very few potent and chemically attractive blockers have been reported to date. In this study we present three novel hAQP1 blockers that have been identified by virtual screening and inhibit water flux through hAQP1 in Xenopus laevis oocyte swelling assays at low micromolar concentrations. The newly discovered compounds display no chemical similarity to hitherto known hAQP1 blockers and bind at the extracellular entrance of the channel, close to the ar/R selectivity filter. Futhermore, mutagenesis studies showed that Lys36, which is not conserved among the hAQP family, is crucially involved in binding and renders the discovered compounds suitable as leads for the development of selective hAQP1 inhibitors. © 2012 American Chemical SocietyPeer Reviewe
Analysis of asymmetric methylarginine metabolism by recombinant expressed and native dimethylarginine-dimethylaminohydrolase-2
No full textIn den letzten Jahren wurden verschiedene Wege zur Therapie pathophysiologisch erhöhter Stickstoffmonoxid (NO)-Konzentrationen entwickelt. NO wird aus L-Arginin über die NO-Synthasen (NOS) hergestellt, deren direkte Hemmung derzeit therapeu-tisch nicht genutzt werden kann. Als Alternative wurde daher die Hemmung der Di-methylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) und die Akkumulation ihrer Substrate N ω-Monomethyl-L-arginin (L NMMA) und N ω,N ω'-Dimethyl-L-arginin (ADMA), die endogen die NOS-Enzyme hemmen, interessant. Da nur die mit der DDAH-1 co-lokalisierte neuronale und induzierbare NOS gehemmt werden soll, werden selektive DDAH-1-Inhibitoren benötigt.
Für die Analyse der Isoformen-Selektivität bekannter DDAH-Hemmstoffe wurden die humanen DDAH-Isoformen rekombinant in E. coli hergestellt und gereinigt. Um die Aktivität der Proteine zu prüfen, wurden sie mit den postulierten DDAH-Substraten inkubiert. Im Gegensatz zur rekombinanten hDDAH-1 setzte die hDDAH-2 weder L NMMA und ADMA, noch die alternativ getesteten Substrate S-Methyl-L-thiocitrullin (SMTC) und N ω-Amino-L-arginin zu L Citrullin um.
Da es nicht immer gelingt humane Proteine in E. coli funktionsfähig herzustellen, konnte nach den Ergebnissen nicht sicher von einem Fehlen endogener Enzymaktivi-tät ausgegangen werden. Allerdings wurde die hydrolytische Aktivität der DDAH-2 bereits zu Beginn dieser Arbeit kontrovers diskutiert. Daher wurden Untersuchungen mit den nativen DDAH-Isoformen in porcinem Gewebe durchgeführt. Mittels Western Blot-Analysen wurden eine unterschiedliche Organverteilung für die DDAH-Enzyme ermittelt und repräsentative Gewebe für die Untersuchung der Aktivität nativer DDAHs identifiziert: Die Schilddrüse für die DDAH-2 und die Niere für die DDAH-1. Bei Inkubation aller Gewebe mit ADMA und der Schilddrüse und Niere mit allen vier Substraten, konnte native DDAH-2, im Gegensatz zur DDAH-1, kein Substrat zu L Citrullin abbauen.
Die Ergebnisse der Studien mit nativen und rekombinanten DDAH-Isoformen beleg-ten somit übereinstimmend, dass DDAH-2 keine endogene hydrolytische Aktivität für L-NMMA und ADMA aufweist. Der postulierte Metabolismus ist daher nicht als Aktivi-tätsassay für die DDAH-2 und zur Testung der Isoformen-Selektivität von DDAH-Inhibitoren geeignet. Die physiologische Funktion der DDAH-2 und der Mechanismus über den sie den NO-Stoffwechsel beeinflusst müssen nun weiter erforscht werden.In the last years, different strategies were developed for the therapy of diseases based on pathophysiologically raised nitric oxide (NO) concentrations. NO is synthe-sized from L-arginine by nitric oxide synthase isoenzymes (NOS). Until today, a direct inhibition of NOS to attenuate pathophysiological NO-concentrations is limited by side effects of NOS-inhibitors. Therefore, the inhibition of dimethylarginin-dimethyl-aminohydrolase (DDAH) followed by an accumulation of its substrates N ω-mono-methyl-L-arginine (L NMMA) und N ω,N ω'-dimethyl-L-arginine (ADMA) which are endogenous inhibitors of all NOS-enzymes was a favored alternative. For therapy, exclusive inhibition of inducible NOS (iNOS) and neuronal NOS (nNOS) is crucial. Hence, due to the colocalisation of nNOS/iNOS with DDAH-1, solely selective DDAH 1-inhibitors are of therapeutic interest.
To study the isoform selectivity of known DDAH-inhibitors, human DDAH isoforms are expressed and purified from E. coli. The activity of the enzymes was measured by degradation of the postulated DDAH substrates L-NMMA, ADMA, and alternative substrates S-methyl-L-thiocitrulline (SMTC), and N ω-amino-L-arginine to L citrulline. In contrast to hDDAH 1, neither methylarginines nor alternative substrates were me-tabolized by recombinant hDDAH-2.
Expression of nonfunctional human proteins in E. coli is a common problem, thus the observed lack of intrinsic activity could not reliably be interpreted as an actual state of the enzyme. However, recent works have raised doubts concerning the hydrolytic activity of DDAH-2. Therefore, studies on the activity of native DDAH were carried out in eight porcine tissues. Western blot analyses revealed an organ specific expres-sion pattern for both DDAH isoforms in tissues. In thyroid solely DDAH-2 was detected, in contrast in kidney high amounts of DDAH-1 were found. Seven tissues were incubated with ADMA, furthermore thyroid and kidney cytosols were incubated with all DDAH substrates. Again, neither ADMA nor other DDAH substrates were converted to L citrulline by native DDAH-2 while all substrates were metabolized by tissue DDAH-1.
Taken together, the results with recombinant and native DDAH isoforms are in agreement and clearly indicate that DDAH-2 has no intrinsic hydrolytic activity for methylarginines. Therefore, the postulated metabolism is unsuitable for activity anal-ysis of DDAH-2 and for investigations on isoform selectivity of DDAH inhibitors. The true physiological function of DDAH-2 and the mechanism of the impact on NO me-tabolism have now further to be elucidated
Transportmechanismus und Selektivität der Formiat-Nitrit-Transporter
No full textFormiat-Nitrit-Transporter (FNT) sind in Mikroorganismen für den Transport von kleinen monovalenten Anionen zuständig und somit Schlüsselstoffe im Energiemetabolismus. Vor kurzem wurde der Plasmodium falciparum FNT als entscheidender Laktattransporter des Malariaparasiten identifiziert. FNTs werden als potentielle Wirkstoffziele gegen mikrobielle Infektionen betrachtet.
FNT-Kristalldaten zeigen einen Transportpfad mit zwei lipophilen Konstriktionen, welche ein konserviertes Histidin einschließen. Ziel dieser Arbeit war das Beantworten der Frage, ob und wie Anionen protoniert werden, um die lipophilen Engstellen passieren zu können. Weiterhin wurde die Substratselektivität von eukaryotischen und prokaryotischen FNTs untersucht.
Im Rahmen dieser Arbeit erkannten bioinformatische und funktionelle Untersuchungen einen Substratselektivitätsfilter, welcher sich oberhalb der extrazellulären Konstriktion befindet und über einen Größenausschluss selektiert. Es konnte gezeigt werden, dass sich der Selektivitätsfilter evolutionär von prokaryotischen zu eukaryotischen FNTs erweitert hat, um sich den metabolischen Anforderungen anzupassen.
Die untersuchten FNTs wiesen pH-abhängige Transportprofile auf. Messungen belegten einen Substrat-Protonen-Symport und bestätigten einen einfachen Protonierungsschritt für die Substratneutralisierung.
Die elektrostatische Anziehung des Substratanions konnte einem konservierten Lysin im Poreneingang zugewiesen werden. Durch mathemathische Modelle und Solvationssimulationen wurden pKS-Verschiebungen des Substrates aufgrund einer veränderten dielektrischen Umgebung im Protein bestimmt.
Basierend auf diesen Erkenntnissen konnte folgendes Mechanismus-Modell erstellt werden:
1. Elektrostatische Anziehung des Substratanions zum FNT, 2. gleichzeitige dielektrische Verschiebung der Substratazidität, welche zur Neutralisation bedingt durch einen Proton-Transfer des Bulkwassers führt, 3. Passage des neutralen Substrates durch die lipophilen Engstellen.Formate-nitrite transporters (FNT) regulate the flow of small monovalent acids and are therefore key regulators of the energy metabolism of microorganisms. The eukaryotic FNT of Plasmodium falciparum was recently identified as the malaria parasite’s crucial lactate transporter. FNTs are being considered as potential drug targets for treating microbial infections.
Crystal data of FNTs revealed that two hydrophobic constrictions occlude the transport path, which enclose a conserved histidine.
The objective of this work was to clarify, whether and how substrate anions become protonated for passing the hydrophobic constrictions. Furthermore, it was intended to investigate the substrate selectivity of eukaryotic and prokaryotic FNTs.
Bioinformatic and functional experiments revealed a substrate selectivity filter, which is located above the extracellular constriction and selects by exclusion. It was confirmed that the eukaryotic selectivity filter is widened compared to the prokaryotic filter due to evolutionary changes in metabolic needs.
FNTs revealed a pH-dependent transport profile. Measurements showed a substrate/proton symport and indicated a single protonation step for neutralization. The electrostatic attraction of substrate anions could be assigned to an invariant lysine in the extracellular pore entrance. Mathematical models and solvation simulations were used to identify shifts of substrate acidity as a result of a changed dielectric environment in the protein.
Based on these new insights, the following model of FNT transport mechanism was established:
1. Electrostatic attraction of substrate anions to the FNT, 2. simultaneous dielectric shift of substrate acidity leading to neutralization by means of proton transfer from the bulk solvent, 3. passage of the neutral substrate via the lipophilic constrictions
Expressionssysteme zur Gewinnung von rekombinantem PfFNT zur Reinigung, Funktionsuntersuchung und Kristallisation
No full textPfFNT, ein Laktat-Transporter aus dem Malaria-Erreger P. falciparum, ist aufgrund seiner Rolle im Energiestoffwechsel des Parasiten ein valides Target für die Therapie der Malaria. Ziel dieser Arbeit war es, große Mengen gereinigtes, homogenes und korrekt gefaltetes Protein zu gewinnen, um die später resultierende Kristallstruktur für ein rationales Inhibitordesign nutzen zu können. Die Eignung verschiedener Expressionssysteme sollte für diesen Zweck geprüft werden. Es konnte gezeigt werden, dass PfFNT sowohl in E. coli, P. pastoris und im zellfreien System hergestellt wurde.
Mit einer Ausbeute von mehreren Milligramm Protein pro Milliliter über Nacht, schien die zellfreie Proteinherstellung ein idealer Ausgangspunkt für weitere Reinigungen zu sein. Transportassays nach Rekonstitution in Liposomen verstärkten diesen Eindruck, da diese die Funktionalität und somit korrekte Faltung des PfFNTs zeigen konnten. Des Weiteren konnte ein Faktor Xa Verdau zeigen, dass ein gerichteter Einbau in die Liposomen erfolgte. Diese Entdeckung ermöglichte erstmalig die Messung der physiologischen Transportrichtung.
Trotz dieser Ergebnisse konnten die Elutionsprofile der Gelfiltration nur eine Mischung verschiedener oligomerer Formen zeigen, deren einzelne Oligomere schwer zu isolieren waren. Es konnten allerdings verschiedene oligomere Formen in einer zweiten Reinigung isoliert und für Kristallisationsversuche eingesetzt werden. Ein Proteinkristall konnte in keinem der Versuche gewonnen werden.
In E. coli Zellen konnte ebenfalls PfFNT exprimiert werden, die Ausbeuten waren allerdings gering und fielen vornehmlich als inclusion bodies an. Die weitere Verwendung wurde daher nicht weiter in Erwägung gezogen.
Aus P. pastoris Zellen konnten nach der erfolgreichen Fermentierung mehrere Milligramm PfFNT aus den Membranen solubilisiert werden. Obwohl das Pentamer sich als sehr stabil erwiesen hatte, wurde auch bei dieser Reinigung wieder eine Mischung verschiedener Oligomere gefunden.PfFNT, a lactate transporter of P. falciparum, is due to its role in the energy metabolism a valid drug target for the therapy of malaria. The aim of this work was to receive large amounts of pure, homogenous and correctly folded protein to start crystallization trials, to use this structure in the future for a rational drug design. The suitability of different expression systems should be evaluated for this purpose. It could be shown, that PfFNT was expressed in E. coli, P. pastoris and an E. coli based cell-free system.
With milligram yields of protein per milliliter overnight, the cell-free expression appeared to be an ideal starting point for further purification steps. Transport assays after reconstitution in liposomes strengthened this result, as they revealed functionality in light scattering measurements and therefore native folding of the PfFNT. Furthermore, a factor Xa digest indicated an even orientation in the liposome bilayer. This discovery led, for the first time, to measurements of the physiological transport direction.
However, the elution profiles of size exclusion chromatography revealed a mixture of oligomeric forms, with oligomers hard to isolate, and could not be optimized using several buffer conditions and Fos-Choline instead of Brij78. For this reason crystallization trials were set up with different oligomeric forms which could be extracted in a second run. Crystallization has not yet been successful.
In E. coli, PfFNT could be expressed in very small amounts and mainly as inclusion bodies. It was therefore not taken into consideration for crystallization.
After a successful growth in a bioreactor several milligrams PfFNT could be solubilized with DDM, DM, LDAO and Fos-Cholin 12 of P. pastoris cells. Although the pentamer seemed to be very stable, a mixture of different oligomeric states was found again on a gelfiltration column
Characterization and inhibition of human and plasmodial lactate transporters with particular special consideration of the pentafluoro-3-hydroxy-pent-2-en-1-one
No full textMalaria zählt zu den gefährlichsten durch Parasiten ausgelösten Erkrankungen. Der Erreger Plasmodium falciparum führt jährlich zu Millionen Toden, v.a. in Sub-Sahara Afrika. Außerdem führen Plasmodium-Spezies wie P. vivax, P. malariae, P. ovale und P. knowlesi zu weiteren Krankheits- und Todesfällen weltweit. Die Parasiten haben bereits Resistenzen gegen alle verfügbaren Medikamente gebildet. Ein neues Wirkstoffziel, welches losgelöst von allen anderen bisher adressierten Mechanismen ist, ist der essenzielle Lactat-Transporter PfFNT.
Ein potenter Inhibitor, welcher während eines Screening der Malaria Box gefunden wurde, ist MMV007839. Dieser bildete jedoch im Labormaßstab die
Resistenzmutation PfFNT G107S. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass es möglich ist, diese Resistenzmutante mit nanomolarer Effizienz zu hemmen. Durch die Verwendung eines Hefe-basierten Aufnahmeassays konnte mit 14C-markiertem L-Lactat gezeigt werden, dass das Einfügen eines Stickstoffatoms in die aromatische Komponente der bisherigen Pentafluoro-3-hydroxy-pent-2-en-1-one eine Wasserstoffbrückenbindung zum resistenzauslösenden Serin ausbildet.
Weiterhin ist es dem neuen Inhibitor BH267.meta möglich, in vitro in den Parasiten P. falciparum zu gelangen und diesen mit einer nanomolaren Wirksamkeit abzutöten. Zusätzlich ist es mit BH267.meta möglich, alle FNTs der humanpathogenen Spezies von Plasmodium im Hefe Assay zu inhibieren. Gleiches gilt für PbFNT aus P. berghei, welcher infektiös für Mäuse und andere Nagetiere ist und den ersten Schritt im Tierversuch einer Arzneistoffentwicklung darstellt.
Des Weiteren hatte BH267.meta geringe Affinität zum menschlichen Lactat-Transporter hMCT1, was die Gefahr der Off-Target Effekte reduziert. Ebenso wenig wirkt BH267.meta toxisch auf die humanen Zelllinien HEK293 und HepG2 und hatte keine inhibitorische Wirkung auf den hERG-Kanal. Aufgrund dieser Wirksamkeit und des guten toxikologischen Profils wurden erste Tierversuche im Maus-Modell durchgeführt. Diese zeigten eine in vivo Wirksamkeit gegen P. berghei, vergleichbar mit dem Arzneistoff Artesunat. BH267.meta ist eine Substanz, welche ein hervorragendes toxikologisches Profil aufweist und sowohl in vitro als auch in vivo wirksam ist. Und stellt somit die neue Leitsubstanz für die Entwicklung weiterer PfFNT-Inhibitoren dar
Identification and Characterization of a Novel Voltage Gating Mechanism in Extracellular-pH-sensitive K2P Channels
No full textBy contributing to the establishment of the resting membrane potential and repolarization after an action potential, K2P channels play a major role in the electrical excitability and activity of the cells. In this work I investigated the voltage-dependent gating properties of extracellular pH (pHex) sensitive K2P channels (TASK, TALK and TWIK subfamilies) and discovered a novel voltage-sensing mechanism. Unlike the canonical voltage-activated ion channels (CaV, KV and NaV) that use a charged membrane domain to sense voltage, the voltage sensor in K2P channels is formed by the selectivity filter which gates open or close in response to rearrangement of the ions within it. The rearrangement is determined by both the permeant ion species and direction of the ion flow. Outward flow of the ions leads to opening of filter whereas the inward flow shots the filter closed. To explain the underlining structural mechanisms of this “ion-flux check valve” gating, in this study, two distinct but intertwined mechanisms are introduced, namely the “Pause-and-Turn” and the “Ion Zipper” models. I also show that mutations within the selectivity filter can abolish the voltage gating of the pHex sensitive K2P channel and make them permanently open at all voltages, which emphasizes the role of the selectivity filter for voltage gating.
TWIK-1 channels exhibit little activity in cells. Similar to other K2P channels, TWIK-1 shows voltage activation with non-physiological ions such as Rb+. But this voltage activation is independent of the ion flow direction and blocked by unusual low K+ concentrations. In addition, TWIK-1 activity is inhibited by intracellular H+ resulting in low activity at physiological pH. In summary, these unusual gating features in TWIK-1 can explain the low activity of these channels in the plasma membrane.Die Familie der K2P Kanäle zählt 15 humane Mitglieder, die maßgeblich an der Etablierung des Ruhemembranpotentials und der Repolarisation von Aktionspotentialen beteiligt sind. In dieser Arbeit wurde die Aktivierung von TASK, TALK und TWIK Unterfamilien durch Veränderung der Membranspannung untersucht. Diese Kanäle werden alle durch den extrazellulären pH reguliert und hier als pHex-regulierte K2P Kanäle zusammengefasst. Ich konnte zeigen, dass diese Kanäle durch einen neuartigen Mechanismus auf Änderungen der Spannung reagieren. Kanonische spannungsabhängige Ionenkanälen benutzen eine geladene Membrandomäne. Der Spannungssensor in K2P Kanälen befindet sich hingegen im Selektivitätsfilter,dessen Ionenbesatz sich in Abhängigkeit der permierenden Ionenspezies und der Membranspannung ändert. Dabei zeigte sich, dass die Auswärtsbewegung von Ionen den Filter öffnet, während Einwärtsbewegung den Filter schließt. Um diesen stromrichtungsabhängigen „Ventilklappenmechanismus“ zu erklären, werden zwei unterschiedliche, aber miteinander verwobene Mechanismen dargestellt – ein „Pause and Turn“ und ein „Ion-Zipper“ Mechanismus.
Im Gegensatz zu den meisten anderen K2P Kanälen zeigen TWIK-1 Kanäle nur kleine Ströme in Zellen. Um dieses Eigenschaft besser zu verstehen, habe ich das spannungsabhängige Schaltverhalten der TWIK-1 Kanälen untersucht. TWIK-1 Kanäle werden ebenso wie viele andere K2P Kanäle durch nicht-physiologische Ionen wie Rb+ stark aktiviert, aber die aktivierten Ströme zeigten keine Abhängigkeit von der Stromrichtung (fehlender „Ventilklappenmechanismus“) und wurden außerdem durch ungewöhnlich niedrige K+ Konzentration blockiert. Des Weiteren zeigen TWIK-1 Kanäle eine deutlich Inhibition durch intrazelluläre H+ im physiologischen pH Bereich. Diese ungewöhnlichen Schalteigenschaften der TWIK-Kanäle (d.h. geringe Spannungsaktivierung und starke intrazelluläre pH Inhibition) erklären die sehr niedrige Aktivität von TWIK-1 Kanälen in der Zellmembran
Untersuchungen zur Ammoniakleitfähigkeit von Aquaporinen
No full textAmmonia is a molecule similar in size and polarity to water, yet its rate of permeation through water-selective aquaporins (AQP) is comparatively low.
The amino acids lining the narrowest region of the water-selective rat AQP1, the so-called aromatic/arginine (ar/R) constriction, were altered by site-directed mutagenesis so as to resemble the corresponding region in the water- and ammonia-permeable human AQP8.
The resulting AQP1 mutants were tested for water permeability by osmotic assays with Xenopus laevis oocytes and with protoplasts of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Permeability for ammonia and its analogue methylamine were tested with yeast growth assays.
All AQP1 mutants retained water permeability to some degree, even the H180F mutant which is expected to have an ar/R constriction narrower than that of the wild-type channel.
Ammonia- and methylamine permeability was found in those AQP1 mutants which had an alanine or isoleucine in place of Histidine 180, the latter being the corresponding amino acid in AQP8. In the case of ammonia, leucine was also permissible.
Human and rat AQP8 mutants with histidine in place of Isoleucine 198 and 200, respectively, retained water permeability. Their ammonia and methylamine permeability could not be studied by yeast growth assays.
The ammonia influx assay makes use of a yeast strain lacking its ammonium transporters Mep1-3 as well as its ammonia-permeable aquaglyceroporin Fps1. It was found to indicate elevated ammonia tolerance at neutral or mildly alkaline pH, rather than facilitated influx of ammonia as nitrogen source. In addition, replacing ammonium ions by amino acids such as glutamine did not completely abolish this pH-dependent effect.
The methylamine efflux assay makes use of a yeast strain lacking its aquaglyceroporin Fps1 which would otherwise allow accumulated toxic methylamine to escape from the cell. It was found to indicate increased tolerance of yeast to pH 6.5 and 7.5, even in the absence of methylammonium in the growth medium.
Yeast growth assays and osmotic assays with yeast protoplasts and human erythrocytes were employed for the study of potential inhibitors of human AQP1, AQP9, and of Plas-modium falciparum AQP. The substances had been discovered by collaborators using in silico high-throughput screening. No test compound was found to be active. Inhibition of human AQP1 by mercuric chloride, and of human AQP9 by mercuric chloride and phloretin, was confirmed.Das Ammoniakmolekül ähnelt dem Wassermolekül hinsichtlich seiner Größe und seiner Polarität. Trotzdem ist seine Permeationsrate durch wasserselektive Aquaporine (AQP) ver-hältnismäßig gering.
Die aromatische/Arginin (ar/R)-Konstriktion des wasserselektiven AQP1 der Ratte, wurde durch einzelne sowie durch mehrfache gezielte Punktmutationen von Aminosäuren so geän-dert, dass sie der ar/R-Konstriktion des Wasser und Ammoniak leitenden AQP8 ähnelte.
Die erhaltenen AQP1-Mutanten wurden in osmotischen Tests mit Xenopus laevis Oozyten und Protoplasten der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae auf ihre Wasserleitfähigkeit hin untersucht. Ammoniak- und Methylaminleitfähigkeit wurden in Hefewachstumstests geprüft.
Alle AQP1-Mutanten wiesen Wasserleitfähigkeit auf, sogar AQP1 H180F, dessen ar/R-Kon-striktion wahrscheinlich schmaler ist als die des Wildtypkanals.
Ammoniak- und Methylaminleitfähigkeit wurden festgestellt für AQP1-Mutanten in denen Histidin 180 durch Alanin oder Isoleucin ausgetauscht worden ist. Bezüglich der Ammoniak-leitfähigkeit war Leucin an dieser Stelle ebenfalls einsetzbar.
Die Wasserleitfähigkeit des AQP8 des Menschen und der Ratte blieb nach Austausch von Isoleucin 198 bzw. Isoleucin 200 durch Histidin bestehen. Ihre Ammoniak- und Methylamin-leitfähigkeit konnte mittels Hefewachstumstests nicht überprüft werden.
Der Ammoniakinfluxtest bedient sich eines Hefestammes welchem die Ammoniumtrans-porter Mep1-3 und das Ammoniak leitende Aquaglyceroporin Fps1 fehlen. Er zeigte eine durch heterologe AQP erhöhte Ammoniaktoleranz bei neutralem oder leicht alkalischem pH an, nicht jedoch den erleichterten Einstrom von Ammoniak als Stickstoffquelle. Außerdem konnte der Austausch von Ammoniumionen durch Aminosäuren, z. B. Glutamin, diesen pH-abhängigen Effekt nicht vollständig eliminieren.
Der Methylamineffluxtest bedient sich eines Hefestammes dem das Aquaglyceroporin Fps1 fehlt, welches ansonsten den Ausstrom von aufgenommenem, toxischem, Methylamin ermöglichen würde. Er zeigte eine zusätzliche methylaminunabhängige AQP-vermittelte Toleranz der Hefe gegenüber pH Werten von 6,5 und 7,5 an.
Hefewachstumstests und osmotische Tests mit Hefeprotoplasten und humanen Erythro-cyten wurden zur Untersuchung von potentiellen Inhibitoren der humanen Aquaporine AQP1 und AQP9, sowie des Plasmodium falciparum AQP, verwendet. Die Testsubstanzen waren von Kooperationspartnern mittels in silico Hochdurchsatz-Screening gefunden worden. Keine der Substanzen zeigte Aktivität. Die Blockierung von menschlichem AQP1 durch Queck-silber(II)chlorid, sowie von menschlichem AQP9 durch Quecksilber(II)chlorid und Phloretin, konnte bestätigt werden
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