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Setting up of molecular tools for studying abscission in apple (Malus x domestica)
No full textAbscission is a natural self-regulatory mechanism whereby fruit trees shed part of the fruitlets, and is an important agricultural event from the farmer’s point of view because it directly affects the final size and quality of the commodity. In spite of this self-regulatory mechanism, fruit trees set too many fruitlets negatively affecting not only the final quality, but also the returning bloom. To avoid these effects, farmers perform blossom or fruitlet thinning to adjust crop load and ensure a satisfactory fruit quality at harvest for commercial purposes. Chemical thinning is nowadays a common orchard practice in some apple cultivars but its effects on fruit trees depend on environmental factors and genotypes. A widely employed chemical thinner, the carbaryl (Sevin), has been withdrawn from the market and replaced with benzyladenine (BA), a cytokinin that has a milder effect both on the tree and human health.
At molecular level, abscission is a coordinated event under the control of auxin and ethylene. Both hormones play their role at the abscission zone (AZ) level. Auxin flux through the AZ target cell layers inhibits the onset of shedding whereas ethylene causes the up-regulation of degrading cell wall enzymes causing the cell separation and the fruitlet shedding. Nevertheless, no information is available about the signalling that causes the decreasing auxin flow and the gain in ethylene sensitivity in AZ.
In Arabidopsis thaliana, the isolation of mutants with defects in floral organ abscission allowed the identification and characterization of genes involved in AZ differentiation and/or the signalling pathways. A model has been proposed by characterizing genes encoding receptors and ligands involved in the transfer of the shedding signal.
In apple, a model to explain the fruitlet physiological drop is still missing as well as the isolation and characterization of genes involved in abscission. Although most of the researchers focused their attention mainly on the effect of chemicals on fruit quality and returning bloom, few of them considered also the dynamics of the transcriptomic changes occurring as consequence of the abscission induction. A working hypothesis taking into account the carbohydrate status within the fruitlet population and between fruitlets and shoots has been proposed.
The recent development of massive gene approaches, based on microarray technologies, allowed to deeply investigate many fundamental biological process from a transcriptomic point of view. A recent work carried out in tomato investigated the genes involved in auxin homeostasis, as a consequence of IAA depletion during flower abscission induction. The model proposed represents a powerful platform for further analyzing the putative regulatory abscission-related genes involved in the gaining of ethylene sensitivity of the AZ.
In the present dissertation, two different approaches have been adopted to investigate the early phases of apple fruitlet abscission: 1) A transcriptomic approach to isolate genes involved in the early steps of abscission, and 2) the characterization of volatile organic compounds (VOCs) emitted during abscission induction.
1) Apple fruitlet abscission was induced using BA as thinner. Fruitlets differing in size and position within the cluster were collected over a 4-day time-course, after BA treatment, and their gene expression profiles were analyzed, separately in cortex and seeds, by means of a newly released 30K oligonucleotide microarray. The analysis of the transcriptomic profiles of abscising and non-abscising fruitlets was tested for statistical association with abscission potential to identify molecular signatures strictly related to fruit destiny. Reactive oxygen species (ROS) and carbohydrates (glucose, fructose, sucrose, sorbitol, and starch) were also measured. A hypothetical model for apple fruitlet abscission was obtained by putting together available transcriptomic and metabolomic data. According to this model, BA treatment would establish a nutritional stress within the tree that is primarily perceived by the fruitlet cortex whose growth is blocked by resembling the ovary growth inhibition found in other species. In weaker fruits, this stress is soon visible also at the seed level, likely transduced via ROS/sugar and hormones signalling crosstalks, and followed by a block of embryogenesis and the consequent activation of the abscission zone.
2) Fruitlets of two cultivars (Golden Delicious and Red Chief) with different abscission potentials treated with two different thinning agents (BA and metamitron) were analyzed by means of proton transfer reaction mass spectrometer (PTR-MS) over a 10-day time-course looking for volatile organic compounds (VOCs) differentially emitted. Results pointed out that isoprene is more abundantly emitted by the abscising fruitlets in both cultivars. A relationship between isoprene emission and ABA content in the fruit cortex was also pointed out, along with a specific activation of the corresponding biosynthetic genes. A delayed transcriptional activation of a biosynthetic gene involved in a key step of methyl-erythritol phosphate (MEP) pathway, supplying the precursors for both isoprene and ABA biosynthesis, was also shown. According to the main findings, a role for isoprene as a ROS-detoxifying mechanism mediated and transcriptionally controlled by ABA may be hypothesized.
Future perspectives will be focused on all the research lines herein adopted. The biological function of the genes identified by means of the transcriptomic approach will be studied at the cellular level, with in situ hybridization, and their expression pattern further validated. Attention will be focused in particular on transcription factors and other regulatory elements involved in hormonal cross-talk. The abscission-related VOCs (i.e. isoprene) will be validated to assess the possible applications in fruit load prediction systems, in order to fine-tune the use of thinning chemicals according to a more-environment-friendly agriculture.L'abscissione è un meccanismo auto-regolativo per cui gli alberi da frutto rilasciano naturalmente parte dei frutticini ed è un evento agronomico importante dal punto di vista del produttore perché incide sulla qualità del raccolto a maturazione. Nonostante questo meccanismo auto-regolativo, gli alberi da frutto trattengono troppi frutticini, influendo negativamente non solo sulla dimensione e la qualità finale dei frutti, ma anche sulla fioritura nell’anno successivo. Per evitare questi effetti negativi, i coltivatori utilizzano comunemente diradanti chimici che agiscono su fiori o frutticini, allo scopo di regolare il carico iniziale ed ottenere così una qualità della frutta corrispondente alle esigenze di mercato. In melo il diradamento chimico è una pratica comune la cui efficacia sugli alberi da frutto è dipendente, purtroppo, da fattori ambientali e dai diversi genotipi. Un diradante chimico ampiamente utilizzato, il carbaryl (Sevin), è stato ritirato dal mercato e parzialmente sostituito con la benziladenina (BA), una citochinina che ha un effetto più contenuto sull'albero e sulla salute umana.
A livello molecolare, l'abscissione è un processo coordinato principalmente dall'auxina e dall'etilene. Entrambi questi ormoni svolgono il loro ruolo a livello della zona di abscissione (AZ). Il flusso continuo dell'auxina attraverso la AZ inibisce il processo di abscissione, mentre l'etilene induce una regolazione positiva degli enzimi degradanti la parete cellulare provocando la separazione delle cellule della AZ e la caduta dei frutticini. Le informazioni riguardanti il segnale che causa la diminuzione del flusso di auxina e l'aumento nella sensibilità all'etilene nella AZ sono tuttavia ancora parziali e piuttosto carenti. In Arabidopsis thaliana l'isolamento di mutanti con difetti nel processo di abscissione dei fiori ha permesso l'individuazione di geni coinvolti o nel processo di differenziazione della AZ o nella via di trasduzione del segnale. Per quanto riguarda la cascola fisiologica dei frutticini in melo, le informazioni riguardanti il segnale che genera l’evento abscissione sono tuttora carenti e le collezioni di geni legati a tale fenomeno sono ancora molto parziali. La maggior parte delle ricerche, infatti, si è concentrata principalmente sullo studio dell’effetto di prodotti chimici sulla qualità della frutta e sulla fioritura, mentre solamente pochi studi hanno considerato la dinamica dei cambiamenti trascrizionali conseguente all'induzione dell’abscissione. Sulla base dei dati disponibili, è stata proposta l’ipotesi che considera lo stato nutrizionale all’interno della popolazione di frutticini e fra i fruitticini ed i germogli vegetativi come segnale necessario per l’attivazione dell’abscissione. Recentemente, lo sviluppo di approcci trascrittomici di carattere massale, basato sulle tecnologie microarray, ha consentito di studiare in maniera più approfondita questo processo biologico. Un recente studio effettuato in pomodoro ha permesso di studiare geni coinvolti nel mantenimento dell’omeostasi dell'auxina a livello di AZ in seguito ad una diminuzione del flusso della stessa durante l'induzione dell’abscissione nel fiore. Il modello proposto rappresenta un punto di partenza molto rilevante per identificare altri geni coinvolti nella regolazione dell’abscissione e nella sensibilizzazione dell’AZ all'etilene.
In questa tesi sono stati impiegati due differenti approcci per studiare l’abscissione in melo: 1) Un approccio massale trascrittomico per isolare i geni strettamente coinvolti nelle prime fasi induttive dell’abscissione e 2) lo studio di composti organici volatili (VOCs) emessi durante l’induzione dell’abscissione.
1) L'abscissione di frutticini di melo è stata indotta usando la BA come agente diradante. Frutticini differenti per dimensione e posizione all'interno del corimbo sono stati raccolti entro i quattro giorni dal trattamento. L'espressione genica è stata analizzata per mezzo di un vetrino 30K recentemente sviluppato. L'analisi dei profili trascrizionali dei frutticini cascolanti e non cascolanti è stata esaminata allo scopo di identificare marcatori molecolari associati al destino del frutto. Il livello di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e di alcuni carboidrati (glucosio, fruttosio, saccarosio, sorbitolo e amido) è stato misurato nella cortex degli stessi campioni. Un modello ipotetico per l’abscissione di frutticini di melo è stato ottenuto unendo i dati trascrittomici e metabolomici disponibili. Secondo questo modello, il trattamento con la BA amplificherebbe lo stress nutrizionale già in atto all'interno dell'albero, il quale viene percepito soprattutto dalla cortex di frutticini il cui sviluppo viene quindi bloccato. Nei frutti più deboli, questo stress viene quindi percepito a livello del seme. La traduzione di questo stress avviene probabilmente attraverso il crosstalk tra ROS, zuccheri e ormoni ed è seguito da un blocco dell'embriogenesi e dall'attivazione della AZ.
2) Frutticini di due diverse cultivar (Golden Delicious e Red Chief) con differente potenziale di abscissione trattati con due differenti diradanti chimici (BA e metamitron) sono stati analizzati per mezzo del PTR-MS (proton transfer reaction mass-spectrometer), entro i dieci giorni dal trattamento, allo scopo di identificare composti organici volatili (VOCs) associati all’abscissione. I risultati hanno evidenziato che i frutticini con potenziale di abscissione maggiore in entrambe le cultivar emettono più isoprene rispetto ai frutti persistenti. E’ stata inoltre evidenziata una correlazione significativa tra emissioni di isoprene e contenuto di ABA della cortex, parallelamente all’attivazione specifica dei rispettivi geni biosintetici. Successivamente avviene l’attivazione ritardata dei geni coinvolti nei passaggi chiave della via del metileritritolo fosfato (MEP), che fornisce i precursori per la biosintesi sia del volatile che dell’ormone. Secondo questi risultati, si può ipotizzare per l’isoprene un ruolo di detossificatore di ROS, la cui attivazione è mediata e controllata a livello trascrizionale dall’ABA.
Le prospettive future di questa ricerca saranno focalizzate su tutte le linee di ricerca finora perseguite. La funzione biologica dei geni identificati tramite l’approccio trascrittomico sarà ulteriormente studiata a livello cellulare, tramite ibridazioni in situ, e i loro profili di espressione genica saranno ulteriormente validati. Particolare attenzione sarà prestata ai fattori di trascrizione e agli altri elementi regolativi coinvolti nel cross-talk ormonale. Per quanto attiene i composti volatili (isoprene) saranno validati i risultati finora ottenuti allo scopo di verificare possibili applicazioni pratiche in sistemi previsionali che consentano di predire il livello di carica fruttifera e, quindi, di dosare i trattamenti diradanti nell’ottica di un’agricoltura sostenibile
Identificazione dei geni coinvolti nell’induzione dell’abscissione in melo (Malus domestica L. Borkh) tramite l’impiego di un microarray 30k
No full textL’abscissione dei frutticini di melo (Malus domestica L. Borkh) è il risultato di complesse interazioni sia ormonali che metaboliche, nell’ambito delle quali etilene e auxina rivestono un ruolo fondamentale nel controllare il distacco del frutto dalla pianta. Nell’ambito del corimbo, i frutti laterali che presentano ritmi di crescita ridotti sono soggetti ad una cascola più consistente rispetto al frutto centrale che, a seguito di una fioritura più precoce, cresce in un contesto di minor competizione. La cascola naturale dei frutticini risulta, tuttavia, insufficiente ad assicurare una produzione ottimale di frutti ed è quindi richiesto l’impiego di diradanti chimici allo scopo di magnificarne gli effetti ed ottenere così una produzione adatta alle esigenze del mercato. Specifici esperimenti sono stati condotti al fine di determinare gli eventi molecolari coinvolti nell’induzione dell’abscissione. A tale scopo, tramite l’impiego della benziladenina (BA), una citochinina impiegata come diradante chimico, è stata amplificata la cascola naturale e, sulla base di tre intervalli dimensionali, sono stati campionati i frutti laterali e centrali, trattati e non trattati, ottenendo così popolazioni di frutticini con potenziali di abscissione differenziali. Gli RNA estratti da cortex e semi di tali campioni sono stati utilizzati per l’analisi microarray, condotta utilizzando un vetrino allestito con la tecnologia Combimatrix sul quale sono stati spottati più di 30.000 geni, assemblati a partire dalle ESTs di melo disponibili nei database pubblici. L’analisi trascrittomica ha portato all’identificazione di geni differenzialmente espressi in maniera specifica nei frutti con alto potenziale di abscissione. Per quanto riguarda la cortex 165 e 27 geni sono risultati, rispettivamente, stimolati e repressi durante l’induzione della cascola. All’interno di questo pool genico sono stati individuati geni coinvolti nella biosintesi e nel metabolismo ormonale (GA2-ossidasi, IAA-idrolasi), nella percezione (GID1, BAK1) e nella trasduzione (EIL2, ARF3) del segnale ormonale, nella degradazione della parete cellulare (estensina, pectato-liasi, endoglucanasi), nel metabolismo degli zuccheri (fruttosio bisfosfato aldolasi, invertasi acida vacuolare, saccarosio-sintasi) e numerosi fattori di trascrizione (WRKY, MYB, MYC, NAC). L’analisi del trascrittoma di seme ha permesso di isolare 15 e 13 trascritti rispettivamente stimolati o repressi durante l’induzione dell’abscissione, tra i quali alcuni coinvolti nel metabolismo dei carboidrati (fruttosio bisfosfatasi, glucosil-idrolasi), una chinasi proteica e un fattore di trascrizione di tipo MADS. Analisi di validazione del profilo di espressione di tali geni, tuttora in corso, consentiranno di identificare gli elementi molecolari chiave che controllano le fasi precoci dell’abscissione in melo
Transcriptional signatures associated with apple fruitlet abscission
No full textApple (Malus x domestica L. Borkh) represents an interesting model tree crop for studying fruit abscission. The physiological fruitlet drop occurring in this species can be easily magnified by using thinning chemicals, such as benzyladenine (BA), in order to obtain fruits with improved quality and marketability. Despite the economical importance of this process, the molecular determinants of apple fruitlet abscission are still unknown. In the present research, BA was used to obtain fruitlet populations with different abscission potentials, to be analysed by means of a 30,419 oligonucleotide microarray set up starting from about 256,000 expressed sequence tag (EST) sequences available in public database. A dedicated bioinformatic pipeline was created to cluster and assemble the available ESTs into temptative unigenes that were spotted by means of the CombiMatrix technology. RNAs were extracted from cortex and seed of apple fruitlets sampled over a 4-day timecourse, during which BA triggers fruit drop, and used for microarray hybridisation. Transcriptomic profiles of persisting and abscising fruitlets were tested for statistical association with abscission potential, allowing to identify molecular signatures strictly related to fruit destiny with P < 0.001. A hypothetical model for apple fruitlet abscission was obtained by putting together available transcriptomic and metabolomic data. According to this model, BA treatment would establish a nutritional stress within the tree that is primarily perceived by the fruitlet cortex whose growth is inhibited. In weaker fruits, this stress is soon transduced to the seed via sugar signalling and hormones, followed by a block of embryogenesis and the consequent activation of the abscission zone. The molecular markers herein discovered may be used as diagnostic tools for the early identification of the self- or chemical-thinning aptitude of apple cultivars. Moreover, the functional characterization of markers with the best statistical scores will allow to shed light on the early cellular processes triggering apple fruitlet abscission
Roles of Ethylene Production and Ethylene Receptor Expression in Regulating Apple Fruitlet Abscission
No full textApple (Malus × domestica) is increasingly being considered an interesting model species for studying early fruit development, during which an extremely relevant phenomenon, fruitlet abscission, may occur as a response to both endogenous and/or exogenous cues. Several studies were carried out shedding light on the main physiological and molecular events leading to the selective release of lateral fruitlets within a corymb, either occurring naturally or as a result of a thinning treatment. Several studies pointed out a clear association between a rise of ethylene biosynthetic levels in the fruitlet and its tendency to abscise. A direct mechanistic link, however, has not yet been established between this gaseous hormone and the generation of the abscission signal within the fruit. In this work, the role of ethylene during the very early stages of abscission induction was investigated in fruitlet populations with different abscission potentials due either to the natural correlative inhibitions determining the so-called physiological fruit drop or to a well-tested thinning treatment performed with the cytokinin benzyladenine. A crucial role was ascribed to the ratio between the ethylene produced by the cortex and the expression of ethylene receptor genes in the seed. This ratio would determine the final probability to abscise. A working model has been proposed consistent with the differential distribution of four receptor transcripts within the seed, which resembles a spatially progressive cell-specific immune-like mechanism evolved by apple to protect the embryo from harmful ethylene
Giulia Veronica Varisco
No full textThe headword explains the biography and the contribution of the author Giulia Varisco to the children's literatur
Profili trascrizionali dei geni coinvolti nella biosintesi e trasduzione del segnale etilenico durante l’abscissione dei frutticini in melo
No full textL’abscissione dei frutticini di melo è preceduta da una stimolazione della biosintesi dell’etilene e un aumento della sensibilità della zona di abscissione (AZ) agli stimoli promossi dall’ormone. Recentemente, è stato ipotizzato il ruolo dell’etilene come “carrier” del segnale abscissione che, generato nella cortex mediante l’instaurazione di un cross-talk con ABA, zuccheri e ROS, viene trasferito al seme nelle fasi che precedono l’attivazione dell’AZ. Rimangono tuttavia ancora molti aspetti da chiarire. A tal proposito, è stata condotta un’approfondita indagine a livello trascrizionale dei geni coinvolti nella biosintesi e trasduzione del segnale etilenico in cortex e seme di frutticini di melo trattati con benziladenina (BA). Sono stati identificati nella sequenza genomica 80 geni codificanti elementi della biosintesi (ACO e ACS), percezione (ETR, ERS, TPR e RTE) e trasduzione del segnale (CTR, EIN2 e EIN3/EIL), regolatori coinvolti nell’ubiquitinizzazione e degradazione mediante proteasoma (EBF e ETP) e altri elementi noti (EIN5 e RAN1). Inoltre, 13 geni codificanti chinasi (MAPK e MAPKK), coinvolte nella presunta via trasduttiva del segnale coordinata da CTR, sono stati presi in esame in questo lavoro. Un elevato livello di ridondanza è stato riscontrato per la maggior parte dei geni, probabilmente dovuto all’origine del genoma del melo e al recente evento di duplicazione a cui è andato incontro. In seguito, sono stati analizzati i profili trascrizionali dei geni identificati in cortex e seme di frutticini caratterizzati da diversi potenziali di abscissione. I risultati preliminari hanno evidenziato una notevole tessuto-specificità di espressione dei geni analizzati e differenze trascrizionali che potrebbero coordinare l’attivazione del segnale primario specifico dell’abscissione. Questo studio è finanziato dal Progetto AGER, grant n° 2010-2119
L'induzione dell'abscissione dei frutticini di melo è caratterizzata da un aumento coordinato dei livelli di acido abscissico e della produzione di isoprene
No full textDurante la fase induttiva del processo di abscissione dei frutticini di melo (Malus domestica L. Borkh) si attuano, a livello della cortex, profondi cambiamenti a livello trascrizionale e metabolico. Nel melo, sistema modello per lo studio dell’abscissione dei frutti, è possibile indurre selettivamente la cascola di frutticini in posizione specifiche del corimbo, tramite l’impiego di diradanti chimici, come la benziladenina e il metamitron, che agiscono amplificando il potenziale naturale di cascola. Nella presente ricerca è stato condotto uno studio metabolomico dei componenti volatili (VOCs) emessi dai frutticini abscindenti, consentendo di identificare l’isoprene come marcatore precoce dell’induzione dell’abscissione. La produzione di questo volatile, associata alla stimolazione dell’espressione di un gene specifico codificante una isoprene sintasi (ISPS) e mirata a disintossicare il frutto dai radicali liberi dell’ossigeno (ROS) prodotti in questa fase, è fortemente correlata ai livelli di acido abscissico (ABA) prodotto a livello della cortex dei frutticini. I livelli di ABA aumentano transitoriamente durante l’induzione dell’abscissione e sono associati all’induzione trascrizionale di un gene NCED (9-cis-epossicarotenoide diossigenasi) specifico. Secondo un modello ipotetico, l’ABA potrebbe cooperare in maniera transitoria con altri ormoni e/o altri messaggeri secondari nella generazione di un segnale intra-frutto che porta all’attivazione a valle della zona di abscissione. Il processo di separazione dei frutticini, quindi, sembra essere orchestrato da vie trasduttive multiple, la cui regolazione, esercitata entro una finestra temporale molto breve da stimoli endogeni e/o esogeni, determina il destino finale dei frutticini. In questo contesto, il ruolo della cortex come “sentinella” del seme viene ancora una volta confermato. Questo studio è finanziato dal Progetto AGER, grant n° 2010-2119
Flooding responses on grapevine: a physiological, transcriptional and molecular perspective
No full textEarly induction of apple fruitlet abscission is characterized by an increase of both isoprene emission and abscisic acid content
No full textApple (Malus domestica L. Borkh) fruitlet abscission represents an interesting model system to study the early phases of the shedding process, during which major transcriptomic changes and metabolic rearrangements occur within the fruit. In apple, the drop of fruits at different positions within the cluster can be selectively magnified through chemical thinners, such as benzyladenine and metamitron, acting as abscission enhancers. In the present research, different abscission potentials were obtained within the apple fruitlet population by means of the above cited thinners. A metabolomic study was conducted on the volatile organic compounds (VOCs) emitted by abscising fruitlets, allowing to identify isoprene as an early marker of abscission induction. A strong correlation was also observed between isoprene production and abscisic acid (ABA) levels in the fruit cortex, which were shown to increase in abscising fruitlets with respect to non-abscising ones. Transcriptomic evidence indicated that abscission-related ABA is biologically active and its increased biosynthesis is associated with the induction of a specific ABA-responsive NCED (9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase) gene. According to a hypothetical model, ABA may transiently cooperate with other hormones and secondary messengers in the generation of an intra-fruit signal leading to the downstream activation of the abscission zone. The shedding process therefore appears to be triggered by multiple interdependent pathways, whose fine regulation, exerted within a very short temporal window by both endogenous and exogenous factors, determines the final destiny of the fruitlets
A time-course model for BA action in apple fruitlet thinning
No full textBenzyladenine (BA) is a well known synthetic cytokinin broadly used as a thinning agent in apple orchards. BA has numerous physiological effects, strictly dependent upon the tree developmental stage, the concentration of the chemical and the environmental conditions at the time of spraying. The enhanced ethylene evolution observed in BA-treated apple leaves and fruits may be one of the key factors that trigger the physiological processes leading to fruitlet abscission. In order to shed light on the ethylene-related events occurring during abscission, a time-course model for BA action was developed based upon physiological data obtained by combining the use of BA either with AVG (aminoethoxyvinylglycine), or 1-MCP (1-methylcyclopropene), blocking ethylene biosynthesis and perception, respectively. The results confirm the bimodal action of BA through ethylene, acting first on shoot growth and then, most likely indirectly, promoting fruitlet abscission. Based on a 24 hours-resolution time-course, a very fast action of BA was observed within 24 h from the treatment. A parallel antagonist effect was exerted by AVG within 24-48 h. This model, currently under validation, was confirmed to be a very reliable system for studying fruitlet abscission in apple
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