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Studio della cinetica di biotrasformazione di pesticidi e tossine naturali per l’identificazione di marcatori di esposizione e suscettibilità e di possibili gruppi di popolazione a maggior rischio
Full text linkQuotidianamente l’organismo è esposto a numerose sostanze esogene, dette xenobiotici, come pesticidi o tossine naturali. Tutte queste sostanze sono caratterizzate da un certo grado di lipofilicità, quindi possono attraversare la membrana fosfolipidica ed essere assorbite dalle cellule. Per questo l’organismo mette in atto processi per rendere più idrofile tali sostanze in modo che possano essere eliminate più facilmente, ad esempio attraverso urina sudore e feci, vie di escrezioni a base acquosa. I processi metabolici avvengono per lo più nel fegato, ma gli enzimi coinvolti possono ritrovarsi anche in altri organi come intestino, polmoni e reni. Gli enzimi del metabolismo degli xenobiotici vengono indicati come enzimi di fase I o II. Gli enzimi di fase I attraverso processi di idrolisi (es: le paraoxonasi o PON) o di monossidazione (es: citocromo P450 o CYP) scoprono e trasformano gruppi funzionali rendendo la molecola parentale più idrofila, e substrato degli enzimi detti di fase II, come glutatione-S-Trasferasi (GST) o le glucoronil-trasferasi (UGT), che coniugano lo xenobiotico o il suo metabolita di fase I con molecole endogene altamente idrofile, come per esempio il glutatione o l’acido glucuronico: questi processi rendono la molecola più facilmente eliminabile. Il metabolita formato può risultare anche più tossico del composto parentale per cui si parla di bioattivazione mentre se si trasformano i composti in sostanze meno tossiche si parla di detossificazione. La maggior parte degli enzimi coinvolti nel metabolismo di sostanze esogene e in alcuni casi anche endogene (es: ormoni steroidei o tiroidei) sono in realtà famiglie enzimatiche formate da varie isoforme che spesso presentano specificità di substrato sovrapponibile ma differente efficienza catalitica. Inoltre ciascuna isoforma può essere polimorfica, cioè essere codificata da varianti genetiche presenti nella popolazione in percentuali maggiori dell’1% in base alle quali l’attività catalitica può essere diversa. Per questa ragione si può parlare di metabolizzatori lenti, rapidi e ultrarapidi che, presentando una diversa attività metabolica, possono rispondere in maniera differente alle stesse dosi di esposizione esterna a xenobiotici, determinando una diversa dose interna al bersaglio. Le conseguenze possono essere che individui caratterizzati da polimorfismi diversi possono avere a parità di esposizione ad un farmaco possono avere la risposta terapeutica attesa o reazioni avverse o ridotta attività terapeutica; questo determina anche una diversa suscettibilità agli effetti tossici di contaminanti ambientali. Da qui risulta evidente l’importanza di conoscere il pathway metabolico, gli enzimi coinvolti ed i parametri cinetici di una sostanza nell’uomo in modo da poter identificare nella popolazione esposta gruppi suscettibili.
Il lavoro di tesi si è inserito all’interno di un Progetto Europeo, finanziato da EFSA (autorità Europea per la sicurezza alimentare) coordinato dal laboratorio in cui ho lavorato, dal titolo ”Modelling human variability in toxicokinetic and toxicodynamic processes using Bayesian meta-analysis, physiologically-based (PB) modelling and in vitro systems “, che prevedeva di produrre dati sperimentali che fossero un input per modelli cinetici. In particolare sono stati studiati: i) il metabolismo di alcune microcistine (MCs) con l’identificazione delle isoforme di GST coinvolte nella loro detossificazione, ii) il loro assorbimento intestinale mediante un sistema in vitro 3D per individuare i trasportatori coinvolti, iii) la bioattivazione del pesticida organofosforico Phosmet (Pho) metabolizzato dalle isoforme del CYP450 al metabolita neurotossico Phosmet-oxon (PhOx) inibitore dell’acetilcolinesterasi, iv) le interazioni metaboliche tra Pho ed chlorpirifos (CPF), un altro pesticida organofosforico, per evidenziare la reciproca influenza sulla loro bioattivazione.
Le MC sono prodotti secondari del metabolismo dei cianobatteri la cui presenza nelle acque è direttamente legata a fattori antropici che rendono i corpi idrici eutrofici e ai cambiamenti climatici. L’esposizione umana a queste sostanze può avvenire per via cutanea, inalazione e ingestione; quest’ultima è la via più comune, a causa della contaminazione di cibi, acqua potabile, ma anche in integratori naturali (BGAS). Le MC sono epatotossiche, neurotossiche e promotrici tumorali, infatti inibiscono le fosfatasi 1 e 2A, e vengono detossificate mediante la coniugazione col GSH, formando un coniugato meno tossico e più facilmente eliminabile. Tale reazione può avvenire sia spontaneamente che catalizzata dalle diverse isoforme delle GST, come mostrato per MC-RR e MC-LR, in cui la reazione enzimatica presenta un maggior contributo quando c’è deplezione di GSH. Nel lavoro di tesi sono stati determinati i parametri cinetici (Km, Vmax e Cli) relativi alla detossificazione dei congeneri MCLW, MCYR e MCLF valutando la formazione del coniugato, sia utilizzando le singole isoforme ricombinanti umane di GST (GST A1, A2, A4, M1, T1 T2, P1, and O1) che citosol epatico umano (Human Liver Cytosol, HLC). Il range di efficienza catalitica, data dalla Clearence intrinseca (CLi) delle GST è simile per MCLW e MCYR (0.022-0.066 pmolGSMCLW/( μgprot*min*μM) e 0.048-0.09 pmolGSMCYR/(μgprot*min*μM); P1 ed A1 sono state le isoforme più efficienti nel caso della MCLW, mentre per la YR si è avuto P1=O1>A1, ma la reazione spontanea è quella che da sempre il maggior contributo rispetto all’enzimatica. La MC-LF viene coniugata solo parzialmente dalla reazione spontanea e non da quella enzimatica. Utilizzando gli HLC si è studiata la cinetica relazione complessiva data dalla co-presenza di tutte le GST epatiche. Sono stati determinati inoltre i valori di logPow delle 5 MC più studiate, seguendo la linea guida OECD n.117, ottenendo il ranking di lipofilicità: LF>LW>LR>YR>RR. Da questi risultati e dai dati di letteratura emerge che l’isoforma detossificata in modo più efficiente è la RR (idrofilica) che è soggetta a un basso uptake OATP-mediato e quindi più facile da detossificare, contrariamente invece alla MC-LF che, una volta entrata nelle cellule (elevato uptake), è la meno detossificata e quindi più tossica per diversi tipi cellula.
Studiare la tossicocinetica (TK) delle diverse MC ci permette di stimare la variabilità nella tossicità che è congenere-dipendente e di supportare i modelli quantitativi di estrapolazione in vivo-in vitro per singola tossina o loro miscele presenti nell’ambiente.
Infine si è studiato l’assorbimento intestinale mediato da trasportatori di 5 congeneri (MC-LF, LR, LW, YR e RR) utilizzando un modello in vitro 3D (EpiIntestinal). Questo sistema è ricostituito da cellule dell’epitelio intestinale di un singolo donatore mantenendone le principali caratteristiche anatomiche e funzionali che si hanno in vivo. È stata verificata la presenza e l’attività nel sistema sperimentale di vari trasportatori sia di efflusso (PgP, MRP e BCRP) che di assorbimento (OATP 2B1 e OATP 1A2), e delle GST e dei CYP450 (3A4 e 2C9). L’uso di substrati marker e del western blotting hanno confermato che il sistema EpiIntestinal esprime in forma attiva tutti i trasportatori testati, dimostrando che si tratta di un modello in vitro rappresentativo del complesso sistema di trasporto intestinale umano. Dai dati emerge che l’assorbimento netto delle MC è il risultato del coivolgimento di vari trasportaori sia di uptake che di efflusso; le MC sono assorbite con diverse velocità a livello intestinale. La MCLW è risultata un buon substrato del trasportatore OATP2B1, mentre gli altri congeneri sono substarti di trasportatori diversi. Le differenze nell'affinità dei congeneri verso le proteine di trasporto sia di uptake che di efflusso sono alla base della biodisponibilità congenere-dipendente per la valutazione della tossicità per via orale.
Il lavoro di tesi ha poi previsto lo studio del metabolismo del phosmet, un pesticida ampiamente utilizzato sia outdoor che indoor che viene anche impiegato come antiparassitario per gli animali, su cui ancora si hanno poche informazioni del pathway metabolico. Sono stati determinati i parametri cinetici (Km, Vmax e Cli) della formazione del metabolita neurotossico oxon (PhOx) da parte delle principali isoforme del CYP450 usando singoli enzimi ricombinanti umani, microsomi epatici umani (HLM, Human Liver Microsomes) e microsomi intestinali umani (HIM, Human Intestine Microsomes). Dai risultati emerge che le isoforme più efficienti nel metabolizzare il Pho sono quelle della famiglia 2C con questo ranking: 2C18>2C19>2B6>2C9>1A1>1A2>2D6>3A4>2A6 e, considerando il contenuto epatico medio umano, si è notato che a basse concentrazioni di substrato il CYP 2C19 è quello che dà un maggior contributo (60%), mentre ad alte concentrazioni di substrato contribuiscono il CYP 2C9 (33%) e il 3A4 (31%). Il ruolo predominante nella formazione dell’oxon da parte della famiglia 2C per il Pho lo differenzia dagli altri pesticidi organofosforici (OPT) che invece sono bioattivati ad oxon principalmente dalle isoforme 2B6 e 1A2 alle basse concentrazioni mentre dal CYP3A4 alle alte. L’utilizzo di inibitori specifici ha confermato il principale coinvolgimento delle isoforme della famiglia 2C anche con gli HLM dove tutte le isoforme epatiche sono presenti. Infine negli HIM dove il CYP3A4 rappresenta l’80% dei CYP attivi (in misura minore sono presenti anche CYP2C19 e 2C9) è stata evidenziata una curva cinetica bifasica indicante una fase a maggiore affinità dovuta appunto ai CYP più efficienti alle basse concentrazioni (CYP della famiglia 2C) e una fase a minore affinità dovuta ai CYP più attivi alle concentrazioni più alte (CYP3A). La bioattivazione intestinale (pre-sistemica) a oxon rappresenta in vitro circa 1⁄4 di quella misurata a livello epatico e non è quindi trascurabile. Infine poiché l’esposizione a più xenobiotici, nello specifico pesticidi, è una realtà, è stata valutata anche la possibile interazione metabolica tra i due OPT phosmet e chlorpyrifos, e il reciproco effetto sulla formazione dei rispettivi oxon determinando le costanti di inibizione (Ki). I dati mostrano che Phosmet ha inibito efficacemente la bioattivazione e la disintossicazione del CPF, con valori di Ki (≈30 μM) compatibili con le concentrazioni di pesticidi raggiungibili nel fegato umano in condizioni di reale esposizione, mentre il contrario è poco probabile (Ki ≈ 160 μM).
I dati cinetici ottenuti durante questo lavoro ci permettono di migliorare la valutazione del rischio, e di supportare lo sviluppo di modelli quantitativi di estrapolazione in vivo-in vitro per singolo pesticida o loro interazione.
Studiare il pathway metabolico e gli enzimi e/o trasportatori coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici è fondamentale perché permette di identificare i gruppi di soggetti a maggior rischio e di mettere in atto le misure di contenimento dei rischi per proteggere i gruppi più suscettibili. Ad oggi queste informazioni si possono ottenere mediante l’impiego di metodi in vitro e/o in silico, detti anche NAM (New Approach Methodologies), come ad esempio i modelli fisiologici cinetici (PBK), che tendono a testare la previsione della cinetica in vivo negli esseri umani integrando la variabilità e le informazioni sostanza-specifiche
Metals in cosmetics : an a posteriori safety evaluation
No full textAccording to EU Regulation No. 1223/2009/CE cosmetic products for daily use can contain '. technically unavoidable traces' of metals. This definition is too vague. Authorities should set well-defined limits, considering the risks associated with metal contamination of personal care products (PCPs).This paper characterizes the risk arising from a number of metals (antimony, arsenic, cadmium, cobalt, chromium, mercury, nickel, lead) that may occur in 'unavoidable traces" in raw materials and, consequently, in PCPs. A 'worst case scenario' was adopted, based on the following assumptions: (i) the individual ingredients contained the maximum amount in traces allowed for each metal; (ii) the hypothetical PCP was produced exclusively with that single ingredient; (iii) when absorption through the skin was not known, data related to oral absorption were used. Risk characterization was performed calculating the Systemic Exposure Dosage (SED) and the Margin of Safety (MoS=NOAEL or BMDL10/SED). Exposure to the allegedly 'technically unavoidable' maximum amounts of metals in cosmetic ingredients resulted in MoSs exceeding 100 (safety threshold) with one exception. This suggests that the availability of experimental dermal absorption rates could enable significant improvement in MoS, thus increasing safety levels. Although results are reassuring, the authors recommend minimization of contamination, according to the state of the art of manufacturing methods
Caco 2/TC7 cell line chracterization for intestinal absorption : a reliable in vitro model for the prediction of the oral dose fraction absorbed in human
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Going Beyond Counting First Authors in Author Co-citation Analysis
Full text linkThe present study examines one of the fundamental aspects of author co-citation analysis (ACA) - the way co-citation
counts are defined. Co-citation counting provides the data on which all subsequent statistical analyses and mappings
are based, and we compare ACA results based on two different types of co-citation counting - the traditional type that
only counts the first one among a cited work's authors on the one hand and a non-traditional type that takes into
account the first 5 authors of a cited work on the other hand. Results indicate that the picture produced through this non-traditional author co-citation counting contains more coherent author groups and is therefore considerably clearer. However, this picture represents fewer specialties in the research field being studied than that produced through the traditional first-author co-citation counting when the same number of top-ranked authors is selected and analyzed. Reasons for these effects are discussed
Variations on the Author
Full text link“Variations on the Author” discusses two of Eduardo Coutinho’s recent films (Um Dia na Vida, from 2010, and Últimas Conversas, posthumously released in 2015) and their contribution to the general question of documentary authorship. The director’s filmography is characterized by a consistent yet self-effacing form of authorial self-inscription: Coutinho often features as an interviewer that rather than express opinions propels discourses; an interviewer that is good at listening. This mode of self-inscription characterizes him as an author who is not expressive but who is nonetheless markedly present on the screen. In Um Dia na Vida, however, Coutinho is completely absent form the image, while Últimas Conversas, on the contrary, includes a confessional prologue that moves the director from the margins to the center of his films. This article examines the ways in which these works stand out in the filmography of a director who offers new insights into the notion of cinematic authorship
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
Full text linkWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
Dispelling the Myths Behind First-author Citation Counts
Full text linkWe conducted a full-scale evaluative citation analysis study of scholars in the XML research field to explore just how different from each other author rankings resulting from different citation counting methods actually are, and to demonstrate the capability of emerging data and tools on the Web in supporting more realistic citation counting methods. Our results contest some common arguments for the continued
use of first-author citation counts in the evaluation of scholars, such as high correlations between author rankings by first-author citation counts and other citation
counting methods, and high costs of using more realistic citation counting methods that are not well-supported by the ISI databases. It is argued that increasingly available digital full text research papers make it possible for citation analysis studies to go beyond what the ISI databases have directly supported and to employ more
sophisticated methods
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