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CtsR, the Master Regulator of Stress-Response in Oenococcus oeni, Is a Heat Sensor Interacting With ClpL1
No full textOenococcus oeni is a lactic acid bacterium responsible for malolactic fermentation of wine. While many stress response mechanisms implemented by O. oeni during wine adaptation have been described, little is known about their regulation. CtsR is the only regulator of stress response genes identified to date in O. oeni. Extensively characterized in Bacillus subtilis , the CtsR repressor is active as a dimer at 37◦C and degraded at higher temperatures by a proteolytic mechanism involving two adapter proteins, McsA and McsB, together with the ClpCP complex. The O. oeni genome does not encode orthologs of these adapter proteins and the regulation of CtsR activity remains unknown. In this study, we investigate CtsR function in O. oeni by using antisense RNA silencing in vivo to modulate ctsR gene expression. Inhibition of ctsR gene expression by asRNA leads to a significant loss in cultivability after heat shock (58%) and acid shock (59%) highlighting the key role of CtsR in the O. oeni stress response. Regulation of CtsR activity was studied using a heterologous expression system to demonstrate that O. oeni CtsR controls expression and stress induction of the O. oeni hsp18 gene when produced in a ctsR -deficient B. subtilis strain. Under heat stress conditions, O. oeni CtsR acts as a temperature sensor and is inactivated at growth temperatures above 33 ◦ C. Finally, using an E. coli bacterial two-hybrid system, we showed that CtsR and ClpL1 interact, suggesting a key role for ClpL1 in controlling CtsR activity in O. oeni
Etude du système AGR par caractérisation de mutants de Listeria monocytogènes
No full textEA MERS CT3 (vu DM) EJ3MasterL’adaptation des bactéries à leur environnement fait intervenir différents mécanismes dont la communication cellulaire. Chez Listeria monocytogenes, le système agr est le seul système de communication cellulaire actuellement décrit. L’implication du système agr dans l’adaptation de L. monocytogenes aux changements de conditions environnementales a été étudiée au travers la caractérisation de deux mutants DG342M et DG343M. L’analyse des séquences et des transcrits par RTqPCR a montré que l’insertion du mariner avait un effet polaire sur l’expression du gène codant une phosphodiestérase (lmo2642), enzyme responsable de l’hydrolyse de l’AMPc. L’analyse a également montré que le mutant DG343M possédait, un 2ème mariner au niveau du gène codant un antiterminateur putatif (lmo2099). L’effet polaire de l’insertion du mariner sur l’expression du gène de la phosphodiestérase a été confirmé par RTqPCR. L’impact de ces mutations sur l’expression du système agr a été analysé en utilisant un système rapporteur double (β-galactosidase et GFP) et la quantification des transcrits pas RTqPCR. Les résultats obtenus ont montré que les mutations provoquaient l’augmentation modérée du système agr en phase stationnaire. La caractérisation phénotypique des mutants a montré un impact sur leur croissance et leur capacité à former un biofilm dans différents modèles de culture de biofilm sur surfaces abiotiques (polystyrène et verre) en conditions statiques et dynamiques (0,5 Dynes) et que DG342M et DG343M étaient différents d’EGD-e. Les différences observées dans notre cas seraient dues au dérèglement du métabolisme central de la cellule par l’accumulation d’AMPc, plutôt qu’à l’augmentation de l’expression d’agr. En outre, la virulence des souches ne semblaient pas affectées. En revanche, les deux mutants différaient quant à leur capacité à coloniser les racines de fétuques. En effet, alors que le mutant simple DG342M montrait un défaut de capacité de colonisation de la rhizosphère, le mutant double DG343M ne semblait pas affecté, ce qui indiquait un effet compensateur de la part de la 2nde mutation (lmo2099). L’ensemble des résultats suggéraient pour la 1ère fois un rôle de signalisation de l’AMPc chez L. monocytogenes
Etude des mécanismes moléculaires de la réponse au stress de Oenoccus oeni et mise en oeuvre d'outils pour l'exploration fonctionnelle de gènes d'intérêt oenologique
No full textO. oeni est responsable de la fermentation malolactique des vins. Elle doit en permanence s’adapter aux fluctuations physico-chimiques de son environnement. La production de protéines Hsp constitue un mécanisme majeur d’adaptation de la bactérie à son environnement. Chez O. oeni, la protéine CtsR est l’unique régulateur identifié à ce jour des gènes hsp. Ce manuscrit aborde la caractérisation des mécanismes de régulation de la réponse au stress chez O. oeni. Une partie de ce travail a consisté à développer un nouvel outil d’expression de gènes chez O. oeni. Cet outil a permis l’étude de la fonction in vivo du gène hsp18 par une technique de modulation de l’expression de gènes par synthèse d’ARN antisens (ARNas). La production d’ARNas ciblant l’ARN messager du gène hsp18 entraîne une diminution du taux protéique de Lo18 et induit une perte de cultivabilité en conditions de stress. Ces résultats montrent, pour la 1ère fois in vivo, l’implication de Lo18 dans la thermotolérance et l’acidotolérance de O. oeni. Cette même approche appliquée au gène ctsR a induit une perte de cultivabilité en conditions de stress confirmant le rôle clef du locus ctsR dans la réponse au stress de O. oeni. Les mécanismes de régulation de l’activité de CtsR ont été appréhendés par complémentation d’un mutant ctsR déficient de B. subtilis via l’expression de ctsR de O. oeni. Des tests de thermoinduction mettent en évidence la thermosensibilité du CtsR de O. oeni dont l’activité est levée à une température inférieure à 33°C. Le pSIPSYN est un outil prometteur valorisé au cours de ce travail par une étude évaluant l’impact de deux estérases de O. oeni, EstA2 et EstA7 sur le profil aromatique du vin
Characterization of CtsR, the master regulator of stress response O. oeni
No full textCharacterization of CtsR, the master regulator of stress response O. oeni. 8. International conference on gram-positive microorganisms. 18. International conference on Bacill
Study of molecular mechanisms of stress response in Oenococcus oeni and implementation of tools for the functional exploration of enological genes
No full textO. oeni est responsable de la fermentation malolactique des vins. Elle doit en permanence s’adapter aux fluctuations physico-chimiques de son environnement. La production de protéines Hsp constitue un mécanisme majeur d’adaptation de la bactérie à son environnement. Chez O. oeni, la protéine CtsR est l’unique régulateur identifié à ce jour des gènes hsp. Ce manuscrit aborde la caractérisation des mécanismes de régulation de la réponse au stress chez O. oeni. Une partie de ce travail a consisté à développer un nouvel outil d’expression de gènes chez O. oeni. Cet outil a permis l’étude de la fonction in vivo du gène hsp18 par une technique de modulation de l’expression de gènes par synthèse d’ARN antisens (ARNas). La production d’ARNas ciblant l’ARN messager du gène hsp18 entraîne une diminution du taux protéique de Lo18 et induit une perte de cultivabilité en conditions de stress. Ces résultats montrent, pour la 1ère fois in vivo, l’implication de Lo18 dans la thermotolérance et l’acidotolérance de O. oeni. Cette même approche appliquée au gène ctsR a induit une perte de cultivabilité en conditions de stress confirmant le rôle clef du locus ctsR dans la réponse au stress de O. oeni. Les mécanismes de régulation de l’activité de CtsR ont été appréhendés par complémentation d’un mutant ctsR déficient de B. subtilis via l’expression de ctsR de O. oeni. Des tests de thermoinduction mettent en évidence la thermosensibilité du CtsR de O. oeni dont l’activité est levée à une température inférieure à 33°C. Le pSIPSYN est un outil prometteur valorisé au cours de ce travail par une étude évaluant l’impact de deux estérases de O. oeni, EstA2 et EstA7 sur le profil aromatique du vin.O. oeni is responsible for wine malolactic fermentation. As any organism, O. oeni tries to adapt its physiology to environmental fluctuations by producing Hsp proteins encoded by the hsp genes. In O. oeni, CtsR is currently the only regulator of hsp genes. As an alternative to the lack of genetic tool, with the goal of understanding the mechanisms of O. oeni stress response, we developed a new expression vector, the pSIPSYN, to produce antisense RNA targeting of hsp18 mRNA. The synthesis of hsp18 asRNA leads to the decrease in the protein level of Lo18 and induced a loss of cultivability after heat or acid shock showing for the first time in vivo involvement of Lo18 in thermotolerance and acidotolerance in O. oeni. The O. oeni ability of the membrane fluidity restoration of after ethanol stress was strongly affected in the presence of asRNAof hsp18 gene. Then, the ctsR function in O. oeni was investigated with this new genetic tool. Inhibition of the ctsR expression by asRNA approach induced a loss of cultivability after heat or acid shock confirming the key role of ctsR locus in the O. oeni stress response. B. subtilis was used to characterize the regulation of CtsR activity. The ctsR gene of O. oeni was expressed to complement a B. subtilis ctsR-deficient strain and restore the wild-type phenotype. Thermoinduction tests performed to understand the thermosensibility of CtsR showed that O. oeni CtsR is a specific thermosensor inactivated at a temperature threshold below 33°C. The pSIPSYN is a promising tool valorized in this work through an oenological study by evaluating of the impact of O. oeni two esterases, and EstA2 EstA7 on wine ester profile
Impact of lactic acid bacteria esterase activity on wine aromatic compounds
No full textImpact of lactic acid bacteria esterase activity on wine aromatic compounds. Macrowine 201
Characterization of CtsR, the master regulator of stress response O. oeni
No full textCharacterization of CtsR, the master regulator of stress response O. oeni. 8. International conference on gram-positive microorganisms. 18. International conference on Bacill
Use of antisense RNA to modulate hsp gene expression in O. oeni
No full textUse of antisense RNA to modulate hsp gene expression in O. oeni. 6. Congress of European Microbiologists (FEMS 2015
Etude du système AGR par caractérisation de mutants de Listeria monocytogènes
No full textEA MERS CT3 (vu DM) EJ3MasterL’adaptation des bactéries à leur environnement fait intervenir différents mécanismes dont la communication cellulaire. Chez Listeria monocytogenes, le système agr est le seul système de communication cellulaire actuellement décrit. L’implication du système agr dans l’adaptation de L. monocytogenes aux changements de conditions environnementales a été étudiée au travers la caractérisation de deux mutants DG342M et DG343M. L’analyse des séquences et des transcrits par RTqPCR a montré que l’insertion du mariner avait un effet polaire sur l’expression du gène codant une phosphodiestérase (lmo2642), enzyme responsable de l’hydrolyse de l’AMPc. L’analyse a également montré que le mutant DG343M possédait, un 2ème mariner au niveau du gène codant un antiterminateur putatif (lmo2099). L’effet polaire de l’insertion du mariner sur l’expression du gène de la phosphodiestérase a été confirmé par RTqPCR. L’impact de ces mutations sur l’expression du système agr a été analysé en utilisant un système rapporteur double (β-galactosidase et GFP) et la quantification des transcrits pas RTqPCR. Les résultats obtenus ont montré que les mutations provoquaient l’augmentation modérée du système agr en phase stationnaire. La caractérisation phénotypique des mutants a montré un impact sur leur croissance et leur capacité à former un biofilm dans différents modèles de culture de biofilm sur surfaces abiotiques (polystyrène et verre) en conditions statiques et dynamiques (0,5 Dynes) et que DG342M et DG343M étaient différents d’EGD-e. Les différences observées dans notre cas seraient dues au dérèglement du métabolisme central de la cellule par l’accumulation d’AMPc, plutôt qu’à l’augmentation de l’expression d’agr. En outre, la virulence des souches ne semblaient pas affectées. En revanche, les deux mutants différaient quant à leur capacité à coloniser les racines de fétuques. En effet, alors que le mutant simple DG342M montrait un défaut de capacité de colonisation de la rhizosphère, le mutant double DG343M ne semblait pas affecté, ce qui indiquait un effet compensateur de la part de la 2nde mutation (lmo2099). L’ensemble des résultats suggéraient pour la 1ère fois un rôle de signalisation de l’AMPc chez L. monocytogenes
Etude du système AGR par caractérisation de mutants de Listeria monocytogènes
No full textEA MERS CT3 (vu DM) EJ3MasterL’adaptation des bactéries à leur environnement fait intervenir différents mécanismes dont la communication cellulaire. Chez Listeria monocytogenes, le système agr est le seul système de communication cellulaire actuellement décrit. L’implication du système agr dans l’adaptation de L. monocytogenes aux changements de conditions environnementales a été étudiée au travers la caractérisation de deux mutants DG342M et DG343M. L’analyse des séquences et des transcrits par RTqPCR a montré que l’insertion du mariner avait un effet polaire sur l’expression du gène codant une phosphodiestérase (lmo2642), enzyme responsable de l’hydrolyse de l’AMPc. L’analyse a également montré que le mutant DG343M possédait, un 2ème mariner au niveau du gène codant un antiterminateur putatif (lmo2099). L’effet polaire de l’insertion du mariner sur l’expression du gène de la phosphodiestérase a été confirmé par RTqPCR. L’impact de ces mutations sur l’expression du système agr a été analysé en utilisant un système rapporteur double (β-galactosidase et GFP) et la quantification des transcrits pas RTqPCR. Les résultats obtenus ont montré que les mutations provoquaient l’augmentation modérée du système agr en phase stationnaire. La caractérisation phénotypique des mutants a montré un impact sur leur croissance et leur capacité à former un biofilm dans différents modèles de culture de biofilm sur surfaces abiotiques (polystyrène et verre) en conditions statiques et dynamiques (0,5 Dynes) et que DG342M et DG343M étaient différents d’EGD-e. Les différences observées dans notre cas seraient dues au dérèglement du métabolisme central de la cellule par l’accumulation d’AMPc, plutôt qu’à l’augmentation de l’expression d’agr. En outre, la virulence des souches ne semblaient pas affectées. En revanche, les deux mutants différaient quant à leur capacité à coloniser les racines de fétuques. En effet, alors que le mutant simple DG342M montrait un défaut de capacité de colonisation de la rhizosphère, le mutant double DG343M ne semblait pas affecté, ce qui indiquait un effet compensateur de la part de la 2nde mutation (lmo2099). L’ensemble des résultats suggéraient pour la 1ère fois un rôle de signalisation de l’AMPc chez L. monocytogenes
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