249 research outputs found
Towards a universal influenza vaccine : generation and evaluation of vaccine formulations based on HA-epitopes in different influenza hosts
No full textEls virus de la influença tipus A (VIAs), han estat implicats en cinc pandèmies i ocasionen, any rere any, epidèmies estacionals. Tenen un elevat potencial zoonòtic, afectant un ampli ventall d'hostes. Els seus principals reservoris són les aus salvatges aquàtiques que poden transmetre el virus a aus domèstiques, i aquestes, a porcs i humans. A més, els porcs són considerats hostes intermediaris, susceptibles d'infecció tant per virus humans com aviars. La mesura preventiva més efectiva contra els VIAs són les vacunes. La majoria són vacunes inactivades que contenen soques dels subtipus circulants més comuns de VIAs. No obstant, presenten inconvenients, com una limitada capacitat de cross-protecció. Aquestes limitacions requereixen una reformulació de les vacunes per tal que s'ajustin als canvis genètics del virus i exigeixen continua vigilància davant possibles pandèmies. Per superar aquests obstacles, la investigació actual cerca una vacuna universal, implementant diverses estratègies de vacuna/immunització utilitzant immunomodul·ladors i epítops altament conservats dels VIAs. Aquesta tesi doctoral avalua diverses estratègies enfocades en la millora de les formulacions vacunals, com en la seva aplicació/avaluació en hostes naturals de VIAs i consta de tres parts: La primera part descriu la introducció general (Capítol I) i l'objectiu general i específics (Capítol II). La introducció explica (i) els virus de la grip (ii) els VIAs (iii) la resposta immune de l'hoste contra els VIAs (iv) les vacunes comercials disponibles en humans, aviar i porcí contra la grip (v) estratègies per obtenir una vacuna universal i (vi) l'ISM, una eina in silico utilitzada en la tesi per predir pèptids conservats. El capítol II descriu l'objectiu:. crear un prototip de vacuna universal contra diferents subtipus de VIAs utilitzant tècniques que incorporen epítops conservats de la hemaglutinina (HA-epítops), predits in silico, introduïts en plàsmids o en forma soluble amb adjuvants diferents. La part II (Capítols III-V), inclou els tres estudis on el disseny de prototips vacunals amb possible caràcter multivalent i la seva aplicació en porcs i aus és avaluada. En el primer estudi, un HA-epítop: el NF-34, predit per ISM, va ser modificat i formulat en un plàsmid amb CTLA-4 (pCMV-CTLA4-Ig-NG34), promotor de la resposta adaptativa. El pCMV-CTLA4-Ig-NG34 es va utilitzar en porcs seronegatius i seropositius contra la grip porcina i es van desafiar contra el virus heteròleg H3N2. Els vacunats van secretar menys virus, van eliminar el virus a les vies respiratòries, van presentar resposta humoral als subtipus circulants més rellevants i anticossos neutralitzants. No obstant, no hi va haver diferències en el grau de lesions pulmonars ni en els signes clínics. Els anticossos materns no van interferir amb l'efecte de la vacuna. En el segon estudi, es va utilitzar un còctel d'HA-epítops combinats amb flagel·lina (VC-4-flagellin), promotor de la resposta innata, en porcs seronegatius i seropositius i es van desafiar amb soques homòlogues i heteròlogues de VIAs. Els porcs vacunats van reduir l'excreció del virus, van produir resposta humoral front els subtipus H1 i H3 i, anticossos neutralitzants contra ambdós virus. Els anticossos materns no varen ser un obstacle, no obstant, els signes clínics i la patologia dels pulmons no es van reduir. Finalment, en el tercer estudi, es va utilitzar el sistema vectorial d'expressió de baculovirus (BEVS) per obtenir extractes de proteïnes que contenien HA-epítops units a la flagel·lina. La formulació es va utilitzar per immunitzar pollastres que es van desafiar amb H7N1, un virus altament patogènic. Els vacunats van sobreviure sense mostrar signes clínics i sense secretar o, en menor quantitat, el virus. El mecanisme de protecció està sota investigació. La part III (capítols VI-VII), descriu la discussió general i les conclusions. També, inclou les referències bibliogràfiques (Capítol VIII) i els annexos.Influenza viruses (IAVs) have been implicated in five pandemics and are the cause of seasonal epidemics year after year. They are characterized for their high zoonotic potential, affecting a wide range of hosts. Wild aquatic birds are their main reservoirs that transmit the virus to domesticated birds and may spread further to pigs and humans. Moreover, pigs are considered intermediate hosts, susceptible to infection for both humans and avian IAVs. The most effective countermeasure against IVs are the vaccines. Most of them are inactivated vaccines containing strains of the most common circulating subtypes of IVs. However, they present several inconveniences like limiting cross-protection capacity. These limitations require reformulation of vaccines matched to the genetic changes of the virus and demand continuous vigilance for possible pandemics. To overcome these hurdles, current research focuses on seeking for a universal influenza vaccine, implementing several vaccine strategies by using different immunomodulators and highly-conserved IV epitopes in vaccine formulations. This doctoral thesis evaluates distinct approaches both in improving vaccine formulation and its application/evaluation to different IV natural hosts and has been divided into 3 parts: In the Part I, the general introduction (Chapter I) and the general and specific objectives (Chapter II), are described. The introduction explains (i) influenza viruses (ii) the viruses of the genus A (iii) host's immune response against IVs; (iv) the commercial vaccines available against influenza in human, avian and porcine (v) approaches to obtain a universal vaccine and the (vi) ISM, an in silico tool which has been used in the thesis to predict conserved peptides. Chapter II describes the objective of this thesis. Overall, it is intended to create a universal prototype vaccine against different subtypes of IVs using techniques that incorporate in silico predicted conserved HA-epitopes introduced in plasmid or soluble form along with different adjuvants. In Part II (Chapters III-V), three studies that are either published/submitted to international peer-reviewed scientific journals, are included. The design of vaccine prototypes with possible multivalent character and its subsequent application in pigs and birds is evaluated. In the first study, one conserved HA-epitope NF-34, predicted by ISM, was modified and formulated in a plasmid with CTLA-4 (pCMV-CTLA4-Ig-NG34), promoter of the adaptive response. The vaccine approach was used in swine influenza seronegative and seropositive pigs and challenged against heterologous H3N2. Vaccinated pigs secreted fewer viruses, cleared the virus in the respiratory airways, presented humoral response to the most relevant circulating subtypes and elicited neutralizing antibodies. However, there were no differences in the degree of pulmonary lesions and clinical signs. Maternal antibodies did not interfere with the effect of the vaccine. In the second study, a cocktail of HA-epitopes combined with flagellin (VC-4 flagellin), a promoter of the innate response, was used in SIV seronegative and seropositive pigs and were challenged with homologous and heterologous IAV strains. Vaccinated pigs reduced virus excretion, produced humoral response to subtypes H1 and H3, and neutralizing antibodies against both viruses. Maternal antibodies were not an obstacle but, clinical signs and pathology in the lungs were not reduced. Finally, in the third study, baculovirus expression vector system (BEVS) was used to obtain protein extracts containing HA-peptides linked with flagellin. The formulation was used to immunize chickens that were challenged with H7N1, a highly pathogenic virus. Vaccinated animals survived without showing any clinical sign and fewer or no virus secretion. The protection mechanism is under investigation. The general discussion is described in part III (Chapters VI-VII) with possible significance of the results obtained and the relation of conclusions drawn from each study. The bibliographical references (Chapter VIII) and appendices are also included
Resposta immunològica a la influença tipus A
No full textJúlia Vergara Alert va defensar al CReSA-UAB el seu treball de tesi doctoral titulat "Immune response to influenza infection and vaccination", dirigit pel Dr. Ayub Darji. El principal objectiu d'aquesta tesi va ser estudiar la resposta immunològica causada per la infecció amb el virus de la influença tipus A (VIA) en models animals, amb l'objectiu final de dissenyar una vacuna front el VIA.Julia Vergara Alert defendió en el CReSA-UAB su trabajo de tesis doctoral titulado "Inmune Response to influenza infection and vaccination", dirigido por el Dr. Ayub Darji. El principal objetivo de esta tesis fue estudiar la respuesta inmunológica causada por la infección con el virus de la influenza tipo A (VIA) en modelos animales, con el objetivo final de diseñar una vacuna frente el VIA
Resposta immunològica a la influença tipus A
No full textJúlia Vergara Alert va defensar al CReSA-UAB el seu treball de tesi doctoral titulat "Immune response to influenza infection and vaccination", dirigit pel Dr. Ayub Darji. El principal objectiu d'aquesta tesi va ser estudiar la resposta immunològica causada per la infecció amb el virus de la influença tipus A (VIA) en models animals, amb l'objectiu final de dissenyar una vacuna front el VIA.Julia Vergara Alert defendió en el CReSA-UAB su trabajo de tesis doctoral titulado "Inmune Response to influenza infection and vaccination", dirigido por el Dr. Ayub Darji. El principal objetivo de esta tesis fue estudiar la respuesta inmunológica causada por la infección con el virus de la influenza tipo A (VIA) en modelos animales, con el objetivo final de diseñar una vacuna frente el VIA
Conserved hemagglutinin peptides of influenza virus as potential multivalent vaccine candidate: characterization of immune response in different animal models
No full textLos virus de influenza A (IAVs) son los responsables de brotes pandémicos y de la mayoría de las epidemias anuales en los seres humanos, aves y cerdos. Los virus de influenza A se dividen en subtipos, basado en la naturaleza de sus glicoproteínas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). La HA es una glicoproteína de superficie homotrimérica que media la entrada del virus de influenza a través de la unión celular y eventos de fusión de membranas. El bolsillo de unión al receptor de HA está rodeado por los sitios de unión de anticuerpos antigénicamente variables. Por lo tanto, los anticuerpos limitados a estos sitios debería, en principio, bloquear la unión a las proteínas del receptor, inhibiendo la entrada del virus, lo que demuestra actividad de inhibición de la hemaglutinina y la actividad de neutralización viral. Sin embargo, la subunidad 1 de HA (HA1) es altamente variable a través de los virus de influenza y tiende a cambiar bajo presión inmune; por lo tanto, fácilmente evade los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacunación o infecciones anteriores. Las consecuencias negativas de las infecciones por virus de influenza incentivan al mundo de la ciencia para promover el desarrollo de vacunas multivalentes contra la gripe, que tengan eficaz protección frente a todas las cepas de influenza. Por consiguiente, el campo de la bioinformática se ha convertido en una parte importante de la identificación y validación temprana de nuevas dianas terapéuticas que podrían ser un primer paso esencial en el desarrollo de una vacuna eficaz para el virus de influenza, que representa la alta variabilidad de sus determinantes antigénicos. En esta tesis se postuló que la HA1 podría representar una diana potencial para una vacuna multivalente frente a la infección por influenza virus. Por ende; el objetivo general de esta tesis fue seleccionar péptidos conservados de la subunidad 1 de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe, para evaluar la eficacia de los candidatos seleccionados, para inducir la inmunidad que pueda proteger a los animales contra la infección. Para desarrollar este objetivo, se llevaron a cabo tres estudios experimentales: en ratones (Capítulo 1), cerdos (capítulo 2) y pollos (Capítulo 3). En el primer estudio, se evaluó el efecto protector de la mejora de péptidos HA1 contra la pandemia del virus H1N1 2009 (pH1N1) y el virus de la influenza de alta patogenicidad H7N1 en un modelo de ratón (Capítulo 1). En este estudio, los ratones fueron vacunados por vía intraperitoneal con la mezcla de péptido sintético (NG34 + DC89) y desafiados ya sea con el pH1N1 ó H7N1 del virus de influenza. Una mortalidad del 85% fue observada en los ratones de control, independientemente del virus utilizado para el desafío, 80% y 66% de los ratones vacunados con péptido sobrevivieron al desafío con pH1N1 y H7N1, respectivamente, sin la detección de virus de la influenza (IV). Los ratones vacunados supervivientes se correlacionaron con la presencia de anticuerpos neutralizantes de reactividad cruzada en sueros antes de la exposición. La inmunización con NG34+DC89 también indujo respuesta inmune en mucosas; demostrándose con la presencia de IgA en lavado broncoalveolar en el 50% de los animales. Nuestros resultados también muestran que la vacunación de NG34+DC89 es capaz de inducir anticuerpos y la protección cruzada neutralizante frente a dos cepas heterólogas, pH1N1 y H7N1. Por lo tanto, péptidos NG34+DC89 representan un inmunógeno atractivo, lo que podría ser aún más optimizado para futuras formulaciones de vacunas multivalentes frente el virus de influenza. En el segundo estudio, hemos probado la inmunogenicidad de un cóctel HA1-péptido en un modelo porcino para evaluar si esta nueva formulación puede conferir inmunidad a una amplia gama de virus de influenza in vitro (Capítulo 2). En este estudio, hemos utilizado cuatro péptidos de la HA1 del subtipo H1 del virus de influenza (NG34, DC55, RA22 y SS35), evaluamos su inmunogenicidad en cerdos convencionales de granja frente a virus de influenza homólogos y heterólogos. Las vacunas de péptidos sintéticos indujeron anticuerpos con capacidad neutralizante y de inhibición frente a virus homólogos. Aquellos también cros-reaccionaron frente a los virus heterólogos de origen aviar como el virus H7N1 y virus de influenza de baja patogenicidad H5N2 y además el virus circulante H3N2 de origen porcino. Por otra parte, se detectaron anticuerpos específicos de IgA-secretora en hisopos nasales. Los resultados muestran que los péptidos evaluados fueron inmunogénicos en cerdos. La respuesta humoral con la actividad neutralizante y de inhibición de hemaglutinina generada después de la inmunización podría ser utilizada en otros estudios de inmunidad protectora heterosubtípica. En el tercer estudio se evaluó el efecto protector de la mejora de péptidos de HA1 contra el virus altamente patógeno virus de la influenza H7N1 en pollos, un modelo huésped natural (capítulo 3). En este estudio, se utilizaron dos péptidos sintéticos NG34 y SS35 para vacunar pollos de granja. La vacunación tanto con péptidos NG34 ó SS35 indujeron anticuerpos específicos que reconocen virus heterólogos, como H7N1 y H5N2 in vitro. La vacunación con péptido NG34 provocó una respuesta de anticuerpos protectores que confirió una protección parcial frente un desafío letal con H7N1. Además, el péptido NG34 indujo una respuesta inmune de la mucosa, que correlacionaba con la diseminación viral reducida en hisopos orofaríngeos/ cloacales y la pulpa de la pluma. Por el contrario, animales vacunados con el péptido SS35 no pudieron producir una eficiente respuesta inmune protectora frente el desafío letal H7N1. Es necesario recalcar, que todos los péptidos HA1 del subtipo H1 del virus de influenza, fueron seleccionados mediante el Método de espectros informativo (ISM). Cuatro principales conclusiones generales pueden extraerse de estos estudios: (i) Péptidos HA1 son inmunogénicos en todos los modelos animales estudiados (ratones, cerdos y pollos) e inducen una respuesta immune humoral y de mucosa. (ii) Péptidos inmunogénicos de la subunidad 1 de la proteína hemaglutinina del virus de la influenza confieren una protección parcial contra diferentes subtipos virales en ratones; (iii) Los cerdos vacunados con péptidos HA1 provocan una respuesta de anticuerpos neutralizantes con actividad de inhibición de la hemaglutinina frente a diferentes subtipos de Influenza A virus y (iv) Péptidos HA1 confieren una protección parcial contra un virus altamente patógeno/ H7N1 en modelo de pollo. En general, nuestros resultados proporcionan ideas sobre nuevos enfoques para la vacunación de la gripe y la comprensión de la respuesta inmune frente al virus de influenza en ratones, cerdos y pollos.Influenza A viruses (IAVs) are responsible for pandemic outbreaks of influenza, and for most of the well-known annual flu epidemics, in humans, poultry and pigs. IAVs are divided into subtypes, based on the nature of their surface glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). The HA is a homotrimeric surface glycoprotein that mediates influenza viral entry via cellular attachment and membrane fusion events. The receptor-binding pocket of HA is surrounded by antigenically variable antibody binding sites. Therefore, antibodies bounded to these sites should, in principle, block the binding to receptor proteins, inhibiting viral entry, demonstrating hemagglutinin inhibition activity and viral neutralization activity. However, the subunit 1 of HA (HA1) is highly variable across viruses and tends to change under immune pressure and, hence, easily evades the neutralizing antibodies induced by previous vaccinations or infections. The negative implications of influenza virus infections push the world to promote the development of multivalent flu vaccines that protect against all human influenza strains. Therefore, the field of bioinformatics has become a major part of the identification and early validation of new therapeutic targets and could be an essential first step in the development of an effective vaccine for influenza virus that represents the high variability of its antigenic determinants. Therefore, in this thesis it was postulated that the HA1 could represent a potential target for a multivalent vaccine of influenza infection. Consequently, the general objective of this thesis was to select conserved peptides from the HA1 of influenza viruses and to evaluate the efficacy of the selected candidates to induce immunity that can protect animal against infection. To achieve this objective, three studies were undertaken in mice (Chapter 1), pigs (chapter 2) and chickens (Chapter 3). In the first study, we evaluated the protective effect of improved HA1-peptides against the pandemic H1N1 2009 virus and a H7N1 highly pathogenic influenza virus (HPAIV) in a mouse model (Chapter 1). In this study, mice were intraperitoneally vaccinated with the peptide mix (NG34+DC89), and next challenged with either the pH1N1 or the H7N1 strain of Influenza virus. Conversely to the 85% mortality observed in control mice, independently of the virus used for challenge, 80% and 66% of the peptide-vaccinated mice survived the challenge with pH1N1 and H7N1, respectively, without detection of influenza viruses (IV). Vaccinated mice surviving correlated with the presence of cross-reactive neutralizing antibodies in sera prior to challenge. The immunization with NG34+DC89 also induced mucosal immune responses demonstrated with the presence of IgA in bronchoalveolar lavage in 50% of the animals. Our results also show that NG34+DC89 is capable to induce cross-neutralizing antibodies and protection against two heterologous IV, pH1N1 and H7N1. Thus, NG34+DC89 represent an attractive immunogen, which could be further optimized for future multivalent vaccine formulations against influenza virus. In the second study, we tested the immunogenicity of a HA1-peptide cocktail in a pig model to assess whether this new formulation can confer immunity to a wide range of IAVs in vitro (Chapter 2). Four peptides (NG34, DC55, RA22 and SS35) within the HA1 from H1 viruses were selected, and evaluated their immunogenicity in conventional farm pigs against homologous and heterologous viruses of influenza. Peptides immunizations induced HA neutralizing and inhibiting antibodies against homologous viruses. Those also cross-reacted against heterologous viruses like H7N1 and H5N2 and, most importantly, the circulating H3N2. Moreover, secretory IgA-specific HA antibodies in nasal swabs were detected. Altogether, the results show that the peptides tested were immunogenic in pigs. The humoral response with hemagglutinin-inhibiting and cross-neutralizing activity generated after immunization could be used in further studies of protective heterosubtypic immunity. In the third study we evaluated the protective effect of improved HA1-peptides against H7N1 highly pathogenic influenza virus (HPAIV) in chickens, a natural host model (Chapter 3). In this study, based on ISM, we selected two highly conserved peptides (NG34 and SS35) of a H1 influenza virus strain and used them to vaccinate free-range chickens. The vaccination with both NG34 and SS35 peptides induced specific antibodies that recognized heterologous viruses, as H7N1 HPAIV and H5N2 Low pathogenic avian virus (LPAIV) in vitro. Vaccination with NG34 peptide elicited a protective antibody response that conferred partial protection against a lethal challenge with H7N1 HPAIV. Furthermore, NG34 peptide induced a mucosal immune response, which correlated with reduced viral shedding in oropharyngeal/cloacal swabs and feather pulp. On the contrary, SS35 peptide vaccinated animals failed to produce an efficient protective immune response as no survival against lethal H7N1 challenge was achieved. Finally, it remains to point out that all HA1-peptides from H1 subtype of influenza virus were selected by the method of informative spectra (ISM). Four main general conclusions can be drawn from these studies: (i) HA1-peptides are immunogenic in all the animals models tested (mice, pigs and chickens) and induce humoral and mucosal immune response. (ii) Novel conserved immunogenic peptides from the hemagglutinin subunit 1 protein of influenza viruses confer partial protection against different viral subtypes in mice; (iii) Pigs vaccinated with HA1 peptides elicit neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibody responses against different subtypes of Influenza A virus and (iv) Synthetic peptides from the hemagglutinin of influenza viruses confer partial protection against highly pathogenic A/H7N1 virus in a free-range chicken model. Overall, these data provide insights on new approaches for vaccination in influenza and understanding of the immune response against influenza viruses in mice, pigs and chickens
Immune response to influenza infection and vaccination
No full textEls virus de la influença tipus A (VIA) són patògens zoonòtics que poden infectar un ampli nombre d'hostes incloent-hi les aus, els porcs i els homes, entre altres. Anualment es documenten milions d'infeccions en humans causades per virus de la influença estacionals. Les pandemies causades pel virus influença també tenen una elevada repercussió pel que fa a la sanitat i l'economia. Tot i que determinats subtipus de VIA s'adapten millor en espècies d'aus que en humans, hi ha hagut casos d'infeccions en humans per virus de la influença de tipus aviars. La susceptibilitat dels porcs per infectar-se amb virus de la influença tant d'origen aviar com humà és també important pel que fa a la salut pública. El genoma del virus influença és segmentat in consta de vuit molècules de ARN de cadena senzilla i sentit negatiu que codifiquen per 11 o 12 proteïnes. Per tant, si una cèl·lula s'infecta simultàniament per dos VIA diferents, pot succeir un reagrupament amb la conseqüent generació d'una nova soca de virus. A més, mutacions a les glicoproteïnes de superfícies (sobretot a l'hemaglutinina, HA) són les responsables de l'elevada variabilitat de VIA. Tot i que les vacunes front a les epidèmies estacionals són eficaces, no produeixen resposta immunològica front una amplia varietat de VIA. És a dir, les vacunes estacionals només protegeixen front a les soques virals circulants durant una determinada estació. Aquest fet, junt amb el risc de possibles pandèmies, han fet encara més important i urgent el desenvolupament d'una vacuna universal capaç de produir immunitat front a múltiples subtipus virals. En la present tesis s'ha estudiat la resposta immunitària front a la infecció i vacunació del VIA en el context de VIA d'alta patogenicitat (vIAAP) A/H5N1 i A/H7N1 i el virus pandèmic A/H1N1 (pH1N1). El treball s'ha dividit en tres parts i cada part s'ha subdividit en capítols. Part I (capítols 1 i 2), conté la introducció general i els objectius de la tesi doctoral. L'objectiu d'aquesta primera part és donar una visió global i introduir informació per entendre (i) la infecció pel virus de la influença, (ii) la resposta immunològica provocada després de la infecció per VIA i (iii) un breu resum de les vacunes actuals front a influença. A continuació, s'exposen els objectius a aconseguir. Part II, és el cos de la tesis i conté els quatre treballs (del capítol 3 al 6) duts a terme durant els quatre anys que ha durat el programa de doctorat. Tots els capítols presentats han estat publicats o sotmesos a publicació en revistes indexades internacionals. Per tant, cada estudi manté l'estructura estàndard de: resum, introducció específica, materials i mètodes, resultats i breu discussió. Estudiar el paper dels determinants virals i caracteritzar la infecció pel VIA en diversos hostes pot ser de gran interès a l'hora de dissenyar vacunes òptimes. S'ha descrit la proteïna NS1 com a un dels principals determinants de virulència en mamífers, però no s'ha estudiat gaire el paper d'aquesta en aus. En el capítol 3 es va avaluar la implicació de la proteïna NS1 en la patogenicitat viral en pollets. Es van infectar pollets amb vIAAP H7N1 que contenien el segment NS de vIAAP H5N1. Les manifestacions patològiques i la resposta immunològica conseqüència de la infecció amb cada un dels virus van ser avaluades. També és molt important el paper de la immunitat prèvia durant un brot perquè pot ser determinant de la mort o supervivència de l'animal. En el capítol 4 es van exposar pollets a un virus H7N2 de baixa patogenicitat (vIABP) i a continuació es van infectar amb un vIAAP H7N1. Posteriorment es van infectar amb un vIAAP H5N1. Els animals que havien estat infectats prèviament amb vIABP quedaven protegits a la posterior infecció letal amb el vIAAP H7N1. No obstant, la resposta immunitària produïda no era suficient per a protegir els pollets front a la infecció amb un virus heterosubtípic (vIAAP H5N1). La presència o absència d'anticossos inhibitoris front a H7- i H5- correlacionaven amb la presència o absència de protecció, respectivament. Conèixer els programes de vacunació actuals i la seva eficàcia és útil per a planificar i dissenyar futures estratègies de vacunació. Les aus aquàtiques són el reservori dels VIA; per tant, són extremadament importants pel que fa a l'ecologia del virus. Aprofitant els programes de vacunació es va testar el sèrum de diverses espècies d'aus de zoològics i centres de recuperació d'Espanya (capítol 5). Els sèrums es van utilitzar per a l'avaluació de la resposta humoral deguda a la vacuna. El principal objectiu del treball era determinar l'eficàcia de vacunes disponibles (inactivades en suspensió oliosa) en diverses espècies d'aus i comparar la variabilitat inter- i intra-espècie. Finalment, i tenint en compte el potencial risc del VIA, els esforços es van focalitzar en desenvolupar una vacuna capaç de protegir a un ampli nombre de subtipus de VIA. La pandèmia de 2009 amb el virus H1N1 (pH1N1) és un clar exemple que els porcs poden actuar com a "coctelera" i generar nous virus. En el capítol 6 es van immunitzar porcs amb pèptids derivats de l'HA i a continuació es van infectar amb el virus pH1N1. Tot i que els pèptids-HA produïen una molt bona resposta humoral i cel·lular, no es va detectar activitat neutralitzant i només es va obtenir un efecte parcial en l'eliminació del virus. Part III (Capítols 7 i 8), és la secció on es discuteixen les implicacions dels resultats obtinguts en els diferents estudis i on s'enumeren les conclusions principals. En una secció a part, s'han inclòs totes les referències bibliogràfiques utilitzades per a l'elaboració de la tesi. S'ha inclòs també un apèndix per afegir informació addicional.Influenza A viruses (IAV) are zoonotic pathogens that can replicate in a wide range of hosts, including birds, pigs and humans, among others. Millions of human infections caused by seasonal influenza virus are reported annually. Influenza pandemics have also a significant health and economic repercussions. Although certain subtypes of IAV are better selected in avian species than in humans, there are reports that evidence cases of human infections with avian influenza viruses (AIV). The susceptibility of pigs to infection with influenza viruses of both avian and human origins is also important for public health. The genome of influenza virus is segmented and consists of eight single-stranded negative-sense ribonucleic acid (RNA) molecules encoding 11 or 12 proteins. Thus, if a single cell is simultaneously infected by two distinct influenza viruses, a reassortment can occur resulting in the generation of a novel virus strain. Moreover, mutations in the surface glycoproteins (mainly in the hemagglutinin, HA) are the responsible of the high variability of IAV. Influenza vaccines against seasonal epidemics, although have good efficacy do not elicit immune response against a wide variety of IAV. Thus, seasonal vaccines only confer protection against the circulating viral strains. This, together with the risk of potential pandemics, has highlighted the importance of developing a universal vaccine able to elicit heterosubtypic immunity against multiple viral subtypes. In this thesis the immune response to IAV infection and vaccination was evaluated in the light of the risk of highly pathogenic AIV (HPAIV) A/H5N1 and A/H7N1, and the pandemic IAV A/H1N1. The work is divided into three parts and each one is further divided into chapters. Part I (chapters 1 and 2) contains the general introduction and the objectives of the thesis. The aim of this first part is to give a global overview and to introduce information to understand (i) the influenza infection, (ii) the immune responses elicited after IAV infection and (iii) a brief summary of current vaccines against influenza. Afterwards, the initial objectives to be achieved are exposed. Part II is the body of the thesis and it contains four studies (from chapter 3 to 6) developed during the four-year period comprising the PhD program. All the chapters are published or submitted to publish in international peer-reviewed journals. Thus, each study contains an abstract, a specific introduction, the materials and methods section, the obtained results and a discussion. To study the role of IAV determinants and to characterize the influenza infection in different hosts could be of great importance to direct the efforts to the formulation of more efficient vaccines. The non structural 1 (NS1) protein is known to be a major determinant of virulence in mammals but little is known about its role in avian species. In chapter 3, the involvement of NS1 in viral pathogenicity was evaluated in chickens. Birds were challenged with two reassortant AIV carrying the NS-segment of H5N1 HPAIV in the genetic background of an H7N1 HPAIV. The pathological manifestations, together with the immunological outcome were evaluated. The role of pre-existing immunity during an outbreak is also important and can determine whether the animals succumbed to infection or not. In chapter 4, chickens pre-exposed to H7N2 low pathogenic AIV (LPAIV) were challenged with H7N1 HPAIV and subsequently infected with H5N1 HPAIV. Pre-exposed animals were protected against the lethal H7N1-challenge whereas naïve animals succumbed. However, pre-existing immunity did not provide protection against HA-heterosubtypic virus (H5N1 HPAIV). The presence or absence of H7- and H5-inhibitory antibodies correlate with the protection (or lack of it) afforded. The control of current vaccination programs and their efficacy is useful to plan and design better vaccines. It is well known that wildfowl are the reservoirs of IAV; thus they are extremely important concerning the ecology of the virus. Sera from several avian species from Spanish zoos and wildlife centers were collected during two successive vaccination programs and were tested to evaluate the vaccine-elicited humoral response (chapter 5). The main objective of this work was to determine the efficacy of current vaccines (inactivated water-in-oil) in several avian species and to compare the differences inter- and intra-specie. Finally, and taking into account the potential risk that IAV represent to our society, the efforts were focused on developing a broadly protective influenza vaccine. The 2009 human H1N1 pandemic (pH1N1) is a clear example that pigs can act as a vehicle for mixing and generating new assortments of viruses. In chapter 6 pigs were immunized with HA-derived peptides and subsequently infected with pH1N1 virus. Although the HA-peptides induced broad humoral and cellular responses no neutralization activity was detected and only a partial effect on virus clearance was observed. Part III (chapters 7 and 8) is where the implications of all the findings from the studies are discussed and the major conclusions are listed. A list of all the references used to develop the thesis is listed after the three parts, in an independent section. An appendix section is also included to give further information
Immune response to vaccination with CAF®01 or CDA adjuvanted conserved antigens from porcine viral and bacterial pathogens
No full textEl porc és susceptible a una gran varietat de patògens en edats primerenques com per exemple el virus d'influença (VI) o els bacteris Glaesserella parasuis i Streptococcus suis. Avui dia els efectes d'aquests patògens poden evitar-se amb una bona gestió sanitària dels ramats o amb tractament antibiòtic, i en menor mesura, a través de vacunació. No obstant, tant l'emergència de noves variants víriques així com també de noves soques bacterianes amb resistències antimicrobianes fa necessari buscar alternatives efectives per combatre les infeccions i així millorin la salut dels animals. En aquest sentit, la vacunació representa una excel·lent estratègia per prevenir les malalties infeccioses. Tanmateix, les vacunes disponibles contra aquestes malalties no ofereixen una resposta immune prolongada o protectora contra diferents soques del mateix patogen. Per això, l'ús d'antígens relativament conservats pot esdevenir una estratègia per aconseguir vacunes immunogèniques, efectives i segures.
En aquesta Tesi doctoral es proposa identificar una combinació efectiva d'antigen/adjuvant capaç de reforçar la resposta immunitària innata i adaptativa i així conferir protecció contra un determinat patogen. Per a això s'han avaluat en tres estudis la immunogenicitat i eficàcia d' antígens conservats en combinació amb l' adjuvant liposòmic CAF®01 o el dinucleòtid cíclic CDA.
El primer estudi (capítol III), avalua l'eficàcia i immunogenicitat del pèptid de l'hemaglutinina NG34 adjuvantat amb CAF®01 o amb la combinació de CDA/αGCM. Garrins joves es van vacunar dos cops en un interval de 21 dies i infectar experimentalment amb una soca de VI pandèmica pdmH1N1 per vies intranasal i endotraqueal. La vacunació amb NG34+CAF®01 va produir mes anticossos específics i cèl·lules secretores d'IFN-γ, que a més es va correlacionar amb una menor patologia en pulmó així com també menor carrega vírica. En canvi, la formulació NG34+CDA/αGCM va generar una resposta immune dèbil sense reducció de càrrega vírica i amb una variable patologia compatible amb Influença.
En el segon estudi (capítols IV i V) s'analitza la vacunació neonatal amb el fragment proteic F4, una seqüència conservada en les soques virulentes de G. parasuis. L'estudi es divideix en dues parts: en la primera part es descriu la resposta immune després de la vacunació de amb la proteïna F4 adjuvantada amb CAF®01 o amb CDA mentre que en la segona part es detalla el procés d'infecció dels animals després d'inocular el serotip 5 de G. parasuis per via intraperitoneal. A l'inici de l'estudi es va detectar una colonització nasal natural per part d'una soca heteròloga de G. parasuis. Els animals vacunats amb la combinació d' F4+CAF®01 van ser capaços de reduir la càrrega d'aquesta soca a dia 38 post-vacunació en absència d'anticossos. També es va observar que la combinació d'F4+CDA va generar una resposta humoral específica amb IgGs anti-F4 encara que variable dins del grup. Així mateix es van valorar la resposta immune cel·lular mitjançant citometria de flux, on es va veure que la colonització amb G. parasuis va afectar els paràmetres analitzats. En la segona part de l'estudi, es descriuen els efectes de la inoculació intraperitoneal en els animals vacunats, on es va poder copsar l'afectació generalitzada en tots els grups sense diferències, dificultant la correcta avaluació dels candidats vacunals.
Finalment, en el tercer estudi (capítol VI) s'examina la immunogenicitat i eficàcia de dues proteïnes de la paret cel·lular d'S. suis: els antígens MRP2 i C05. Garrins nounats es van vacunar en dues tandes amb ambdós antígens adjuvantats amb CAF®01 o bé amb CDA i infectats experimentalment intranasalment amb una soca de serotip 2 d'S. suis. Ambdues combinacions van produir una immunogenicitat dèbil, tant humoral com cel·lular, incapaç de protegir els animals front a la infecció a diferencia dels animals immunitzats amb autovacuna.El cerdo es una especie susceptible a una gran variedad de patógenos que afectan a su salud especialmente en edades tempranas como por ejemplo el virus de influenza (VI), o las bacterias Glaesserella parasuis y Streptococcus suis. Actualmente la infección por dichos patógenos puede evitarse gracias a una buena gestión sanitaria de los rebaños o con tratamiento antibiótico y, en menor medida, a través de vacunación. Sin embargo, la emergencia de nuevas variantes víricas o cepas bacterianas con resistencias antimicrobianas obliga a buscar alternativas efectivas para combatir las infecciones y así mejorar la salud de los animales. En este sentido, la vacunación representa una excelente herramienta para prevenir las enfermedades infecciosas. Sin embargo, las vacunas disponibles frente a las enfermedades mencionadas no ofrecen una respuesta inmune prolongada o protectora contra diferentes cepas del mismo patógeno. Por esta razón, el uso de antígenos relativamente conservados puede convertirse en una estrategia para obtener vacunas inmunogénicas, efectivas y seguras.
En la presente Tesis Doctoral se propone identificar una combinación efectiva de antígeno/adyuvante capaz de reforzar la respuesta inmunitaria innata y adaptativa para así conferir protección contra un determinado patógeno. Para ello se han evaluado la inmunogenicidad y eficacia de antígenos conservados en combinación con el adyuvante liposómico CAF®01 o el dinucleótido cíclico CDA.
El primer estudio (capítulo III) evalúa la eficacia e inmunogenicidad del péptido NG34 de la hemaglutinina del virus de Influenza en combinación con los adyuvantes CAF®01 o CDA/αGCM. Cerdos jóvenes fueron doblemente inmunizados y posteriormente infectados con una cepa de VI pandémica pdmH1N1 por vías intranasal y endotraqueal. La vacunación con NG34+CAF®01 produjo una mayor cantidad anticuerpos específicos y células secretoras de IFN-γ, que además se correlacionó con una menor patología en pulmón, así como menor carga vírica. Por el contrario, la formulación NG34+CDA/αGCM generó una respuesta inmune débil sin reducción de carga vírica y con una patología compatible con Influenza variable.
En el segundo estudio (capítulos IV y V), se analiza la vacunación neonatal con el fragmento proteico F4, una secuencia conservada en las cepas virulentas de G. parasuis. El estudio se divide en dos partes: en la primera parte se describe la respuesta inmune tras la vacunación con la proteína F4 en combinación con los adyuvantes CAF®01 o CDA, mientras que en la segunda parte se detalla el proceso de infección de los animales después de la inoculación intraperitoneal del serotipo 5 de G. parasuis. Al inicio del estudio se detectó una colonización nasal natural por parte de una cepa heteróloga de G. parasuis. Los animales vacunados con la combinación de F4+CAF®01 fueron capaces de reducir la carga de esta cepa a día 38 en ausencia de anticuerpos. También se observó que la combinación de F4+CDA generó una respuesta humoral específica, aunque variable dentro del mismo grupo. Asimismo, se valoró la respuesta inmune celular mediante citometría de flujo, donde la colonización con la cepa oportunista afectó a los parámetros analizados. En la segunda parte del estudio, se pudo apreciar que la infección intraperitoneal afectó a todos los grupos de forma generalizada sin diferencias, dificultando la correcta evaluación de los candidatos vacunales.
Por último, el tercer estudio (capítulo VI) examina la inmunogenicidad y eficacia de dos proteínas de la pared celular de S. suis: los antígenos MRP2 y C05. Lechones neonatos fueron doblemente vacunados con ambos antígenos en combinación con los adyuvantes CAF®01 o CDA e infectados por vía intranasal con una cepa de serotipo 2 de S. suis. Ambas combinaciones produjeron una inmunogenicidad débil, tanto humoral como celular, incapaz de proteger a los animales frente a la infección en comparación con los animales inmunizados con autovacuna.Swine is especially susceptible to a wide variety of pathogens at younger ages as for instance viruses like influenza virus (IV), or bacteria such as Glaesserella parasuis, and Streptococcus suis. Disease caused by these pathogens can be prevented by good husbandry practices with the herds or by antimicrobial treatment, and to a lesser extent, vaccination. However, due to the risk of new emerging strains and antimicrobial resistances compels to look for effective alternatives to control infections and improve the animal health. In this respect, vaccination is probably the best tool for infectious diseases prevention. Nonetheless, current vaccines do not confer long lasting or protective immune responses against heterologous strains of these pathogens. For this reason, the use of relatively well-conserved antigens may become an approach to obtain immunogenic, effective, and safe vaccines.
In this PhD dissertation, we aimed to identify effective antigen/adjuvant combinations capable of strengthening the innate and adaptive immune responses and confer protection against a given pathogen. Hence, the immunogenicity and efficacy of conserved antigens were assessed in combination with the liposome-based adjuvant CAF®01 or the cyclic dinucleotide CDA.
The first study of this work (chapter III) assessed the immunogenicity and efficacy of IV hemagglutinin peptide NG34 adjuvanted with CAF®01 or CDA/αGCM. Young pigs were twice immunized in an interval of 21 days and challenged afterwards with pdmH1N1 strain by the intranasal and endotracheal routes. In this experiment, NG34+CAF®01 immunized animals elicited a stronger specific humoral and cell mediated immune response with high amounts of specific IgGs and IFN-γ secreting cells that correlated with less pathology and viral load in lung. On the contrary, NG34+CDA/αGCM formulation showed a weak immune response correlated with variable IV compatible lesions and no reduction of viral load.
In the second study (chapters IV and V), the vaccination with the F4 protein (conserved protein fragment of virulent strains of G. parasuis) was evaluated in neonate piglets. The study is divided in two parts: in the first part, the immune responses to neonate vaccination with CAF®01 or CDA adjuvanted F4 protein was assessed; in the second part, results of the intraperitoneal challenge with serovar 5 of G. parasuis are presented. Soon after the beginning of the study a natural nasal colonization by a heterologous strain of G. parasuis was detected in the animals. Piglets vaccinated with F4+CAF®01 were capable of reducing the bacterial colonization in their nasal cavities on day 38 in the absence of specific antibodies. It was also observed an enhanced, albeit variable specific humoral response in animals immunized with F4+CDA. Similarly, cell-mediated immune responses were evaluated by flow-cytometry where it was noted that nasal colonization by the heterologous strain of G. parasuis affected the immune parameters far beyond than expected. In the second part of the study (chapter V), the intraperitoneal inoculation with serovar 5 of G. parasuis is described. Challenge affected severely all the groups without differences, hampering the correct evaluation of the vaccine candidate's efficacy.
Finally, the third study (chapter VI) evaluated the immunogenicity and efficacy of two cell-wall proteins of Streptococcus suis (MRP2 and C05 antigens). New-born piglets were twice vaccinated with both antigens adjuvanted with either CAF®01 or CDA and finally challenged by intranasal inoculation with serovar 2 of S. suis. In this experiment both combinations elicited weak immune responses, unable to protect the animals against the infection unlike piglets immunized with autogenous vaccine.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicina i Sanitat Animal
Exploring the Antiviral Potential of Natural Compounds against Influenza: A Combined Computational and Experimental Approach
No full textThe influenza A virus nonstructural protein 1 (NS1), which is crucial for viral replication and immune evasion, has been identified as a significant drug target with substantial potential to contribute to the fight against influenza. The emergence of drug-resistant influenza A virus strains highlights the urgent need for novel therapeutics. This study proposes a combined theoretical criterion for the virtual screening of molecular libraries to identify candidate NS1 inhibitors. By applying the criterion to the ZINC Natural Product database, followed by ligand-based virtual screening and molecular docking, we proposed the most promising candidate as a potential NS1 inhibitor. Subsequently, the selected natural compound was experimentally evaluated, revealing measurable virus replication inhibition activity in cell culture. This approach offers a promising avenue for developing novel anti-influenza agents targeting the NS1 protei
Evolution of swine influenza virus associated with vaccination
No full textEl virus de la Influenza A (IAV) és un patogen mundialment distribuït que pot infectar a una varietat d'espècies d'aus i de mamífers, inclosos porcs i humans. Es tracta d'un virus d'ARN de cadena negativa, el genoma del qual està fragmentat en 8 segments codificant les polimerases (PB2, PB1 i PA), l'hemaglutinina (HA), la nucleoproteïna (NP), la neuraminidasa (NA), la proteïna de la matriu (M) i les proteïnes no estructurals (NS). La polimerasa del IAV, com la d'altres virus d'ARN, es caracteritza per la seva baixa fidelitat durant la replicació, que fa que s'acumulin moltes mutacions en el genoma en una curta escala temporal. D'altra banda, el caràcter segmentat del genoma facilita l'intercanvi de segments entre subtipus vírics quan ambdós coinfecten una mateixa cèl·lula hoste. Aquests mecanismes genètics són una font de diversitat genètica elevada que atorga al virus molta plasticitat en ambients canviants. L'evolució del virus fa que aquest adquireixi nous perfils antigènics, el que desemboca en grips estacionals endèmiques i pandèmiques. L'última grip pandèmica de IAV es va produir l'any 2009, quan el virus A(H1N1)pdm09 d'origen porcí, que contenia segments genòmics aviaris, humans i porcins, va emergir a Amèrica i ràpidament es va estendre mundialment entre la població humana. En aquell moment es va reforçar la teoria de que els porcs juguen un paper clau en l'adaptació de IAVs aviaris a humans, ja que poden ser infectats per ambdós. Actualment hi ha 3 subtipus dominants del virus de la grip porcina (SIV): H1N1, H3N2 i H1N2. L'estratègia més utilitzada per controlar el SIV a Europa és l'aplicació de vacunes trivalents, encara que la immunitat generada no és completa. Això provoca que la protecció conferida no sigui esterilitzant, pel que el virus pot replicar i conseqüentment evolucionar generant variants de fuga vacunal. Per tant, el SIV suposa una amenaça contínua per la sanitat animal i humana, ja que la seva evolució pot afectar la seva antigenicitat, rang d'hoste, virulència, resistència antiviral i patogènesis. Degut a aquests antecedents, en la present tesi doctoral s'ha estudiat la dinàmica evolutiva de les poblacions del SIV en model porcí amb immunitat preexistent contra el virus mitjançant tecnologia de seqüenciació massiva. El primer estudi avalua l'evolució del virus Eurasian (EA) "avian-like" H1N1 en animals vacunats i no vacunats, i es va trobar que la selecció positiva juga un paper important en l'evolució del virus en animals vacunats, detectant variants importants en el gen de la HA, la NS1 i la NP. En el segon estudi, s'analitza l'evolució del virus "human-like" H3N2 en animals vacunats i no vacunats que prèviament s'havien recuperat d'una infecció natural inesperada amb el virus A(H1N1)pdm09. Els virus aïllats d'animals vacunats van mostrar proporcionalment més substitucions tant en el gen de la HA com en el de la NA. En l'últim capítol, s'ha estudiat el paper que pot tenir la vacunació en el reordenament genètic i l'aparició de mutacions puntuals durant una coinfecció experimental amb EA "avian-like" H1N1 i "human-like" H3N2. Els resultats mostren que la possibilitat de reordenament és major en animals que no han estat vacunats. D'altra banda, trobem una major diversificació genètica en el subtipus H1N1 en animals vacunats, reportant substitucions en els gens de la HA i la NA que podrien jugar un paper important en l'evasió de la resposta immunitària. Els resultats obtinguts en la present tesi doctoral corroboren l'enorme capacitat de canvi que té el SIV. Els diferents patrons evolutius del SIV trobats en animals vacunats i no vacunats ens atorguen una visió més completa sobre les seves dinàmiques evolutives.El virus de la Influenza A (IAV) es un patógeno mundialmente distribuido que puede infectar a multitud de especies de aves y de mamíferos, incluidos cerdos y humanos. Se trata de un virus de ARN cadena negativa, cuyo genoma está fragmentado en 8 segmentos; las polimerasas (PB2, PB1 y PA), la hemaglutinina (HA), la nucleoproteína (NP), la neuraminidasa (NA), la matriz (M) y el segmento que codifica para las proteínas no estructurales (NS). La polimerasa del IAV, como la de otros virus de RNA, se caracteriza por su baja fidelidad durante la replicación, que hace que se acumulen muchas mutaciones en el genoma de IAV en una escala temporal corta. Además, se pueden producir intercambios de segmentos entre distintos subtipos cuando simultáneamente coinfectan al mismo huésped. Estos mecanismos genéticos son una fuente de diversidad genética elevada, que otorga al virus mucha plasticidad ante ambientes cambiantes. La evolución del virus puede hacer que estos adquieran nuevos perfiles antigénicos, no siendo reconocidos por la inmunidad previa existente, generando gripes estacionales endémicas y pandémicas. En el año 2009, la cepa de origen porcina A(H1N1)pdm09 que contenía segmentos de virus humanos, aviares y porcinos, causó la última pandemia de gripe en humanos. Reforzándose la teoría de que los cerdos juegan un papel clave en la adaptación de IAVs aviares a humanos, ya que pueden ser infectados por ambos. Actualmente hay 3 subtipos dominantes del virus de la gripe porcina (SIV): H1N1, H3N2 y H1N2. La estrategia más usada para controlar el SIV en Europa es la aplicación de vacunas trivalentes, aunque la inmunidad generada no es completa. Esto provoca que la protección conferida no sea esterilizante, por lo que el virus puede replicar y por ende evolucionar generando variantes de escape vacunal Por lo tanto, el SIV supone una amenaza continua para la sanidad animal y humana, ya que su evolución puede afectar su antigenicidad, rango de huésped, virulencia, resistencia antiviral y patogénesis. Debido a todos estos antecedentes, en la presente tesis doctoral se ha estudiado la dinámica evolutiva de las poblaciones víricas del SIV en modelo porcino con inmunidad preexistente contra el virus mediante tecnología de secuenciación masiva. El primer estudio evalúa la evolución del virus H1N1 Eurasian "avian-like" (EA) en animales vacunados y no vacunados, y se encontró que la selección positiva juega un papel importante en la evolución del virus en animales vacunados, detectando mutaciones importantes en la HA, la NS1 y la NP. En el segundo estudio, se analiza la evolución del virus H3N2 "human-like" en animales vacunados y no vacunados que previamente se habían recuperado de una infección natural inesperada con el virus A(H1N1)pdm09. En ambos escenarios la selección natural esta influenciando la evolución del virus, encontrando proporcionalmente más substituciones no sinónimas en la HA y la NA en virus recuperados de animales vacunados. En el último capítulo, se ha estudiado el papel que puede tener la vacunación en el reordenamiento y la deriva genética del virus durante una coinfección experimental con H1N1 EA y H3N2 "human-like". Los resultados muestran que la posibilidad de reordenamiento es mayor en animales que no han sido vacunados. Por otro lado, encontramos una mayor diversificación genética en el subtipo H1N1 en animales vacunados, reportando substituciones en los genes dela HA y la NA que podrían jugar un papel importante en la evasión de la respuesta inmune. Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral corroboran la enorme capacidad de mutación y adaptación que tiene el SIV. Los diferentes patrones evolutivos encontrados en animales vacunados y no vacunados nos otorgan una visión más completa sobre las dinámicas evolutivas del mismo.Influenza A virus (IAV) is a worldwide distributed pathogen able to infect many species of avian and mammals, including humans and pigs. Its genome is characterized by having 8 RNA negative sense segments: the polymerases (PB2, PB1, and PA), the hemagglutinin (HA), the nucleoprotein (NP), the neuraminidase (NA), matrix (M), and the segment that code for the non-structural proteins (NS). IAV polymerases, such as other RNA viruses, have a low proofreading activity, thus virus genome accumulates a great deal of point mutation on a short time scale. Besides, genomic reassortment events are feasible when two different IAV subtypes simultaneously coinfect the same host. These genetic mechanisms are a source of high genetic diversity, which provides plasticity to the virus, being able to quickly adapt in changing environments. Virus evolution can make that virus achieve new antigenic patterns, being no longer recognized by the previous host immunity, generating seasonal epidemic and pandemic IAVs. In 2009 a swine-origin A(H1N1)pdm09 strain arose, harbouring swine, human and avian influenza segments, and caused the last IAV pandemic. This outbreak, highlighted the hypothesis of pigs as "mixing vessels", playing an important role in the adaptation of avian viruses to humans, as pigs could be infected by both IAVs. Currently, there are 3 dominant subtypes of swine influenza virus (SIV) circulating in pigs: H1N1, H3N2, and H1N2. To control SIV, the most widely used strategy in Europe, although limited, is the application of trivalent vaccines. The immunity provided by this vaccine is not complete, allowing virus replication and hence evolving, which could generate escape mutants. Therefore, SIV poses a continuous threat to both, animal and human health, since its evolution can affect its antigenicity, host range, virulence, antiviral resistance, and pathogenesis. Due to all these antecedents, in this doctoral thesis, the evolutionary dynamics of SIV viral populations have been studied in a pig model with pre-existing immunity against the virus by next sequencing technology. The first study evaluates the evolution of the Eurasian "avian-like" (EA) H1N1 virus in vaccinated and nonvaccinated animals. Positive selection was the main evolution force detected in samples collected from vaccinated animals, where important mutations were reported in HA, NS1, and NP. In the second study, the evolution of the "human-like" H3N2 virus was analyzed in vaccinated and nonvaccinated animals that had previously recovered from an unexpected natural infection with the A(H1N1)pdm09 virus. In both scenarios, natural selection was influencing virus evolution, finding proportionally more nonsynonymous substitutions in HA and NA in viruses recovered from vaccinated animals. In the last chapter, the impact of the vaccine on genome reassortment and genetic drift during an experimental coinfection with H1N1 EA and H3N2 "human-like" has been studied. Results showed a minor possibility of reassortment events in vaccinated animals. On the other hand, the greatest genetic diversification was detected in H1N1 subtype in vaccinated animals, reporting substitutions that may play an important role in the evasion of the immune response in the HA and NA. The results obtained in this doctoral thesis corroborate the enormous capacity of mutation and adaptation of SIV. Different evolutionary patterns found in vaccinated and nonvaccinated animals were detected, providing a novel insight of SIV evolution under different scenarios
Evolution of swine influenza virus associated with vaccination
No full textEl virus de la Influenza A (IAV) és un patogen mundialment distribuït que pot infectar a una varietat d’espècies d’aus i de mamífers, inclosos porcs i humans. Es tracta d’un virus d’ARN de cadena negativa, el genoma del qual està fragmentat en 8 segments codificant les polimerases (PB2, PB1 i PA), l’hemaglutinina (HA), la nucleoproteïna (NP), la neuraminidasa (NA), la proteïna de la matriu (M) i les proteïnes no estructurals (NS). La polimerasa del IAV, com la d’altres virus d’ARN, es caracteritza per la seva baixa fidelitat durant la replicació, que fa que s’acumulin moltes mutacions en el genoma en una curta escala temporal. D’altra banda, el caràcter segmentat del genoma facilita l’intercanvi de segments entre subtipus vírics quan ambdós coinfecten una mateixa cèl·lula hoste. Aquests mecanismes genètics són una font de diversitat genètica elevada que atorga al virus molta plasticitat en ambients canviants. L’evolució del virus fa que aquest adquireixi nous perfils antigènics, el que desemboca en grips estacionals endèmiques i pandèmiques. L’última grip pandèmica de IAV es va produir l’any 2009, quan el virus A(H1N1)pdm09 d’origen porcí, que contenia segments genòmics aviaris, humans i porcins, va emergir a Amèrica i ràpidament es va estendre mundialment entre la població humana. En aquell moment es va reforçar la teoria de que els porcs juguen un paper clau en l’adaptació de IAVs aviaris a humans, ja que poden ser infectats per ambdós. Actualment hi ha 3 subtipus dominants del virus de la grip porcina (SIV): H1N1, H3N2 i H1N2. L’estratègia més utilitzada per controlar el SIV a Europa és l’aplicació de vacunes trivalents, encara que la immunitat generada no és completa. Això provoca que la protecció conferida no sigui esterilitzant, pel que el virus pot replicar i conseqüentment evolucionar generant variants de fuga vacunal. Per tant, el SIV suposa una amenaça contínua per la sanitat animal i humana, ja que la seva evolució pot afectar la seva antigenicitat, rang d’hoste, virulència, resistència antiviral i patogènesis.
Degut a aquests antecedents, en la present tesi doctoral s’ha estudiat la dinàmica evolutiva de les poblacions del SIV en model porcí amb immunitat preexistent contra el virus mitjançant tecnologia de seqüenciació massiva. El primer estudi avalua l’evolució del virus Eurasian (EA) “avian-like” H1N1 en animals vacunats i no vacunats, i es va trobar que la selecció positiva juga un paper important en l’evolució del virus en animals vacunats, detectant variants importants en el gen de la HA, la NS1 i la NP. En el segon estudi, s’analitza l’evolució del virus “human-like” H3N2 en animals vacunats i no vacunats que prèviament s’havien recuperat d’una infecció natural inesperada amb el virus A(H1N1)pdm09. Els virus aïllats d’animals vacunats van mostrar proporcionalment més substitucions tant en el gen de la HA com en el de la NA. En l’últim capítol, s’ha estudiat el paper que pot tenir la vacunació en el reordenament genètic i l’aparició de mutacions puntuals durant una coinfecció experimental amb EA “avian-like” H1N1 i “human-like” H3N2. Els resultats mostren que la possibilitat de reordenament és major en animals que no han estat vacunats. D’altra banda, trobem una major diversificació genètica en el subtipus H1N1 en animals vacunats, reportant substitucions en els gens de la HA i la NA que podrien jugar un paper important en l’evasió de la resposta immunitària.
Els resultats obtinguts en la present tesi doctoral corroboren l’enorme capacitat de canvi que té el SIV. Els diferents patrons evolutius del SIV trobats en animals vacunats i no vacunats ens atorguen una visió més completa sobre les seves dinàmiques evolutives.El virus de la Influenza A (IAV) es un patógeno mundialmente distribuido que puede infectar a multitud de especies de aves y de mamíferos, incluidos cerdos y humanos. Se trata de un virus de ARN cadena negativa, cuyo genoma está fragmentado en 8 segmentos; las polimerasas (PB2, PB1 y PA), la hemaglutinina (HA), la nucleoproteína (NP), la neuraminidasa (NA), la matriz (M) y el segmento que codifica para las proteínas no estructurales (NS). La polimerasa del IAV, como la de otros virus de RNA, se caracteriza por su baja fidelidad durante la replicación, que hace que se acumulen muchas mutaciones en el genoma de IAV en una escala temporal corta. Además, se pueden producir intercambios de segmentos entre distintos subtipos cuando simultáneamente coinfectan al mismo huésped. Estos mecanismos genéticos son una fuente de diversidad genética elevada, que otorga al virus mucha plasticidad ante ambientes cambiantes. La evolución del virus puede hacer que estos adquieran nuevos perfiles antigénicos, no siendo reconocidos por la inmunidad previa existente, generando gripes estacionales endémicas y pandémicas. En el año 2009, la cepa de origen porcina A(H1N1)pdm09 que contenía segmentos de virus humanos, aviares y porcinos, causó la última pandemia de gripe en humanos. Reforzándose la teoría de que los cerdos juegan un papel clave en la adaptación de IAVs aviares a humanos, ya que pueden ser infectados por ambos. Actualmente hay 3 subtipos dominantes del virus de la gripe porcina (SIV): H1N1, H3N2 y H1N2. La estrategia más usada para controlar el SIV en Europa es la aplicación de vacunas trivalentes, aunque la inmunidad generada no es completa. Esto provoca que la protección conferida no sea esterilizante, por lo que el virus puede replicar y por ende evolucionar generando variantes de escape vacunal Por lo tanto, el SIV supone una amenaza continua para la sanidad animal y humana, ya que su evolución puede afectar su antigenicidad, rango de huésped, virulencia, resistencia antiviral y patogénesis.
Debido a todos estos antecedentes, en la presente tesis doctoral se ha estudiado la dinámica evolutiva de las poblaciones víricas del SIV en modelo porcino con inmunidad preexistente contra el virus mediante tecnología de secuenciación masiva. El primer estudio evalúa la evolución del virus H1N1 Eurasian “avian-like” (EA) en animales vacunados y no vacunados, y se encontró que la selección positiva juega un papel importante en la evolución del virus en animales vacunados, detectando mutaciones importantes en la HA, la NS1 y la NP. En el segundo estudio, se analiza la evolución del virus H3N2 “human-like” en animales vacunados y no vacunados que previamente se habían recuperado de una infección natural inesperada con el virus A(H1N1)pdm09. En ambos escenarios la selección natural esta influenciando la evolución del virus, encontrando proporcionalmente más substituciones no sinónimas en la HA y la NA en virus recuperados de animales vacunados. En el último capítulo, se ha estudiado el papel que puede tener la vacunación en el reordenamiento y la deriva genética del virus durante una coinfección experimental con H1N1 EA y H3N2 “human-like”. Los resultados muestran que la posibilidad de reordenamiento es mayor en animales que no han sido vacunados. Por otro lado, encontramos una mayor diversificación genética en el subtipo H1N1 en animales vacunados, reportando substituciones en los genes dela HA y la NA que podrían jugar un papel importante en la evasión de la respuesta inmune.
Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral corroboran la enorme capacidad de mutación y adaptación que tiene el SIV. Los diferentes patrones evolutivos encontrados en animales vacunados y no vacunados nos otorgan una visión más completa sobre las dinámicas evolutivas del mismo.Influenza A virus (IAV) is a worldwide distributed pathogen able to infect many species of avian and mammals, including humans and pigs. Its genome is characterized by having 8 RNA negative sense segments: the polymerases (PB2, PB1, and PA), the hemagglutinin (HA), the nucleoprotein (NP), the neuraminidase (NA), matrix (M), and the segment that code for the non-structural proteins (NS). IAV polymerases, such as other RNA viruses, have a low proofreading activity, thus virus genome accumulates a great deal of point mutation on a short time scale. Besides, genomic reassortment events are feasible when two different IAV subtypes simultaneously coinfect the same host. These genetic mechanisms are a source of high genetic diversity, which provides plasticity to the virus, being able to quickly adapt in changing environments. Virus evolution can make that virus achieve new antigenic patterns, being no longer recognized by the previous host immunity, generating seasonal epidemic and pandemic IAVs. In 2009 a swine-origin A(H1N1)pdm09 strain arose, harbouring swine, human and avian influenza segments, and caused the last IAV pandemic. This outbreak, highlighted the hypothesis of pigs as “mixing vessels”, playing an important role in the adaptation of avian viruses to humans, as pigs could be infected by both IAVs. Currently, there are 3 dominant subtypes of swine influenza virus (SIV) circulating in pigs: H1N1, H3N2, and H1N2. To control SIV, the most widely used strategy in Europe, although limited, is the application of trivalent vaccines. The immunity provided by this vaccine is not complete, allowing virus replication and hence evolving, which could generate escape mutants. Therefore, SIV poses a continuous threat to both, animal and human health, since its evolution can affect its antigenicity, host range, virulence, antiviral resistance, and pathogenesis.
Due to all these antecedents, in this doctoral thesis, the evolutionary dynamics of SIV viral populations have been studied in a pig model with pre-existing immunity against the virus by next sequencing technology. The first study evaluates the evolution of the Eurasian “avian-like” (EA) H1N1 virus in vaccinated and nonvaccinated animals. Positive selection was the main evolution force detected in samples collected from vaccinated animals, where important mutations were reported in HA, NS1, and NP. In the second study, the evolution of the “human-like” H3N2 virus was analyzed in vaccinated and nonvaccinated animals that had previously recovered from an unexpected natural infection with the A(H1N1)pdm09 virus. In both scenarios, natural selection was influencing virus evolution, finding proportionally more nonsynonymous substitutions in HA and NA in viruses recovered from vaccinated animals. In the last chapter, the impact of the vaccine on genome reassortment and genetic drift during an experimental coinfection with H1N1 EA and H3N2 “human-like” has been studied. Results showed a minor possibility of reassortment events in vaccinated animals. On the other hand, the greatest genetic diversification was detected in H1N1 subtype in vaccinated animals, reporting substitutions that may play an important role in the evasion of the immune response in the HA and NA.
The results obtained in this doctoral thesis corroborate the enormous capacity of mutation and adaptation of SIV. Different evolutionary patterns found in vaccinated and nonvaccinated animals were detected, providing a novel insight of SIV evolution under different scenarios.Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicina i Sanitat Animal
Influenza a Virus Inhibition: Evaluating Computationally Identified Cyproheptadine Through In Vitro Assessment
No full textInfluenza is still a chronic global health threat, inducing a sustained search for effective antiviral therapeutics. Computational methods have played a pivotal role in developing small molecule therapeutics. In this study, we applied a combined in silico and in vitro approach to explore the potential anti-influenza activity of cyproheptadine, a clinically used histamine H1 receptor antagonist. Virtual screening based on the average quasivalence number (AQVN) and electron–ion interaction potential (EIIP) descriptors suggests similarities between cyproheptadine and several established anti-influenza agents. The subsequent ligand-based pharmacophore screening of a focused H1 antagonist library was aligned with the bioinformatics prediction, and further experimental in vitro evaluation of cyproheptadine demonstrated its anti-influenza activity. These findings provide proof of concept for cyproheptadine’s in silico-predicted antiviral potential and underscore the value of integrating computational predictions with experimental validation. The results of the current study provide a preliminary proof of concept for the predicted anti-influenza potential based on computational analysis and emphasize the utility of integrating in silico screening with experimental validation in the early stages of drug repurposing efforts
- …
