1,721,078 research outputs found
Gene expression profile of Wnt/beta-catenin pathway elements in thymocytes and CD4 + T lymphocytes of BALB/c mice.
No full textINTRODUÇÃO: A molécula HIG2 pode atuar como agonista da via Wnt/beta-catenina, pois se liga ao receptor Frizzled 10 e induz a expressão de genes da mesma. Dados recentes do nosso grupo mostraram expressão diferencial do gene HIG2 em células mononucleares do sangue periférico e em especial linfócitos T CD4+ naïve, mas não em células diferenciadas de memória em indivíduos sadios. Também observamos in vitro em linfócitos T CD4+ de indivíduos saudáveis que o peptídeo sintético HIG2 induziu a ativação da via Wnt/beta-catenina, produção de HIG2 e outros produtos da via, além da proliferação de células T CD4+ naïve sugerindo um papel do HIG2 na proliferação homeostática de linfócitos T CD4+. HIPÓTESE: Como as células T CD4+ naïve são diretamente exportadas pelo timo, os níveis aumentados de HIG2 neste tipo celular sejam decorrentes da ativação da via Wnt/?-catenina nos estágios tardios da diferenciação de timócitos. Portanto, as células T CD4+ naïve e timócitos simples positivos para CD4 (SP CD4) apresentariam perfil semelhante de expressão de HIG2 e genes da via Wnt/beta-catenina, incluindo receptores, fatores de transcrição, genes estruturais da via e alvos quando comparadas as demais populações celulares. OBJETIVO: Avaliar a expressão de HIG2 e outros genes da via Wnt/beta-catenina em timócitos e linfócitos T CD4+ naïve e memória de camundongos. MÉTODOS: Isolamos timócitos duplo negativos (DN), timócitos duplo positivos (DP), simples positivos para CD4 e CD8 (SP CD4 e SP CD8) de timo e também células T CD4+ naïve e memória do baço dos mesmos camundongos pelo procedimento de citometria de fluxo. Analisamos a expressão de vários genes da via Wnt/beta-catenina por PCR em tempo real. RESULTADOS: Em timócitos DN há expressão significativa dos genes que codificam para Frizzled 6, LRP5, TCF-1 e TCF-4 em relação as outras populações celulares. Nos timócitos DP há maior expressão dos genes que codificam para LRP5, LRP6, beta-catenina, GSK-3beta, TCF-1 e Bcl-XL em relação às demais populações. Em timócitos SP CD4 foi detectada expressão diferencial de genes que codificam para Frizzled 10, LRP6, beta-catenina, LEF-1 e HIG2 enquanto que na população de timócitos SP CD8 não observamos expressão significativa de nenhum gene da via Wnt/beta-catenina. Nas células T CD4+ naïve há expressão significativa de Frizzled 5 e Frizzled 10 quando comparadas a timócitos SP CD8 e células T CD4+ de memória . Já nos linfócitos T CD4+ de memória, detectamos maior expressão de Frizzled 6, TCF-4, Bcl-XL e ciclina D1 em relação as demais populações. CONCLUSÃO: Cada população apresenta um perfil distinto de expressão gênica. As maiores semelhanças ocorrem entre os timócitos DN e DP onde as principais diferenças são a expressão de Frizzled 6 e Ciclina D1.Os timócitos SP CD4 e as células T CD4+ naïve não apresentaram níveis semelhantes de expressão gênica de elementos da via Wnt canônica, o que não corrobora a hipótese de que o perfil transcripcional de timócitos SP CD4 e linfócitos T CD4+ naïve é semelhante. Ainda, não observamos expressão aumentada de HIG2 em linfócitos T CD4+ naïve comparados aos de memória, o que contrasta com os resultados obtidos anteriormente por nosso grupo com amostras humanas sugerindo que camundongos não regulam a expressão de HIG2 em linfócitos T CD4+ como os seres humanosINTRODUCTION: HIG2 molecule can act as an agonist of Wnt/?-catenin pathway, because it able to bind to Frizzled 10 receptor and induce the expression of the genes related to this pathway. Recent data from our group have shown differential expression of the HIG2 gene in peripheral blood mononuclear cells, and particularly in naive CD4 + T cells, but not in memory T cells in healthy individuals. We have also observed that inducing the CD4 + T lymphocytes from healthy individuals with HIG2 synthetic peptide in vitro, led to the activation of Wnt/beta-catenin pathway, HIG2 production and expression of other target genes of this pathway and the proliferation of naïve CD4 + T cells, suggesting that HIG2 may play a role in homeostatic proliferation of CD4+ T cells. HYPOTHESIS: As naïve CD4 + T cells are directly exported from the thymus, we have hypothesized that increased levels of HIG2 in this cell type is due to the activation of Wnt/beta-catenin pathway in the later stages of thymocyte differentiation. Therefore, naïve CD4 + T cells and CD4 single-positive thymocytes (CD4 SP) may share a similar pattern of gene expression of HIG2 and Wnt/beta-catenin genes (genes that encodes receptors and co-receptors, transcription factors, structural and target genes) when compared to other cell populations. AIM: our major aim is to evaluate the expression of HIG2 and other genes of the Wnt/beta-catenin in thymocytes, naïve CD4 + T lymphocytes and memory CD4+ T cells from mice. METHODS: We have isolated thymocytes double negative (DN) T cells, positive double positive (DP) T cells, CD4 and CD8 single-positive thymocytes (CD4 SP and CD8 SP) of thymus from BALB/c mice and we have also isolated naïve CD4 + T cells and memory CD4+ T cells of the spleen from the same mice we have used the thymus. We have analysed the expression of several genes of Wnt/beta-catenin by real time PCR RESULTS: In DN cells there was expression of the Frizzled 6, LRP5, TCF-1 and TCF-4 genes compared to other cell populations. In DP thymocytes it could be observed a greater expression of LRP5, LRP6, beta-catenin, GSK-3beta, TCF-1 and Bcl-XL genes compared to other populations. In CD4 SP thymocytes, it was detected differential expression of the Frizzled 10, LRP6, beta-catenin, LEF-1 HIG2 genes and in CD8 SP cells we could not observe significant expression of any gene of Wnt/?-catenin pathway. In naïve CD4 + T cells there was a significant expression of Frizzled5 and Frizzled 10 genes when compared to all the samples. In memory CD4 + T cells, we have detected higher expression of Frizzled 6, TCF-4, Bcl-XL and cyclin D1 genes than in any other populations. CONCLUSION: Each population has a distinct gene expression pattern. The biggest similarities occur between DN and DP thymocytes where the main differences are the expression of Frizzled 6 and cyclin D1.However, the pattern of gene expression in SP thymocytes is not similar to those presented by naïve CD4+ T cells. Moreover, we have not observed increased expression of HIG2 in naïve CD4 + lymphocytes compared to memory CD4+ T cells, which contrasts the results obtained previously by our group with human samples suggesting that mice might not regulate the HIG2 expression in CD4 + T lymphocytes as human beings d
Genetics and pathogenesis of chagasic megaesophagus: identification of pathogenic variants and investigation of their functional impact
No full textA doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, afeta 5 a 8 milhões de pessoas em todo o mundo e cerca de 1/3 desenvolve a doença cardíaca crônica (CCC) ou digestiva (megaesôfago/megacólon), enquanto a maioria permanece assintomática, na chamada forma indeterminada da doença de Chagas (FI). A genética do hospedeiro e a produção local de citocinas como IFN- parecem desempenhar um papel importante na progressão da doença, mas pouco se sabe sobre o papel da genética na suscetibilidade às formas digestivas da DC. Nosso grupo descobriu recentemente que a maioria dos casos de CCC em famílias com múltiplos pacientes com doença de Chagas carrega mutações prejudiciais em genes mitocondriais. Neste trabalho buscamos identificar mutações mitocondriais associadas à forma digestiva da doença de Chagas. Realizamos o sequenciamento completo do exoma de 13 pacientes megaesôfago chagásico (MEC) e 45 indivíduos FI. Encontramos a variante de um único nucleotídeo com dano missense MRPS18B 688C > G P230A, em 5 dos 13 pacientes MEC, enquanto a variante apareceu em um dos 45 pacientes FI [P = 0,015, OR = 11, IC de 95% (1,56- 128,6)]. Um dos 5 pacientes MEC é homozigoto, enquanto os outros quatro MEC e o portador FI são heterozigotos. Analisamos a função mitocondrial de linhagens de células linfoblastóides transformadas por EBV em resposta a IFN-. Nossos achados demonstram que os portadores MEC da variante MRPS18B 688C > G P230A exibem níveis aumentados de nitrito e proteínas nitradas; e o paciente homozigoto (G/G) níveis reduzidos de produção de ATP e aumento de superóxido mitocondrial em comparação com pacientes MEC que não carregavam a variante. Os resultados sugerem que mutações em genes mitocondriais podem ser um fator de maior susceptibilidade à disfunções mitocondriais e estresse nitro-oxidativo induzidos por citocinas como IFN-. Nossa hipótese é que em pacientes portadores de mutações mitocondriais homozigotas e heterozigotas, as citocinas produzidas localmente podem causar disfunção mitocondrial em neurônios no plexo mioentérico esofágico, levando à alteração da motilidade e megaesôfagoChagas disease (CD), caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, affects 5-8 million people worldwide, and around 1/3 develop chronic cardiac (CCC) or digestive disease (megaesophagus/megacolon), while the majority remain asymptomatic, in the so-called indeterminate form of Chagas disease (ASY). Host genetics and local production of cytokines IFN-gamma seem to play an important role in disease progression, but little is known about the role of genetics in susceptibility to the digestive forms of CD. Our group has recently found that most CCC cases in families with multiple Chagas disease patients carry damaging mutations in mitochondrial genes. We here searched for mitochondrial mutations associated with the digestive form of Chagas disease. We performed whole exome sequencing of 13 chagasic megaesophagus (CME) and 45 ASY individuals. We found the missense damaging single nucleotide variant MRPS18B 688C > G P230A, in 5 out of the 13 CME patients, while the variant appeared in one out of 45 ASY patients [P=0.015, OR=11, 95% CI (1.56-128.6)]. One of 5 CME patients was homozygous while the other four CME and the ASY carrier were heterozygous. We analysed the mitochondrial function of EBV-transformed lymphoblastoid cell lines in response to the inflammatory cytokine IFN-. We found the CME carriers of MRPS18B 688C > G P230A displayed increased levels of nitrite and nitrated proteins; and the homozygous (G/G) patient showed reduced levels of ATP production and increased mitochondrial ROS production as compared with the not-carrying CME patients. These results suggest that mutations in mitochondrial genes may be a factor in increased susceptibility to mitochondrial dysfunction and nitro-oxidative stress induced by cytokines such as IFN-. We hypothesize that in patients carrying homozygous and heterozygous mitochondrial mutations, locally produced cytokines may cause mitochondrial dysfunction in neurons in the esophageal myenteric plexus, leading to motility alteration and megaesophagu
STING signaling drives protective innate and adaptive immunity against Trypasonoma cruzi infection
No full textA doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. Dados da Organização Mundial da Saúde indicam que cerca de 1,2 milhão de pessoas estão infectadas por esse parasita no Brasil. A infecção pelo T. cruzi é marcada pela indução de IFN do tipo I e citocinas pró-inflamatórias. Dados da literatura apontam que uma via de reconhecimento do parasita dependente de TBK-1 e IRF3 é fundamental para a indução de IFN- em células infectadas. Entretanto, os mecanismos ainda não são totalmente esclarecidos. Dessa forma, neste trabalho investigamos a participação da proteína STING na resposta inata e adaptativa ao T. cruzi, dada sua íntima interação com TBK-1 e IRF3. Nós demonstramos que a sinalização de STING é necessária para a produção de IFN-, IL-6 e IL-12 em resposta à infecção pela cepa Y do Trypanosoma cruzi em macrófagos. Demonstramos também que a infecção celular é necessária para ativar a sinalização de STING e que STING é essencial para a ativação imune mediada pelo DNA do parasita. Além disso, nossos resultados revelaram que a sinalização de STING promove uma ativação mais intensa da resposta imune inata e que a deficiência de STING resulta em um menor número de linfócitos T CD8+ produtores de IFN- ou da combinação IFN- /perforina contra o parasita no baço dos animais infectados. Observamos também que embora o infiltrado inflamatório no coração dos animais infectados tenha sido semelhante, a expressão de genes relacionados à proteção imune contra a infecção aguda pelo parasita foi menor na ausência de STING. Por fim, demonstramos que animais deficientes para STING apresentam maior parasitemia durante todo o curso da infecção aguda, além de apresentarem maior parasitismo no coração. Portanto, acreditamos que nosso trabalho traz uma contribuição importante para o entendimento da imunopatologia da infecção pelo Trypanosoma cruzi ao desvendar um novo mecanismo molecular envolvido na indução de respostas imunes inata e adaptativa contra o parasitaChagas disease is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. Data from the World Health Organization indicate that about 1.2 million people are infected by this parasite in Brazil. T. cruzi infection is marked by the induction of type I IFN and pro-inflammatory cytokines. Previous data indicate that a TBK-1 and IRF3-dependent pathway is essential for parasite recognition and induction of IFN- in infected cells. However, the mechanisms are still not fully understood. Thus, in this work we investigated the participation of the STING protein in the innate and adaptive response to T. cruzi, given its close interaction with TBK-1 and IRF3. We demonstrated that STING signaling is necessary for the production of IFN- , IL-6 and IL-12 in response to infection by the Trypanosoma cruzi Y strain in macrophages. We also demonstrated that cellular infection is necessary to activate STING signaling and that STING is essential for T. cruzi DNA-mediated immune activation. Our results revealed that STING signaling promotes a more intense innate immune activation and that STING deficiency resulted in a lower number of CD8+ T lymphocytes producing IFN- or the IFN- /perforin combination against the parasite in the spleen of infected animals. We also observed that although the inflammatory infiltrate in the hearts of infected animals was similar, the expression of genes related to immune protection against acute infection by the parasite was lower in the absence of STING. Finally, we demonstrated that animals deficient for STING have greater parasitemia throughout the course of the acute infection, in addition to having greater parasitism in the heart. Therefore, we believe that our work makes an important contribution to the understanding of the immunopathology of Trypanosoma cruzi infection by unveiling a new molecular mechanism involved in the induction of innate and adaptive immune responses against the parasit
Molecular bording of recogniton the antigen for T lymphocites
No full textO estudo dos mecanismos de reconhecimento de epitopos por linfocitos T e fundamental para a manipulacao de processos imunologicos, tais como imunizacao protetora contra patogenos e a inducao de tolerancia em doencas auto-imunes. Neste trabalho almejamos identificar epitopos imunodominantes e caracterizar a interface MHC-peptideo-TCR em antigenos de duas doencas endemicas: a Paracoccidioidomicose e doenca de Chagas. Vacinas eficazes sao capazes de induzir uma resposta imune protetora em uma populacao geneticamente distinta. 0 primeiro modelo abordado neste trabalho foi o estudo de epitopos da glicoproteina gp43 de Paracoccidioides brasiliensis, agente causador de uma micose sistemica que atinge toda a America Latina: a Paracoccidioidomicose (PCM). Analisamos a resposta a gp43, capaz de conferir protecao contra o desafio letal em camundongos, em busca de epitopos imunodominantes em humanos. Para tal, utilizamos o algoritmo TEPITOPE para selecionar sequencias que poderiam se ligar a multiplas moleculas HLA-DR e testamos o reconhecimento por celulas T de pacientes tratados e curados de PCM. A real promiscuidade dos cinco peptideos previstos como os mais promiscuos selecionados da sequencia da gp43 foi avaliada por ensaios de ligacao a 9 diferentes moleculas HLA-DR prevalentes na populacao. Os peptideos tambem foram testados em ensaio de proliferacao primaria com PBMC de 29 pacientes PCM e 13 individuos normais. PBMC de 100 por cento dos pacientes reconheceram a gp43 e 72 por cento (21/29) reconheceram pelo menos um peptideo. 0 peptideo gp43(181-195) se ligou a 100 por cento das moleculas de HLA-DR em ensaio de ligacao e foi reconhecido por 48 por cento (14/29) dos pacientes testados, enquanto que os demais peptideos selecionados se ligaram a 22-78 por cento das moleculas HLA-DR testadas foram reconhecidos por 28-41 por cento dos pacientes. A combinacao desses peptideos em um pool aumentou a frequencia de reconhecimento para 75 por cento. Observamos correlacao positiva entre a promiscuidade na previsao pelo TEPITOPE, frequencia de ligacao e o reconhecimento. 0 mimetismo molecular entre o T. cruzi e antigenos do coracao e um dos mecanismos patogenicos hipotetizados para a cardiopatia chagasica cronica, que ocorre em 30 por cento dos cerca de 10 milhoes de individuos infectados pelo parasita em toda a America Latinaa(au)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe
Evaluation of immunological response Against SARS-CoV-2 in risk groups vaccinated with CoronaVac
No full textNeste trabalho, tivemos como objetivo avaliar a resposta de grupos vulneráveis à COVID-19, como idosos e pacientes com Imunodeficiência Comum Variável (ICV), vacinados com CoronaVac. Além da resposta ao regime inicial de 2doses, também foi avaliada a resposta ao reforço vacinal com a vacina de RNAm BNT162b2. Níveis de IgG anti-RBD e Spike de SARS-CoV-2, IFN- e IL-2 após ensaio de liberação de citocinas induzido por antígeno, foram determinados por ELISA. Título de neutralização foram quantificados por teste de neutralização baseado em efeito citopático (CPE-VNT) para os dois grupos. Na coorte de idosos, foram incluídos indivíduos vacinados com 2 doses de CoronaVac (N=101, dos quais 54% estão acima dos 55 anos), ou 2 CoronaVac + 1 BNT162b2 (N=31), convalescentes foram recrutados como controles positivos (N=72) e amostras pré-pandêmicas foram incluídas como controle negativo (N=36). Não foi observada diferença na produção de IFN- e IL-2 entre vacinados com 2 doses e convalescentes. Vacinados tiveram maior produção de IgG anti-RBD de SARS-CoV-2, entretanto convalescentes apresentaram maiores títulos de anticorpos neutralizantes. Foi observada uma correlação negativa significativa entre produção de citocinas e anticorpos e idade dos participantes. Mulheres e homens mais jovens apresentaram maior produção de IL-2 em relação aos participantes acima de 55 anos. Homens acima de 55 anos tiveram níveis de IgG anti-RBD diminuídos em comparação àqueles abaixo de 55 anos. Mulheres acima de 55 apresentaram menor produção de anticorpos neutralizantes em comparação às mais jovens. A terceira dose (BNT162b2) levou à um aumento significativo na produção de anticorpos específicos e neutralizantes. O aumento foi observado tanto em indivíduos acima quanto abaixo de 55 anos em relação à 2a dose. Na coorte de imunodeficiência, foram incluídos 26 pacientes com ICV vacinados com 2 doses de CoronaVac (N=14) ou ChAdOx1 (N=9) e vacinados com 2 CoronaVac + 1 BNT162b2 (N=14). Indivíduos saudáveis vacinados com CoronaVac (N=60) e após reforço com BNT162b2 foram incluídos como controles (N=16). Pacientes ICV vacinados com 2 doses ChAdOx1 apresentaram maiores dos níveis de anticorpo anti-RBD e -S em relação aos vacinados com CoronaVac. Vacinados com ChAdOx1 foram os únicos a produzirem anticorpos neutralizantes contra as linhagens Wuhan, Delta e Gama. A resposta celular foi baixa independentemente da plataforma vacinal. O regime de 3 doses (2 CoronaVac + 1 BNT162b2) induziu resposta imune menor do que 2 doses de ChAdOx1. A resposta vacinal de pacientes ICV foi menor do que a de indivíduos saudáveis. Nossos resultados indicam que idosos se beneficiaram da dose heteróloga de BNT162b2, porém a duração desta resposta deve ser avaliada em estudos longitudinais para garantir o calendário ótimo de doses adicionais para este grupo. Os pacientes ICV tiveram uma melhor resposta ao regime de duas doses de ChAdOx1 em comparação ao de 3 doses, sugerindo que aqueles inicialmente vacinados com CoronaVac podem não estar adequadamente protegidos contra a infecção por SARS-CoV-2 e suas complicações.In this study, our objective was to evaluate the response of vulnerable groups to COVID-19, such as the elderly and patients with Common Variable Immunodeficiency (CVID), who were vaccinated with CoronaVac. In addition to the response to the initial 2-dose regimen, the response to booster vaccination with the mRNA vaccine BNT162b2 was also assessed. Levels of anti-RBD and Spike IgG antibodies against SARS-CoV-2, as well as IFN- and IL-2 levels after antigen-induced cytokine release assay, were determined by ELISA. Neutralization titers were quantified using a cytopathic effect-based neutralization test (CPE-VNT) for both groups. In the elderly cohort, individuals vaccinated with 2 doses of CoronaVac (N=101, of which 54% were above 55 years old) or 2 CoronaVac + 1 BNT162b2 (N=31) were included. Convalescent individuals were recruited as positive controls (N=72), and pre-pandemic samples were included as negative controls (N=36). No difference was observed in the production of IFN- and IL-2 between individuals vaccinated with 2 doses and convalescent individuals. Vaccinated individuals had higher production of anti-RBD IgG antibodies against SARS-CoV-2; however, convalescent individuals exhibited higher titers of neutralizing antibodies. A significant negative correlation was observed between cytokine production and antibody levels, as well as the age of participants. Women and younger men showed higher IL-2 production compared to participants above 55 years old. Men above 55 years old had decreased levels of anti-RBD IgG compared to those below 55 years old. Neutralizing antibody titers were lower in women above 55 compared to younger women. The third dose (BNT162b2) led to a significant increase in the production of specific and neutralizing antibodies. This increase was observed in both individuals above and below 55 years old compared to the second dose. In the immunodeficiency cohort, 26 CVID patients vaccinated with 2 doses of CoronaVac (N=14) or ChAdOx1 (N=9) and 2 CoronaVac + 1 BNT162b2 (N=14) were included. Healthy individuals vaccinated with CoronaVac (N=60) and boosted with BNT162b2 were included as controls (N=16). CVID patients vaccinated with 2 doses of ChAdOx1 showed higher levels of anti-RBD and S antibodies compared to those vaccinated with CoronaVac. Only individuals vaccinated with ChAdOx1 produced neutralizing antibodies against the Wuhan, Delta, and Gamma variants. Cellular response was low regardless of the vaccine platform. The 3-dose regimen (2 CoronaVac + 1 BNT162b2) induced a lower immune response than 2 doses of ChAdOx1. The vaccine response in CVID patients was lower than in healthy individuals. Our results indicate that the elderly benefited from the heterologous dose of BNT162b2; however, the duration of this response should be evaluated in longitudinal studies to ensure the optimal schedule for additional doses in this group. CVID patients had a better response to the two-dose regimen of ChAdOx1 compared to the 3-dose regimen, suggesting that those initially vaccinated with CoronaVac may not be adequately protected against SARS-CoV-2 infection and its complication
Neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern: a study among COVID-19 convalescent, individuals immunized with different COVID-19 vaccines, and monoclonal antibodies
No full textCom o surgimento das variantes de preocupação do SARS-CoV-2, a eficácia dos anticorpos neutralizantes induzidos pela vacinação foi reduzida, assim como a de anticorpos monoclonais (mAbs) neutralizantes. Este estudo avaliou capacidade neutralizante dos anticorpos, após duas doses de CoronaVac, ChAdOx1-S ou BNT162b2 (vacinas baseadas no vírus SARS-CoV-2 Wuhan) administradas no Brasil em 2021, antes do surgimento das variantes Delta e Omicron, com a resposta de convalescentes de COVID-19 no mesmo período, também de quatro anticorpos monoclonais desenvolvidos contra a proteína Spike-Wuhan, em neutralizar as variantes de SARS-CoV-2. O artigo 1 mostra que, embora todas as vacinas tenham gerado respostas robustas de anticorpos contra a proteína Wuhan, a vacina BNT162b2 induziu níveis significativamente maiores de IgG anti-Spike e anti-RBD em comparação com CoronaVac e ChAdOx1-S. Além disso, enquanto todas as vacinas demonstraram alguma capacidade de neutralização cruzada contra as variantes Alpha, Beta, Gamma e Delta, apenas a vacina BNT162b2 foi capaz de neutralizar as subvariantes Omicron BA.2 e BA.4/5, demostrando também uma correlação positiva entre os níveis de IgG-RBD (Wuhan) e neutralização das subvariantes Omicron. O grupo vacinado com BNT162b2 também apresentou uma resposta diferente no padrão de neutralização contra as variantes em comparação aos grupos vacinados com CoronaVac, ChAdOx1-S e convalescentes. O artigo 2 avalia quatro anticorpos monoclonais desenvolvidos em camundongos contra a Spike da cepa Wuhan. Embora cada mAb tenha exibido perfis distintos de reconhecimento e neutralização contra as variantes, apenas o anticorpo 4B1D3 demonstrou reconhecimento e neutralização contra todas as variantes testadas in vitro, além de oferecer proteção a camundongos K18-hACE2 contra um desafio letal com a cepa Wuhan-SARS-CoV-2. Em conjunto, os resultados da eficácia vacinal indicam que a vacina BNT162b2 oferece uma capacidade de neutralização mais ampla contra as variantes de SARS-CoV-2, ressaltando o benefício de reforços com vacinas mRNA bivalentes para aprimorar as respostas imunes contra variantes emergentes. Além disso, os resultados de eficácia dos anticorpos monoclonais sugerem que o anticorpo 4B1D3 representa uma ferramenta promissora com potencial aplicação em pesquisas, ensaios de diagnósticos e intervenções terapêuticas contra as variantes do SARS-CoV-2. Em conjunto, os resultados enfatizam a necessidade de atualizar as estratégias vacinais e desenvolver novas terapias como os anticorpos monoclonais com a sequência genética da variante emergente do vírus, para combater a evasão imune promovida pelas variantes de SARS-CoV-2.The emergence of SARS-CoV-2 variants of concern (VOCs) has reduced antibody effectiveness, impacting both vaccine-induced protection and the efficacy of monoclonal antibodies (mAbs). This study evaluated the efficacy of a two-dose regimen of CoronaVac, ChAdOx1-S, or BNT162b2 (Wuhan-based vaccine) administrated in Brazil in 2021, prior to the emergence of Delta and Omicron variants, and assessed the neutralizing activity of both the vaccine-induced antibodies and four mAbs developed against the Wuhan spike protein to neutralize the SARS-CoV-2 VOCs. Article 1 shows that although all vaccines generated robust antibody responses against the Wuhan strain, the BNT162b2 vaccine elicited significantly higher levels of anti-Spike and anti-RBD IgG compared with CoronaVac and ChAdOx1-S. Moreover, while all vaccines demonstrated some cross-neutralization against Alpha, Beta, Gamma, and Delta, only BNT162b2 effectively neutralized Omicron BA.2 and BA.4/5 subvariants, showing a positive correlation between Wuhan RBD-specific IgG and neutralizing activity against Omicron subvariants. BNT162b2 also demonstrated distinct clustering patterns of neutralizing antibodies against all variants compared to CoronaVac, ChAdOx1-S and convalescent groups. Article 2 shows that regarding the mAbs, all four were developed using hybridoma platform and subsequently characterized. Although each mAb exhibited distinct binding and neutralizing profiles against the variants, the 4B1D3 mAb demonstrated broadspectrum binding and neutralization against all tested SARS-CoV-2 VOCs in vitro and provides protection to K18-hACE2 mice against a lethal challenge with Wuhan-SARS-CoV-2 strain. Taken together, the vaccine efficacy findings indicate that BNT162b2 offers broader neutralization capability against SARS-CoV-2 VOCs, highlighting the benefit of booster shots with bivalent mRNA vaccines to enhance immune responses against emerging variants. In addition, the mAbs efficacy results suggest that the 4B1D3 mAb represents a promising tool with potential application in research, diagnostic assays, and therapeutic interventions against SARS-CoV-2 variants. Collectively, these findings underscore the urgent need to update vaccine strategies and develop novel antibody-based therapeutics to counter immune evasion by emerging SARS-CoV-2 strains
Analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors in heart tissue of chronic Chagas disease cardiomyopathy patients
No full textA Cardiomiopatia Chagásica Crônica (CCC) é uma cardiopatia dilatada inflamatória caracterizada por remodelamento cardíaco, uma miocardite rica em células T e macrófagos, hipertrofia e fibrose. Essa acomete 30% dos pacientes infectados com Trypanossoma cruzi (T. cruzi). Os pacientes com CCC apresentam uma pior sobrevida e prognóstico quando comparados com pacientes portadores de cardiomiopatia de etiologia não inflamatória, como a cardiomiopatia dilatada idiopática (CDI). No processo de remodelamento cardíaco, ocorre uma reestruturação da matriz extracelular (MEC), mediada em grande parte por proteínas como as enzimas proteolíticas, metaloproteinases da matriz (MMPs) e seus inibidores específicos (TIMPs), sendo que a alteração e/ou atividade de algumas dessas enzimas em particular está relacionado com as doenças cardiovasculares. Dentro deste contexto, a hipótese deste trabalho é a de que o perfil da expressão e atividade das MMPs e de seus inibidores TIMPs na CCC será distinto do encontrado na CDI. Foi avaliado por qRT-PCR a expressão gênica e por \"Western blotting\" a expressão proteica das MMPs: -1, -2, -3, -8, -9, -12-13 e EMMPRIN e dos seguintes inibidores TIMPs: -1, -2, -3, -4 e RECK e atividade da MMP-2 e -9 por zimografia, em amostras de miocárdio (ventrículo esquerdo) de pacientes com CCC, pacientes com CDI e doadores de órgãos, obtidos durante o procedimento de transplante. Embora algumas das alterações da expressão das MMPs, TIMPs, e RECK tenham sido compartilhadas com a CDI, observamos que os pacientes com CCC apresentam o aumento da atividade da MMP-2 e MMP-9 e aumento exclusivo da proteína MMP-9. Analisamos através da razão entre a atividade da MMP-2 e MMP-9 com a expressão proteica dos inibidores TIMPs e RECK, observamos o aumento da atividade da MMP-2 e MMP-9 e a diminuição dos TIMPs: -1, -2, -3 e -4 e TIMPs -1, -2 e -3, respectivamente em pacientes com CCC, ocasionando um desequilíbrio entre sua ativação e inibição o que contribui com o remodelamento do miocárdio. Também foi avaliado a fração de colágeno intersticial por Picrosirius Red, observamos que o aumento de colágeno em pacientes com CCC e CDI, o que indica que o aumento da atividade da MMP-2 e MMP-9 está modulando a síntese, conformação e organização do colágeno, contribuindo com a fibrose em pacientes com CCC. Com objetivo de verificar se estas MMPs e seus inibidores estariam sob-regulação pós-transcricional, realizamos análise in silico e identificamos 8 microRNAs (miR): miR-21, miR-29- 5p, miR-146a-5p, miR-155-5p, miR-188-5p, miR-214-3p, miR-491-5p e miR885-5p e analisamos suas expressões por qRT-PCR, mas não observamos correlação com as MMPs e seus inibidores, sugerindo que estas proteínas não estão sob regulação pós-transcricional pelos miRs analisados. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a expressão diferencial de MMPs e seus inibidores TIMPs estudados contribuem com a fibrose, remodelamento do miocárdio e disfunção cardíaca, observado em pacientes com CCC. Desta forma, este trabalho pode ajudar na elucidação dos mecanismos de desenvolvimento da patogênese da doença de ChagasChronic Chagas Cardiomyopathy (CCC) is an inflammatory dilated cardiomyopathy characterized by cardiac remodeling, a myocarditis rich in T cells and macrophages, hypertrophy and fibrosis. This affects 30% of patients infected with Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Patients with CCC have a poorer prognosis and survival when compared with cardiomyopathy patients with non-inflammatory etiology, such as idiopathic dilated cardiomyopathy (IDC). In cardiac remodeling process, there is a restructuring of the extracellular matrix (ECM), largely mediated by proteins such as proteolytic enzymes, matrix metalloproteinases (MMPs) and their specific inhibitors (TIMPs). The alteration and/or activity of some these particular enzymes is associated with cardiovascular disease. Taking this into account, the hypothesis of this study is that the expression profile and activity of MMPs and their TIMPs inhibitors in the CCC will be different from those found in IDC. The gene expression was evaluated by qRT-PCR, the MMP protein expression: -1, -2, -3, -8, -9, -12-13 and EMMPRIN by \"Western blotting\" and the following TIMP inhibitors: -1 , -2, -3, -4 and RECK and MMP-2 and -9 activity by zymography, in myocardial samples (left ventricle) of CCC and IDC patients and organ donors (Control) obtained upon transplantation. Although some of these changes in the expression of MMPs, TIMPs and RECK were shared with the IDC, we observed that patients with CCC have increased MMP-2 and MMP-9 activity and exclusive increase in MMP-9 protein. Through the ratio of MMP-2 and MMP-9 activity with protein expression of TIMPs and RECK inhibitors, we found that the increase in MMP-2 and MMP-9 activity and the decrease in TIMP: -1, -2, -3, and -4 and TIMP -1, -2 and -3, respectively, in myocardial samples of CCC patients causes an imbalance in their activation and inhibition, contributing to the myocardium remodeling. The fraction of interstitial collagen as stained by Picrosirius Red, indicates increase in collagen in patients with CCC and IDC, indicating that the increase of MMP-2 and MMP-9 activity is modulating the synthesis and conformation of collagen organization, contribute to fibrosis in patients with CCC. Aiming to verify whether these MMPs and their inhibitors would be under post-transcriptional regulation, we performed in silico analysis and it was identified 8 microRNAs (miR): miR-21, miR-29-5p, miR-146a-5p, miR-155-5p , miR-188-5p, miR-214-3p, miR-491-5p and miR885-5p, but no correlation was found with the MMPs and their inhibitors, suggesting that these proteins are not under post-transcriptional regulation by miRs analyzed. Together our results suggest that differential expression of MMPs and their TIMPs inhibitors studied contribute to fibrosis, myocardial remodeling and cardiac dysfunction observed in patients with CCC. Thus, this work may help in elucidating the development of mechanisms of the pathogenesis of Chagas diseas
Estudo de polimorfismos nos genes das citocinas TGF-B1, IFN-y, IL-6, IL-10 e TNF-a em indivíduos portadores da infecção pelo vírus da hepatite C
No full textAs citocinas possuem um papel fundamental na regulação da resposta imunológica. Na infecção causada pelo vírus da hepatite C (VHC), os níveis de produção das citocinas podem interferir na progressão da doença, persistência viral e resposta terapêutica. Os genes de citocinas são polimórficos em sítios específicos, e determinados polimorfismos localizados em regiões codificadoras/regulatórias podem alterar a expressão e a secreção das citocinas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a freqüência de alelos polimórficos nos genes do TNF-a, TGF-r31, IL-10, IL-6, e IFN-y em pacientes portadores da infecção crônica causada pelo vírus da hepatite C. Foram avaliados 128 indivíduos, 34 mulheres e 94 homens, com o diagnóstico de infecção pelo vírus da hepatite C baseado em achados laboratoriais. A genotipagem das citocinas foi realizada através da PCR-SSP, utilizando o kit da One Lambda Incorporation Cytokine Genotyping Tray. Foram comparadas as distribuições dos seguintes polimorfismos: TNF-a (-308G/A), TGF-B1 (códon10 T/C, códon 25 G/C), IL-10 (-1082 A/G; -819T/C; -592NC), IL-6 (-174G/C) e IFN-y (+874T/A), entre estes indivíduos infectados pelo VHC e controles sadios doadores de sangue. Foi observada diferença estatisticamente significante na freqüência do polimorfismo do gene do TGF-B1(códon 25) entre os indivíduos sadios e os indivíduos infectados com VHC. Não foi observada significância estatística nas freqüências alélicas e genotípicas dos genes que codificam TNF-a, IFN-y, IL-10, TGF-B1 (códon 10) e IL-6 entre indivíduos infectados com o VHC e controles sadios. Estes achados sugerem uma associação entre o polimorfismo do gene do TGF-B1 (códon 25) e a susceptibilidade para o desenvolvimento da infecção crônica causada pelo VHC. Estudos complementares de indivíduos expostos ao VHC que conseguiram eliminar o vírus e de pacientes portadores do VHC com avaliação do grau de lesão hepática são necessários para determinar o papel do polimorfismo do gene do TGF-B1 (códon 25) na susceptibilidade e no estadiamento/progressão da infecção causada pelo VHC.Cytokines play a key role in the regulation of imnnune responses. In hepatitis C virus infection (HCV), the production of inappropriate cytokine levels appears to contribute to the progression of the disease, viral persistence and affects response to therapy. Cytokine genes are polymorphic at specific sites, and certain polymorphisms located within coding/regulatory regions have been shov\/n to affect the overall expression and secretion of cytokines. The aim of this study was to characterize the frequency of genotypes associated with polymorphisms of TNF-a, TGF-p1, IL-10, IL-6, e IFN-y in patients with chronic hepatitis C virus infection. We enrolled 128 individuals, 34 females and 94 males, infected by hepatitis C virus. Genotyping was carried out by PCR-SSP using the kit One Lambda Incorporation - “Cytokine Genotyping Tray”. We compared the distribution of the following polymorphisms; TNF-a (-308G/A), TGF-f51 (codonlO T/C, codon 25 G/C), IL-10 (- 1082 A/G; -819T/C; -592A/C), IL-6 (-174G/C) and /F/V-^ (+874T/A), between these subjects infected by HCV and a control group of blood donors. We demonstrated a statistically significant difference in the frequency of TGF-pi codon 25 polymorphism between healthy subjects and those infected with HCV. We did not detect any significant differences in the alleles and genotype frequencies of the polymorphisms in the genes that encode TNF-a, IFN-y, IL-10, TGF-(31 codon 10 and IL-6 between these groups. These findings suggest that TGF-/31 codon 25 polymorphism could be associated with susceptibility to chronic HCV infection. Further studies, including HCV exposed individuals who have cleared the virus as a control and patients with moderate/severe hepatitis C, are required to determine the true role of TGF-/31 codon 25 polymorphism in susceptibility and severity/progression of HCV
Identification of HIV-1 protease epitopes target of CD4+ T cell responses in HIV-1 infected patients
No full textIntrodução: Uma proporção significante de pacientes infectados por HIV-1 (pacientes HIV-1+) tratados com inibidores de protease (IPs) desenvolve mutações de resistência. Estudos recentes têm mostrado que células T CD8+ de pacientes HIV- 1+ reconhecem epitopos de Pol incluindo mutações selecionadas por drogas. Nenhum epitopo CD4+ da protease foi descrito na base de dados de Los Alamos. Objetivo: Considerando que a protease de HIV-1 é alvo de terapia antiretroviral e que essa pressão pode selecionar mutações, nós investigamos se mutações selecionadas por IPs afetariam o reconhecimento de epitopos da protease de HIV-1 por células T CD4+ em pacientes tratados com IPs. Nós investigamos o reconhecimento de três regiões da protease preditas de conter epitopos de células T CD4+ bem como mutações induzidas por IPs por células T CD4+ em pacientes HIV- 1+ tratados com IPs. Materiais e Métodos: Quarenta pacientes HIV-1+ tratados com IPs foram incluídos (30 em uso de Lopinavir/ritonavir, 9 em uso de Atazanavir/Ritonavir e 1 em uso exclusivo de Atazanavir). Para cada paciente determinou-se a seqüência endógena da protease de HIV-1, genotipagem viral e tipagem HLA classe II. Utilizamos o algoritmo TEPITOPE para selecionar peptídeos promíscuos, ligadores de múltiplas moléculas HLA-DR, codificando as três regiões da protease de HIV-1 cepa HXB2 (HXB2 4-23, 45-64, e 76-95) e 32 peptídeos adicionais contidos nas mesmas regiões incorporando as mutações induzidas por IPs mais freqüentes no Brasil. Os 35 peptídeos foram sintetizados. Respostas proliferativas de células T CD4+ e CD8+ aos peptídeos foram determinadas por ensaios de proliferação com diluição do corante CFSE. Ensaios de ligação a alelos HLA classe II foram realizados para confirmar a promiscuidade desses peptídeos e avaliar a habilidade de se ligarem a moléculas HLA presentes em cada paciente. Resultados: Todos os peptídeos foram reconhecidos por pelo menos um paciente e respostas proliferativas de células T CD4+ e CD8+ a pelo menos um peptídeo da protease de HIV-1 foram encontradas em 78% e 75% dos pacientes, respectivamente. A terceira região (Protease 76 95) foi a mais freqüentemente reconhecida. Ao compararmos as respostas de células T às seqüências da protease do HIV-1 endógeno, observamos que a maioria dos pacientes não foi capaz de reconhecer peptídeos idênticos às essas seqüências, porém reconheceram peptídeos variantes diferentes das mesmas regiões. Apenas sete pacientes responderam às seqüências endógenas. Verificamos que diversos peptídeos endógenos que não foram reconhecidos apresentaram ausência de ligação a alelos HLA portados por estes pacientes, sugerindo que mutações selecionadas por pressão imune tenham levado ao escape de apresentação de antígeno e evasão de resposta de linfócitos T CD4+. Alternativamente, isso poderia ser explicado pela presença de um vírus replicante distinto presente no plasma uma vez que somente foram obtidas seqüências provirais. Conclusão: Epitopos selvagens e mutantes da protease do HIV-1 reconhecidos por células T CD4+ foram identificados. Também verificamos que a maior parte dos pacientes não reconheceu as seqüências da protease endógena enquanto que reconheceram seqüências variantes. O reconhecimento de seqüências não-endógenas poderia ser hipoteticamente conseqüência de alvo de populações HIV-1 minoritárias; protease de HERV que contém regiões de similaridade com a protease do HIV-1; ou seqüências de HIV-1 presentes apenas em parceiros virêmicos. A falha de reconhecimento de seqüências endógenas seria mais provável devido ao escape imune, do que ao nível de apresentação ou reconhecimento por células T. Isso implica em uma conseqüência patofisiológica na evasão de respostas de células T contra a protease de HIV-1 e no fato de ser tradicionalmente considerada uma proteína pouco antigênicaIntroduction: A significant proportion of protease inhibitor (PI)-treated HIV-1 infected (HIV-1+) patients develop resistance mutations. Recent studies have shown that CD8+ T cells from HIV-1 patients can recognize antiretroviral drug-induced mutant Pol epitopes. No HIV-1 protease CD4 epitopes are described in the Los Alamos database. Aims: Given that the protease of HIV-1 is a target of antiretroviral therapy and this pressure may lead to the selection of mutations, we investigated whether PI-induced mutations affect the recognition of HIV-1 protease epitopes by CD4 + T cells in PI-treated patients. We investigated the recognition of three protease regions predicted to harbor CD4+ T cell epitopes as well as PI-induced mutations by CD4+ T cells of PI-treated HIV-1+ patients. Methods: Forty PI-treated HIV-1+ patients were included (30 undergoing Lopinavir/ritonavir, 9 undergoing Atazanavir/ritonavir and 1 undergoing exclusively Atazanavir treatment). For each patients, the endogenous HIV-1 protease sequence, viral genotype and HLA class II typing were determined. We used the TEPITOPE algorithm to select promiscuous, multiple HLA-DR-binding peptides encoding 3 regions of HIV-1 HXB2 strain protease (HXB2 4-23, 45-64, and 76-95) and 32 additional peptides contained in the same regions, but encompassing the most frequent PI-induced mutations in Brazil. The 35 peptides were thus synthesized. Proliferative responses of CD4+ and CD8+ T cells against peptides were determined by the CFSE dilution assay. HLA class II binding assays were made to confirm the promiscuity of these peptides and evaluate their ability to bind the HLA molecules carried by each patient. Results: All tested peptides were recognized by at least one patient and proliferative responses of CD4+ and CD8+ T cells against at least one HIV-1 protease peptide were found in 78% and 75% patients, respectively. The third region (Protease 76-95) was the most frequently recognized. By comparing T-cell responses to HIV-1 endogenous protease sequences, we found that most patients failed to recognize identical peptides of those sequences, but recognized different variant peptides of the same region. Only seven patients responded to endogenous sequences. We found that several endogenous peptides that failed to be recognized showed no binding to the HLA alleles carried by that given patient, suggesting that mutations selected by immune pressure have led to escape of antigen presentation, as well as direct escape of the CD4+ T cell response. Alternatively, it could have been due to the presence of a different replicating virus in the plasma-since we only obtained proviral sequences. Conclusion: Wild-type and mutant HIV-1 protease epitopes recognized by CD4+ T cells were identified. We also found that most patients failed to recognize their endogenous protease sequences, while they recognized variant sequences. The recognition of non-endogenous sequences could hypothetically be a consequence of targeting a minor HIV-1 population; HERV protease, that contains regions of similarity with HIV-1 protease; or HIV-1 sequences present only in viremic partners. The failure to recognize endogenous sequences is most likely due to immune escape, either at the level of presentation or direct T cell recognition. This may have a pathophysiological consequence on evasion of T cell responses against protease and the fact that it has been considered traditionally a poorly antigenic HIV-1 protein
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