1,721,008 research outputs found
Mitotic and pheromone-specific intrinsic polarization cues interfere with gradient sensing in Saccharomyces cerevisiae
Full text linkPolarity decisions are central to many processes, including mitosis and chemotropism. In Saccharomyces cerevisiae, budding and mating projection (MP) formation use an overlapping system of cortical landmarks that converges on the small G protein Cdc42. However, pheromone-gradient sensing must override the Rsr1-dependent internal polarity cues used for budding. Using this model system, we asked what happens when intrinsic and extrinsic spatial cues are not aligned. Is there competition, or collaboration? By live-cell microscopy and microfluidics techniques, we uncovered three previously overlooked features of this signaling system. First, the cytokinesisassociated polarization patch serves as a polarity landmark independently of all known cues. Second, the Rax1-Rax2 complex functions as a pheromone-promoted polarity cue in the distal pole of the cells. Third, internal cues remain active during pheromone-gradient tracking and can interfere with this process, biasing the location of MPs. Yeast defective in internal-cue utilization align significantly better than wild type with artificially generated pheromone gradients.Fil: Vasen, Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular; ArgentinaFil: Dunayevich, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin
Push-Pull and Feedback Mechanisms Can Align Signaling System Outputs with Inputs
Full text linkMany cell signaling systems, including the yeast pheromone response system, exhibit “dose-response alignment” (DoRA), in which output of one or more downstream steps closely matches the fraction of occupied receptors. DoRA can improve the fidelity of transmitted dose information. Here, we searched systematically for biochemical network topologies that produced DoRA. Most networks, including many containing feedback and feedforward loops, could not produce DoRA. However, networks including “push-pull” mechanisms, in which the active form of a signaling species stimulates downstream activity and the nominally inactive form reduces downstream activity, enabled perfect DoRA. Networks containing feedbacks enabled DoRA, but only if they also compared feedback to input and adjusted output to match. Our results establish push-pull as a non-feedback mechanism to align output with variable input and maximize information transfer in signaling systems. They also suggest genetic approaches to determine whether particular signaling systems use feedback or push-pull control.Fil: Andrews, Steven S.. Fred Hutchinson Cancer Research Center; Estados Unidos. The Molecular Sciences Institute; Estados UnidosFil: Peria, William J.. Fred Hutchinson Cancer Research Center; Estados UnidosFil: Yu, Richard C.. The Molecular Sciences Institute; Estados UnidosFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Brent, Roger. The Molecular Sciences Institute; Estados Unidos. Fred Hutchinson Cancer Research Center; Estados Unido
Procesamiento de información extracelular por sistemas de transducción de señales: determinación de concentración absoluta y dirección de gradientes de feromona sexual en Saccharomyces cerevisiae
Full text linkLas vías de señalización celulares son las encargadas de transmitir la información sobre el estado del ambiente intra y extracelular. En el sistema de respuesta a feromona sexual (SRF), las células de levadura Saccharomyces cerevisiae convierten señales externas en medidas cuantitativas para tomar decisiones sobre su destino. Para aparearse, las levaduras deben evaluar la proximidad y la dirección de la compañera. Para ello, se comunican mediante la secreción y detección de feromonas sexuales. La concentración externa de feromona codifica la cercanía entre las células: sólo a altas concentraciones de la señal se produce el arresto del ciclo celular y la activación del programa de apareamiento. En el tipo sexual ?a? la molécula que sensa la feromona es un receptor acoplado a proteína G, Ste2. Una característica notable de este sistema es que, a pesar de existir una elevada variabilidad en la cantidad de receptor en las distintas células, la respuesta de la población es uniforme. Resultados previos de nuestro laboratorio, basados en modelado matemático, indicaban que el SRF era capaz de medir la fracción de receptor ocupado en lugar de la cantidad total de complejo ligando-receptor y, así, responder de forma independiente al número de receptores Esta propiedad radica en que el receptor presenta actividades antagónicas: cuando está ocupado activa la respuesta mientras que cuando está desocupado la inhibe. En esta tesis, se demuestra que la medición fraccional depende la unión al receptor de una proteína inhibitoria (Sst2). Mutantes en que esta asociación se encuentra bloqueada pierden tanto la medición fraccional como la robustez al cambio en la cantidad de receptores.Por otro lado, dado que las levaduras son sésiles, la detección de la concentración externa de feromona no es suficiente para lograr el apareamiento: las células deben crecer en dirección a su compañera. En la determinación de la dirección del gradiente, el receptor unido a ligando recluta a la maquinaria de polarización para dirigir el crecimiento celular hacia la fuente de feromona. Sin embargo, esta maquinaria es compartida con el proceso de gemación que polariza utilizando marcas internas. Para estudiar la competencia entre el gradiente de feromona y estas marcas internas, se expuso a células a gradientes artificiales generados mediante microfluídica. Los resultados revelaron una compleja interacción entre las marcas internas y el gradiente externo donde algunas proteínas de posicionamiento orientan la polarización de forma dependiente de feromona (Rax1/2, Rsr1) y otras de forma independiente de la señal (Bud8, Bud9, Axl2). Se pudo comprobar que estas marcas interfieren con la detección de la dirección del gradiente.En conclusión, en esta tesis se describen dos aspectos fundamentales del procesamiento de la información extracelular: la medición fraccional de la concentración externa de una señal y su competencia con información proveniente del medio interno a la hora de polarizar en la dirección de un gradiente. Ambos aspectos resultan claves para comprender el proceso de apareamiento celular.Fil: Vasen, Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin
Extracellular information processing by signal transduction systems: absolute concentration determination and gradient sensing of mating pheromone in Saccharomyces cerevisiae
Full text linkLas vías de señalización celulares son las encargadas de transmitir la información sobre el estado del ambiente intra y extracelular. En el sistema de respuesta a feromona sexual (SRF), las células de levadura Saccharomyces cerevisiae convierten señales externas en medidas cuantitativas para tomar decisiones sobre su destino. Para aparearse, las levaduras deben evaluar la proximidad y la dirección de la compañera. Para ello, se comunican mediante la secreción y detección de feromonas sexuales. La concentración externa de feromona codifica la cercanía entre las células: sólo a altas concentraciones de la señal se produce el arresto del ciclo celular y la activación del programa de apareamiento. En el tipo sexual “a” la molécula que sensa la feromona es un receptor acoplado a proteína G, Ste2. Una característica notable de este sistema es que, a pesar de existir una elevada variabilidad en la cantidad de receptor en las distintas células, la respuesta de la población es uniforme. Resultados previos de nuestro laboratorio, basados en modelado matemático, indicaban que el SRF era capaz de medir la fracción de receptor ocupado en lugar de la cantidad total de complejo ligando-receptor y, así, responder de forma independiente al número de receptores Esta propiedad radica en que el receptor presenta actividades antagónicas: cuando está ocupado activa la respuesta mientras que cuando está desocupado la inhibe. En esta tesis, se demuestra que la medición fraccional depende la unión al receptor de una proteína inhibitoria (Sst2). Mutantes en que esta asociación se encuentra bloqueada pierden tanto la medición fraccional como la robustez al cambio en la cantidad de receptores. Por otro lado, dado que las levaduras son sésiles, la detección de la concentración externa de feromona no es suficiente para lograr el apareamiento: las células deben crecer en dirección a su compañera. En la determinación de la dirección del gradiente, el receptor unido a ligando recluta a la maquinaria de polarización para dirigir el crecimiento celular hacia la fuente de feromona. Sin embargo, esta maquinaria es compartida con el proceso de gemación que polariza utilizando marcas internas. Para estudiar la competencia entre el gradiente de feromona y estas marcas internas, se expuso a células a gradientes artificiales generados mediante microfluídica. Los resultados revelaron una compleja interacción entre las marcas internas y el gradiente externo donde algunas proteínas de posicionamiento orientan la polarización de forma dependiente de feromona (Rax1/2, Rsr1) y otras de forma independiente de la señal (Bud8, Bud9, Axl2). Se pudo comprobar que estas marcas interfieren con la detección de la dirección del gradiente. En conclusión, en esta tesis se describen dos aspectos fundamentales del procesamiento de la información extracelular: la medición fraccional de la concentración externa de una señal y su competencia con información proveniente del medio interno a la hora de polarizar en la dirección de un gradiente. Ambos aspectos resultan claves para comprender el proceso de apareamiento celular.Information about the external world is sensed and transmitted through cell signaling systems. In the pheromone response, Saccharomyces cerevisiae cells convert extracellular signals into quantitative measurements for cellular fate decisions. To achieve mating, yeast cells of opposite mating types must evaluate the proximity and the direction of the mating partner. Cells communicate by secreting and detecting sexual pheromones. External signal concentration codes the distance between cells in a way that only high concentrations of pheromone arrest the cell cycle and promotes mating. In MATa sexual type, Ste2, a G-protein coupled receptor, is the receptor that binds and senses pheromone. A notable feature of this system is that, in spite of the cell-to-cell variability in the expression of Ste2, the population of cells respond uniformly. This observation required mechanisms that could account for this receptor number independent behavior. Previous results from our group, based on mathematical modeling, indicated that the system was able the measure the fraction of ligand occupied receptors instead of the total number of ligand-receptor complexes. This property emerged from the antagonistic activities of the receptor: when occupied it activates signaling but, when unoccupied, it inactivates it. In this thesis, we demonstrated that this ability relies on the interaction between the receptor and an inhibitory protein (Sst2). Mutants in which this interaction is blocked showed both impaired fractional measurement as well as no robustness to changes in receptor abundance. On the other hand, given that yeast cells are sessile, concentration determination of pheromone is not enough to achieve mating: cells must grow in the direction of its partner. In gradient sensing, occupied receptors recruit the polarization machinery towards the source of pheromone. However, this machinery is shared with budding which polarizes using internal cues placed in the poles of the cell. To study the competence between the pheromone gradient and the internal landmarks, a microfluidic system was set up for the generation of stable pheromone gradients. Results revealed a complex interaction between these signals. Some positioning proteins oriented the polarization in a pheromone dependent way (Rax1/2, Rsr1) whereas others were signal independent (Bud8, Bud9, Axl2). When subjected to gradients, these landmarks interfered with gradient sensing. In summary, in this thesis we described two fundamental aspects of external information processing: fractional measurement of extracellular signal concentration and its competition with information from the internal cellular media for polarizing. Both behaviors are key to understand yeast mating.Fil: Vasen, Gustavo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Cell fate decision mechanism in yeast S. cerevisiae: mating pheromone response pathway and its interaction with the cell cycle machinery
No full textLas vías de señalización celulares son las encargadas de transmitir la información sobreel estado del ambiente intra e extracelular. Con esta información, las células "tomandecisiones" que afectan su destino, tales como dividirse, arrestarse, diferenciarse, o morir. A su vez, es común que células genéticamente idénticas, expuestas al mismo ambientetomen decisiones diferentes. Así, el objetivo general de mi tesis doctoral es, mediante unenfoque de Biología de Sistemas, estudiar los mecanismos moleculares que median estastomas de decisión de destino celular y el origen de la variabilidad observada en esa tomade decisión. Para esto, utilizamos a la respuestas a la feromona sexual de la levadura S.cerevisiae como sistema modelo. Los destinos celulares pueden ser clasificados en distintos fenotipos morfológicos, quedependen de la dosis del estímulo. Sin embargo, encontramos que dichos fenotipos coexistenen concentraciones de feromona intermedia, mostrando así una gran variabilidaden la población. Las causas de esta variabilidad son múltiples y actúan simultáneamente:influye la posición del ciclo celular, el tipo celular (madre o hija), la capacidad de lascélulas de sintetizar más o menos proteínas en general, y su "historia". Seguidamente, nosenfocamos en un fenotipo complejo observado a concentraciones intermedias de feromona:primero se arresta el ciclo celular y se desarrolla una proyección de apareamiento, paraluego reentrar en el ciclo celular. Descubrimos que esta desensibilización está mediadapor una rama estimulatoria del ciclo celular (paralela a la clásica inhibitoria) que se activatardíamente y depende del factor de transcripción Kar4. Asimismo estudiamos lasconsecuencias que el desarrollo de este fenotipo tiene sobre la progenie. Utilizamos paraesto experimentos genéticos combinando con microscopía de epifluorescencia y confocal,modelado matemático.Signal transduction pathways register and transmit information about the intra- andextracellular environment. Using this information, cells "make decisions" that affect theirfate, leading to division, cell cycle arrest, differentiation or death. At the same time, it iscommonly found that genetically identical cells, exposed to the same conditions, behavedifferently. Therefore, the general goal of my thesis is to study the molecular mechanismsthat govern a cell-fate decision system, and the origin of the observed cell-to-cell variability. For this studies, we used the pheromone response pathway in yeast S. cerevisiae as a modelsystem. Cell fates may be classified in different morphological phenotypes, which depend on theconcentration of the stimulus. However, we found that at intermediate doses of pheromone,some of the phenotypes coexist, generating a large population variability. We found severalcauses of this variability, which act simultaneously: cell cycle position, cell type (mother ordaughter cell), the ability of cells to express genes into proteins, and the cell history. Subsequently,we focused our efforts in exploring a particular phenotype/behavior that occursat intermediate doses of pheromone: first, cells arrest the cell cycle and grow a matingprojection, and then, cells reenter into the cell cycle. We found that this desensitization ismediated by a pathway branch that stimulates the cell cycle (opperating in parallel withthe classic inhibitory branch) and that it requires the transcription factor Kar4. We thenstudied the consequences of this behavior on the progeny. We used genetic experimentscombining fluorescence and confocal microscopy with mathematical modeling.Fil: Grande, Alicia Viviana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Cell fate decision mechanism in yeast S. cerevisiae: mating pheromone response pathway and its interaction with the cell cycle machinery
Full text linkLas vías de señalización celulares son las encargadas de transmitir la información sobreel estado del ambiente intra e extracelular. Con esta información, las células "tomandecisiones" que afectan su destino, tales como dividirse, arrestarse, diferenciarse, o morir. A su vez, es común que células genéticamente idénticas, expuestas al mismo ambientetomen decisiones diferentes. Así, el objetivo general de mi tesis doctoral es, mediante unenfoque de Biología de Sistemas, estudiar los mecanismos moleculares que median estastomas de decisión de destino celular y el origen de la variabilidad observada en esa tomade decisión. Para esto, utilizamos a la respuestas a la feromona sexual de la levadura S.cerevisiae como sistema modelo. Los destinos celulares pueden ser clasificados en distintos fenotipos morfológicos, quedependen de la dosis del estímulo. Sin embargo, encontramos que dichos fenotipos coexistenen concentraciones de feromona intermedia, mostrando así una gran variabilidaden la población. Las causas de esta variabilidad son múltiples y actúan simultáneamente:influye la posición del ciclo celular, el tipo celular (madre o hija), la capacidad de lascélulas de sintetizar más o menos proteínas en general, y su "historia". Seguidamente, nosenfocamos en un fenotipo complejo observado a concentraciones intermedias de feromona:primero se arresta el ciclo celular y se desarrolla una proyección de apareamiento, paraluego reentrar en el ciclo celular. Descubrimos que esta desensibilización está mediadapor una rama estimulatoria del ciclo celular (paralela a la clásica inhibitoria) que se activatardíamente y depende del factor de transcripción Kar4. Asimismo estudiamos lasconsecuencias que el desarrollo de este fenotipo tiene sobre la progenie. Utilizamos paraesto experimentos genéticos combinando con microscopía de epifluorescencia y confocal,modelado matemático.Signal transduction pathways register and transmit information about the intra- andextracellular environment. Using this information, cells "make decisions" that affect theirfate, leading to division, cell cycle arrest, differentiation or death. At the same time, it iscommonly found that genetically identical cells, exposed to the same conditions, behavedifferently. Therefore, the general goal of my thesis is to study the molecular mechanismsthat govern a cell-fate decision system, and the origin of the observed cell-to-cell variability. For this studies, we used the pheromone response pathway in yeast S. cerevisiae as a modelsystem. Cell fates may be classified in different morphological phenotypes, which depend on theconcentration of the stimulus. However, we found that at intermediate doses of pheromone,some of the phenotypes coexist, generating a large population variability. We found severalcauses of this variability, which act simultaneously: cell cycle position, cell type (mother ordaughter cell), the ability of cells to express genes into proteins, and the cell history. Subsequently,we focused our efforts in exploring a particular phenotype/behavior that occursat intermediate doses of pheromone: first, cells arrest the cell cycle and grow a matingprojection, and then, cells reenter into the cell cycle. We found that this desensitization ismediated by a pathway branch that stimulates the cell cycle (opperating in parallel withthe classic inhibitory branch) and that it requires the transcription factor Kar4. We thenstudied the consequences of this behavior on the progeny. We used genetic experimentscombining fluorescence and confocal microscopy with mathematical modeling.Fil: Grande, Alicia Viviana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Integrative study of MAPK signaling pathways in Saccharomyces cerevisiae
Full text linkEl objetivo principal de esta tesis fue estudiar la interacción entre las vías de MAP quinasas de Saccharomyces cerevisiae. Estas vías están representadas en humanos, donde su mal funcionamiento puede conducir a patologías tales como cáncer o problemas en el desarrollo. La complejidad de los circuitos de señalización de MAP quinasas en células de mamíferos dificulta la comprensión de como estas integran las señales que los activan. Para resolver este problema, una estrategia es analizar sistemas biológicos más simples que comparten propiedades con los más complejos. En este sentido, nos propusimos caracterizar exhaustivamente sistemas de señalización de MAP quinasas en un sistema biológico simple, la levadura S. cerevisiae. En esta tesis decidimos determinar los puntos de flujo de información entre las vías de "Respuesta a Shock Hiperosmótico" (HOG) y de "Respuesta a Feromona" (PR) de levaduras, ya que estas vías comparten componentes en sus vías de señalización y existe controversia sobre sus interacciones. A su vez, estudiamos estas vías en células individuales, estimulando las mismas controlando la dosis de los estímulos utilizados y en una variada serie de condiciones experimentales. Finalmente, medimos las respuestas de estas vías de un modo cuantitativo, estudiando su dinámica temporal y analizando el mayor número de respuestas posible en cada célula. Resumiendo los resultados obtenidos, podemos decir, que la vía de HOG no presenta osmoadaptación perfecta como se había afirmado previamente y permanece activa en estado estacionario. Su activación es mayor cuanto mayor es la osmolaridad externa, y también depende del gradiente químico de glicerol. Además, vemos una alta variabilidad de la respuesta de HOG en células individuales. A nivel de las interacciones entre las vías de MAP quinasas, determinamos que la vía PR es capaz de activar a la vía HOG en células adaptadas a alta osmolaridad. Esta compleja activación requiere de la MAPK de la vía de integridad de la pared celular (CWI) Slt2/Mpk1 y del polarisoma. La activación de HOG es pulsátil y presenta una alta variabilidad en células individuales. Los picos de actividad de HOG coinciden con eventos morfogenéticos inducidos por PR en los cuales se activa Slt2/Mpk1. La vía PR induce una salida de glicerol, que estaría mediada por Slt2/Mpk1, y este sería el mecanismo que llevaría a la activación de la vía HOG. La inducción de HOG también puede lograrse a través de la activación de Slt2/Mpk1 mediante shock térmico. Ambos tipos de activaciones (por feromona o alta temperatura) son proporcionales a la osmolaridad externa y dependen del gradiente químico de glicerol. Una consecuencia fisiológica de esta activación de HOG promovida por la vía PR es que las células en estas condiciones presentan una mejor capacidad de osmoadaptación. Finalmente, podemos agregar que los shocks hiperosmóticos inhiben a la vía PR durante la etapa de respuesta aguda, pero no hemos establecido aún los actores moleculares que median esta inhibición. Sin embargo, podemos descartar algunos componentes de la vía de HOG como Sho1, Ssk1 y Hog1. Para terminar, la alta osmolaridad, a largo plazo, en células ya adaptadas, cambia la dinámica de la respuesta de la vía PR reduciendo su sensibilidad a α factor. Esta reducción es proporcional a la osmolaridad externa. Esperamos que los resultados encontrados en este sistema biológico sean de utilidad, para pensar de una manera más integrativa, como se comporta la dinámica de la respuesta en un dado sistema frente a múltiples señales externas, de acuerdo a como el mismo las integra globalmente.The main objective of this thesis was to study the interaction between MAPK signaling pathways in Saccharomyces cerevisiae. These pathways are represented in humans, were the malfunction of them can lead to pathologies such as cancer or developmental problems. The complexity of MAPK signaling circuits in mammalian cells difficult the understanding of how they integrate the signals activating them. As a means to solve this problem, one strategy is to analyze simpler biological systems that share properties with the more complex ones. In these sense, we ought to characterize thoroughly MAPK signaling pathways in a simple biological system, the yeast S. cerevisiae. In this thesis we decided to determine the points of information flow between the yeast "High Osmolarity" (HOG) and the "Pheromone Response" (PR) pathways, because they share components in their signaling cascades and there is controversy in how they interact. In addition to these, we studied these pathways in individual cells, stimulating them by controlling the stimulus doses and under a several experimental conditions. Finally, we measured the output of these pathways in a quantitative way, studying their temporal dynamics and analyzing the most number of possible readouts. Summing up the results obtained, we can say that, the HOG pathway does not present perfect adaptation as it was previously stated and it remains active in steady state. Its activation is higher the higher the external osmolarity and it also depends on the chemical gradient of glycerol. Besides, we see high variability in the HOG output of individual cells. At the level of interactions between the MAPK pathways, we determined that the PR pathway can activate the HOG pathway in cells adapted to high osmolarity. This complex activation requires the Cell Wall Integrity (CWI) MAPK Slt2/Mpk1 and the polarisome. This HOG activation occurs in pulses and presents high variability in single cells. The peaks of HOG activity coincide with PR induced morphogenetical events where Slt2/Mpk1 is activated. The PR pathway induces a glycerol efflux, which would be controlled by Slt2/Mpk1, and that would be the mechanism leading to HOG pathway activation. HOG induction can also be achieved through Slt2/Mpk1 heat shock activation. Both kinds of activations (by pheromone or high temperature) are proportional to the external osmolarity and depend on the glycerol chemical gradient. One physiological consequence of these PR promoted HOG activation is that the cells present a better osmoadaptation capacity in these conditions. Finally, we can add that hyperosmotic shocks inhibit PR pathway during the acute hyperosmotic phase, but we have not established yet the molecular actors that mediate this inhibition. However, we can rule out some of HOG pathway components like, Sho1, Ssk1 and Hog1. To finish, high osmolarity, at longer times in cells already adapted, changes the dynamics of PR response reducing its sensitivity to α factor. This reduction is proportional to the external osmolarity. We hope the results found in this biological system are helpful, to think in a more integrative way, how the output dynamics of a system behaves, facing multiple external signals, depending on how it integrates them globally.Fil:Baltanás, Rodrigo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Extracellular information processing by signal transduction systems: absolute concentration determination and gradient sensing of mating pheromone in Saccharomyces cerevisiae
No full textLas vías de señalización celulares son las encargadas de transmitir la información sobre el estado del ambiente intra y extracelular. En el sistema de respuesta a feromona sexual (SRF), las células de levadura Saccharomyces cerevisiae convierten señales externas en medidas cuantitativas para tomar decisiones sobre su destino. Para aparearse, las levaduras deben evaluar la proximidad y la dirección de la compañera. Para ello, se comunican mediante la secreción y detección de feromonas sexuales. La concentración externa de feromona codifica la cercanía entre las células: sólo a altas concentraciones de la señal se produce el arresto del ciclo celular y la activación del programa de apareamiento. En el tipo sexual “a” la molécula que sensa la feromona es un receptor acoplado a proteína G, Ste2. Una característica notable de este sistema es que, a pesar de existir una elevada variabilidad en la cantidad de receptor en las distintas células, la respuesta de la población es uniforme. Resultados previos de nuestro laboratorio, basados en modelado matemático, indicaban que el SRF era capaz de medir la fracción de receptor ocupado en lugar de la cantidad total de complejo ligando-receptor y, así, responder de forma independiente al número de receptores Esta propiedad radica en que el receptor presenta actividades antagónicas: cuando está ocupado activa la respuesta mientras que cuando está desocupado la inhibe. En esta tesis, se demuestra que la medición fraccional depende la unión al receptor de una proteína inhibitoria (Sst2). Mutantes en que esta asociación se encuentra bloqueada pierden tanto la medición fraccional como la robustez al cambio en la cantidad de receptores. Por otro lado, dado que las levaduras son sésiles, la detección de la concentración externa de feromona no es suficiente para lograr el apareamiento: las células deben crecer en dirección a su compañera. En la determinación de la dirección del gradiente, el receptor unido a ligando recluta a la maquinaria de polarización para dirigir el crecimiento celular hacia la fuente de feromona. Sin embargo, esta maquinaria es compartida con el proceso de gemación que polariza utilizando marcas internas. Para estudiar la competencia entre el gradiente de feromona y estas marcas internas, se expuso a células a gradientes artificiales generados mediante microfluídica. Los resultados revelaron una compleja interacción entre las marcas internas y el gradiente externo donde algunas proteínas de posicionamiento orientan la polarización de forma dependiente de feromona (Rax1/2, Rsr1) y otras de forma independiente de la señal (Bud8, Bud9, Axl2). Se pudo comprobar que estas marcas interfieren con la detección de la dirección del gradiente. En conclusión, en esta tesis se describen dos aspectos fundamentales del procesamiento de la información extracelular: la medición fraccional de la concentración externa de una señal y su competencia con información proveniente del medio interno a la hora de polarizar en la dirección de un gradiente. Ambos aspectos resultan claves para comprender el proceso de apareamiento celular.Information about the external world is sensed and transmitted through cell signaling systems. In the pheromone response, Saccharomyces cerevisiae cells convert extracellular signals into quantitative measurements for cellular fate decisions. To achieve mating, yeast cells of opposite mating types must evaluate the proximity and the direction of the mating partner. Cells communicate by secreting and detecting sexual pheromones. External signal concentration codes the distance between cells in a way that only high concentrations of pheromone arrest the cell cycle and promotes mating. In MATa sexual type, Ste2, a G-protein coupled receptor, is the receptor that binds and senses pheromone. A notable feature of this system is that, in spite of the cell-to-cell variability in the expression of Ste2, the population of cells respond uniformly. This observation required mechanisms that could account for this receptor number independent behavior. Previous results from our group, based on mathematical modeling, indicated that the system was able the measure the fraction of ligand occupied receptors instead of the total number of ligand-receptor complexes. This property emerged from the antagonistic activities of the receptor: when occupied it activates signaling but, when unoccupied, it inactivates it. In this thesis, we demonstrated that this ability relies on the interaction between the receptor and an inhibitory protein (Sst2). Mutants in which this interaction is blocked showed both impaired fractional measurement as well as no robustness to changes in receptor abundance. On the other hand, given that yeast cells are sessile, concentration determination of pheromone is not enough to achieve mating: cells must grow in the direction of its partner. In gradient sensing, occupied receptors recruit the polarization machinery towards the source of pheromone. However, this machinery is shared with budding which polarizes using internal cues placed in the poles of the cell. To study the competence between the pheromone gradient and the internal landmarks, a microfluidic system was set up for the generation of stable pheromone gradients. Results revealed a complex interaction between these signals. Some positioning proteins oriented the polarization in a pheromone dependent way (Rax1/2, Rsr1) whereas others were signal independent (Bud8, Bud9, Axl2). When subjected to gradients, these landmarks interfered with gradient sensing. In summary, in this thesis we described two fundamental aspects of external information processing: fractional measurement of extracellular signal concentration and its competition with information from the internal cellular media for polarizing. Both behaviors are key to understand yeast mating.Fil: Vasen, Gustavo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Robustness and sensitivity in the pheromone response of Saccharomyces Cerevisiae
Full text linkLas células deben sensar y responder a cambios en su ambiente para poder sobrevivir, reproducirse y desempeñar sus funciones fisiológicas. En particular, las células eucariotas usan muchos y variados mecanismos a en de transducir señales del exterior al interior de la célula. Uno muy importante es el que involucra a receptores acoplados a proteínas G heterotriméricas. Estos receptores de siete pasos de membrana, al ser ocupados por sus ligandos, catalizan el intercambio de GDP por GTP en la subunidad Gα de la proteína G asociada, lo que causa la disociación de la proteína G heterotrimérica en Gα y Gβγ. La respuesta a feromona sexual de levaduras es un sistema prototípico de este tipo de mecanismos, muy estudiado bioquímica y genéticamente. En esta vía de transducción de señales, la proteína de andamiaje Ste5 se une a Gβγ libre, lo que causa su reclutamiento a membrana y la activación de una cascada de MAP kinasas, resultando en arresto del ciclo celular y cambios en el patrón de expresión génica. Las curvas dosis-respuesta (DoR) a feromona medidas en distintos puntos de la vía de transducción, como ocupación del receptor, fosforilación de la MAPK del sistema o inducción transcripcional, muestran una sensibilidad muy similar, un fenómeno al que llamamos alineamiento de las curvas dosis-respuesta (DoRA). En esta tesis estudiamos de manera cuantitativa los primeros pasos en la activación de la respuesta a feromona en levaduras; la ocupación del receptor, la activación de la proteína G heterotrimérica y el reclutamiento a membrana de Ste5. Encontramos que el sistema es notablemente robusto a variaciones en la cantidad de receptores, algo que no es fácilmente explicable por la teoría clásica de receptores. Estudiamos el mecanismo responsable de esta robustez, cuyo punto de acción pudimos mapear río arriba del reclutamiento de Ste5. Construimos un modelo matemático completo de la interacción entre el receptor y la proteína G: el modelo Carrousel. El análisis del mismo nos sugirió un mecanismo por el cuál el sistema puede medir la fracción de receptores ocupados en lugar de la cantidad de los mismos, lo que además explica el fenómeno de DoRA. Este mecanismo depende de la interacción fósica reportada entre la proteína RGS (reguladora de la señalización por proteína G, que inactiva al sistema) y el receptor (que lo activa). Pudimos probar que cepas mutantes en las que esta interacción no está presente, no muestran robustez a la cantidad de receptores. Por otro lado medimos curvas DoR del cambio de localización de Ste5 en células con cantidades variables de Ste5. En base a esta información pudimos estimar la afinidad entre esta proteína de andamiaje y sus sitios de unión a membrana en células vivas, y cómo esta afinidad se modula durante la respuesta. Además, estudiamos el efecto de cambios en la abundancia de Ste5 sobre la respuesta, encontrando que la cantidad de esta proteína es un parámetro crítico del sistema.Cells need to respond to changes in their environment to be able to survive and proliferate. Here, we study in a quantitative manner the pheromone response pathway in Saccharomyces cerevisiae, a canonical GPCR signal transduction system. Upon activation of the pathway, occupied receptors increase the exchange rate of GDP for GTP in the Gα subunit of the heterotrimeric G protein. This causes the dissociation of the G protein, liberating free Gβγ, which in turn recruits to the membrane the scaffold protein Ste5, activating the MAP kinase cascade and downstream effectors. Dose-response (DoR) curves measured at different activation steps of this pathway show very similar sensitivity, a phenomena we call dose-response alignment (DoRA). In this thesis we study the first activation steps of the pheromone response; receptor occupation by ligand, activation of the G protein and recruitment of Ste5. We found the system to be notoriously robust to changes in the levels of the receptors, something not easily explained by classical receptor theory. We mapped the mechanism responsible for this robustness upstream of Ste5 membrane recruitment. Therefore, we built a complete mathematical model of the G protein activation process: the Carrousel model. This model suggested that the system responds to the fraction of occupied receptor and not to the absolute amount of ligand-receptor complexes. As predicted by the model, this mechanism requires the reported physical interaction between the RGS of the system and the receptor, since disruption of this interaction abolishes robustness to receptor abundance. We also determined the affinity with which Ste5 binds to free Gβγ, causing its membrane recruitment. We determined this in live cells, and studied the way in which the affinity is modulated during the response. Furthermore, we studied the effect of changes in the abundance of Ste5, finding that the expression level of this protein is critical for a normal sensitivity of the response.Fil:Bush, Alan. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
GPCR receptor phosphorylation and endocytosis are not necessary to switch polarized growth between internal cues during pheromone response in S. cerevisiae
Full text linkChemotactic/chemotropic cells follow accurately the direction of gradients of regulatory molecules. Many G-protein-coupled receptors (GPCR) function as chemoattractant receptors to guide polarized responses. In “a” mating type yeast, the GPCR Ste2 senses the α-cell’s pheromone. Previously, phosphorylation and trafficking of this receptor have been implicated in the process of gradient sensing, where cells dynamically correct growth. Correction is often necessary since yeast have intrinsic polarity sites that interfere with a correct initial gradient decoding. We have recently showed that when actively dividing (not in G1) yeast are exposed to a uniform pheromone concentration, they initiate a pheromone-induced polarization next to the mother–daughter cytokinesis site. Then, they reorient their growth to the intrinsic polarity site. Here, to study if Ste2 phosphorylation and internalization are involved in this process, we generated receptor variants combining three types of mutated signals for the first time: phosphorylation, ubiquitylation and the NPFX1,2D Sla1-binding motif. We first characterized their effect on endocytosis and found that these processes regulate internalization in a more complex manner than previously shown. Interestingly, we showed that receptor phosphorylation can drive internalization independently of ubiquitylation and the NPFX1,2D motif. When tested in our assays, cells expressing either phosphorylation or endocytosis-deficient receptors were able to switch away from the cytokinesis site to find the intrinsic polarity site as efficiently as their WT counterparts. Thus, we conclude that these processes are not necessary for the reorientation of polarization.Fil: Vasen, Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Dunayevich, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Constantinou, Andreas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; ArgentinaFil: Colman Lerner, Alejandro Ariel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentin
- …
